陸地棉PLDα基因生物信息學分析及CRISPR/Cas9載體的構建

中圖分類號：Q37 文獻標志碼：A 文章編號：1008-4657（2025）02-0001-09

陸地棉（GossypiumHirsutum）是錦葵科、棉屬一年生草本植物，它是我國的一種重要經濟作物，全國各地廣泛分布，是我國輕紡織工業的主要原料。隨著科技發展，通過體細胞胚胎再生培育陸地棉幼苗已成為一種趨勢，而陸地棉體細胞胚胎再生受多種因素影響，如基因型、培養條件、植物激素、外植體類型等[1]。目前陸地棉組織培養存在周期長、條件苛刻、難獲取胚性愈傷組織等問題，極大地限制了陸地棉的育苗效率。如何縮短陸地棉育苗周期、加快體細胞胚胎再生速率已經成為陸地棉生產面臨的主要需要解決的問題。

磷脂酶（Phospholipase）能夠催化磷脂發生水解反應，不同的磷脂酶可水解磷脂的不同位置，分為五種類型；磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶 。磷脂酶D（PhospholipaseD，PLD）是植物體內一種重要的磷脂酶，首次被發現于胡蘿卜和菠菜葉中[3-4]。特異性作用位點為磷脂分子末端的磷酸二酯鍵，將磷酸水解后產生磷脂酸（Phosphatidicacid，PA）。所有的PLD都擁有保守序列（HxKxxxxD），可將含有該保守序列的蛋白歸類于PLD家族［5-7]。PLD 家族有6個亞家族，分別為PLDα、PLDβ、PLDγ、PLDδ、PLDε、PLD[8-9]。研究發現PLD可參與植物干旱脅迫[10-11]、信號轉導[12-13]鹽脅迫[13-14]凍害[15]氣孔關閉[16]、高溫脅迫[17]等。已有的研究表明，磷脂酶 PLD基因在陸地棉體細胞胚胎再生過程中不同階段的表達具有明顯差異，可以初步推測PLD基因在陸地棉體細胞胚胎再生過程中可能會發揮作用。陸地棉已有高效的轉化體系[18]，可通過構建CRISPR/Cas9載體轉化陸地棉來進行更深人的探究。本試驗利用已公布陸地棉PLDα氨基酸序列在陸地棉數據庫中進行比對，得到相似基因，從中篩選出 PLD家族基因，與擬南芥PLD家族基因進行系統進化樹構建并在多個物種中進行比對，進行生物信息學分析。通過擬南芥PLDα1參考序列構建擬南芥CRISPR/Cas9載體。通過陸地棉 P L Dα 基因參考序列，構建陸地棉CRISPR/Cas9載體以及設計引物進行熒光定量qPCR表達分析。此研究一方面可為陸地棉體細胞胚胎再生縮短周期、為陸地棉育苗技術奠定基礎，另一方面也可以對陸地棉生長發育調控機理的研究起到促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為陸地棉新路早33號，CRISPR/Cas9中間載體Cas9-121和最終載體 AtU6-MCS-scaf-fold-AtUBQ-Cas9-pBI121由特色花卉生物育種湖北省工程研究中心提供；DNA提取試劑盒FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit；RNA 提取試劑 AidLab RN53-EASYspin Plus；qPCR 試劑SYBR qPCR SuperMix Plus（High ROX Premixed）；逆轉錄試劑 HiScript II QRTSuperMix for qPCR；高保真PCR試劑Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase，DNA 純化回收試劑盒 TIANGENUniversal DNA P u rificationKit；質粒小量提取試劑盒SolarbioD1100。

1.2生物信息學分析

1.2.1PLD基因家族系統發生樹構建及GhPLDα基因的鑒定

通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢陸地棉、水稻、葡萄、大豆的PLDα 與擬南芥PLD 家族的氨基酸序列。以 GhPLDα1 （gt;NC_053446.1：9083931-9088877 Gossypium Hirsutum isolate 1008001.06chromosome D10，Gossypium_hirsutum_v2.1，whole genome shotgun sequence）氨基酸序列在棉花數據庫Gossypium Resource And Network Database （htp：//grand.cricaas.com.cn/））中進行 Blast，，比對出相似蛋白序列，去除不含（HxKxxxxD）基序的蛋白，將剩余陸地棉中的相似蛋白與上述擬南芥、水稻、葡萄、大豆的相關氨基酸序列一同導人MEGA-X軟件，默認參數進行MUSCLE比對，通過比對結果使用最大似然法默認參數構建系統發生樹，通過PLD基因家族系統發生樹篩選出GhPLDα亞家族基因。

1.2.2GhPLDα基因結構圖構建和理化特性分析

從棉花數據庫中獲取GhPLDα亞家族基因gDNA、CDS序列，使用gsds繪制GhPLDα基因結構圖，在線軟件 Expasy計算其等電點、相對分子質量，在線工具 Softberry（http：//ww.softberry.com/）進行亞細胞定位預測。

1.2.3 GhPLDα亞家族保守序列分析

使用在線軟件 MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對 GhPLDα 氨基酸序列進行保守基序預測，每個Motif出現次數選擇任意次，期望Motif個數選擇10，得到Motif結果，用TBtools軟件進行可視化。

1.3不同組培時期表達量檢測

1.3.1 陸地棉DNA、RNA提取及cDNA合成

使用植物基因組DNA分離試劑盒（Vazyme，DC104）提取陸地棉基因組DNA。將不同組培階段的陸地棉下胚軸研磨成粉，本實驗選用組培時間為 0 d， 4 d， 1 5 d， 3 0 d 的樣品，使用RNA快速提取試劑（Aid-Lab，RN53-EASYspin Plus）提取RNA，紫外分光光度計檢測DNARNA濃度和OD值（260/280和260/230）， 1 % 的瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA完整性。cDNA第一鏈的合成選用諾唯贊逆轉錄試劑盒（HiS-criptIQRTSuperMixforqPCR）進行。

1.3.2GhPLDα1實時熒光定量PCR

通過GhPLDα1基因CDS序列，使用oligo7軟件手動設計qPCR引物（表1），使用NovoStart的SYBR qPCR SuperMix Plus（High ROX Premixed）進行實時熒光定量PCR，以BUI為內參基因，探究組培

時間 陸地棉下胚軸中PLDα1的表達量。

1.4 CRISPR/Cas9載體構建

1.4.1sgRNA 的設計

使用在線工具 CRISPR-P（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/），根據 NCBI已報導基因序列，分別設計擬南芥PLDα1和陸地棉PLDα1的 sgRNA，二者均設計兩條 sgRNA。sgRNA在基因上的對應位點應盡量靠近起始密碼子且應位于CDS區域，當sgRNA序列的5'端第一個堿基不為G時，需在5'端額外添加一個G。

1.4.2 構建中間載體引物

設計方法為：上游引物序列為（同源臂 1 + s g R N A 1 + g R N A. -scaffold頭部），下游引物序列為（pAtU6-26尾部 + s g R N A2 + 同源臂2）的反向互補序列。引物序列及sgRNA序列見表1。

1.4.3 串連兩個 s g R N A 表達框

使用Solarbio的質粒小量提取試劑盒，從大腸桿菌菌株中提取出中間載體 C a s 9 -1 2 1 。以中間載體為模板，使用構建好的中間載體引物通過Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 進行PCR，陸地棉中間載體引物為GhPLDα1CRP_F和GhPLDα1CRP_R，擬南芥中間載體引物為AtPLDα1CRP_F和 AtPL-Dα1CRP_R（見表1），目的擴增片段如圖1所示。擴增產物使用DNA純化試劑盒進行純化回收，獲得構建好的表達框。

1.4.4表達框插入最終載體

使用 Solarbio 的質粒小量提取試劑盒，從大腸桿菌菌株中提取出最終載體 AtU6-MCS-scaffold-AtUBQ-Cas9-pBI121。使用XhoI和HindIII雙酶切最終載體，酶切產物使用DNA純化試劑盒進行純化，將線性化載體與表達框使用諾唯贊的C112試劑盒進行同源重組法連接，插入位點如圖2所示。

連接結束后轉化大腸桿菌 D H5 α 感受態細胞，過夜培養后進行菌落PCR驗證陽性菌落，引物為AtUBQ-RP和M13R（表1），目的條帶大小應為 9 3 3 b p ，驗證成功后將陽性菌落搖瓶擴大培養，送擎科生物公司測序，測序引物為M13R，確定測序結果與預期序列一致，分別得到含AtPLDα1-Cas9-pB121和GhPLDα1-Cas9-pB121載體的大腸桿菌。提取 AtPLDα1-Cas9-pB121和GhPLDα1-Cas9-pB121載體后，分別轉化至農桿菌GV3101感受態細胞， 保存待用。

2 結果與分析

2.1GhPLD基因家族系統發生樹分析及GhPLDα鑒定結果系統發生樹如圖3所示。

由圖3可知，通過Blast共發現50個相似基因，GhPLD家族成員為34個，分為 α ， β ， γ ， δ ， ε ， ζ 6 個亞家族，GhPLDα 亞家族有8個成員，分別為Gh_D10G078600.1、Gh_A10G062800.3、Gh_A06G215400.1、Gh_D06G222600.1、Gh_A07G031700.1、Gh_D07G033100.1、Gh_D05G057400.1、Gh_A05G043300.1，其中Gh_D10G078600基因與NCBI中所查詢到的GhPLDα1基因序列經比對，可認定為同一基因。將GhPL-Dα的八個成員根據序列相似性進行命名，得GhPLDαla、GhPLDα1b、GhPLDα2a、GhPLDα2b、GhPL-Dα3a、GhPLDα3b、GhPLDα3c、GhPLDα3d，具體對應關系如表2所示。

2.2 GhPLDα基因結構圖與理化性質分析

GhPLDα基因結構如圖4所示。

GhPLDα亞家族理化性質見表2，根據預測等電點可判斷GhPLDα亞家族的蛋白均顯酸性。GhPL-Dα 蛋白亞細胞定位預測見表3，表明 G h P L Dα 蛋白主要位于細胞質、過氧化物酶體與細胞質中。

2.3 GhPLDα亞家族保守結構域分析

保守結構域預測結果如圖5所示，得到十個基序（圖6），按可信度依次命名為Motif1＼～10，其中Mo-tif7 涵蓋了C2結構域，Motif4 涵蓋了（HxKxxxxD）基序。

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10. RSMGeRDSEIAMGArQPH 6.1e-102 8 21

圖6中顯示GhPLDα1a＼～3b 的基序完整，而GhPLDα3c 和GhPLDα3d缺失一個Motif4，經過對氨基酸序列的分析，GhPLDα3c和GhPLDα3d在Motif4 缺失區域仍然具有（HxKxxxxD）基序，但由于Motif 的缺失，可能導致這兩種蛋白的功能與其他 亞家族成員相比會發生較大變化。

2.4RNA質量驗證和qPCR結果分析

從陸地棉不同組培時期的下胚軸中提取RNA，經過紫外分光光度計檢測OD值，A260/A230均在2.0左右、A260/A280均在1.8＼～2.0之間，說明RNA純度較好基本無雜質污染。經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖7所示。

由圖7可知，28S與18S條帶清晰且明亮，說明提取所得RNA完整性較高，可滿足后續實驗。qPCR以培養時間0d作為參照，將其相對表達量設為1，與其他培養時間進行比較，獲得圖8結果。

由圖8可發現GhPLDα1在脫分化早期表達量較高，隨著培養時間增長表達量逐漸下降。下胚軸在培養 30d后初生愈傷組織即將轉變為胚性愈傷組織，此時GhPLDα1的表達量基本為零。這可能是Gh-PLDα1的高表達參與了初生愈傷組織的形成過程。

2.5最終載體菌落PCR驗證結果及測序結果擬南芥與陸地棉最終載體菌落PCR結果如圖9、圖10所示。

由圖9、圖10可知，顯示條帶大小均為 1 0 0 0 b p 左右，符合預期大小。

擬南芥與陸地棉最終載體測序結果如圖11、圖12所示。

圖11、圖12顯示序列信息均符合預期，sgRNA序列正確插入最終載體。

3討論

根據PLD都擁有保守序列（HxKxxxD），在陸地棉數據庫中比對得到50個相似基因，篩選出 34個PLD家族基因，將這些基因對應氨基酸序列與擬南芥、水稻、葡萄、大豆的PLDα進行比對，得出陸地棉中存在8個PLDα亞家族基因。對這8個基因進行一系列生物信息學分析，得出GhPLDα均為酸性蛋白質，在亞細胞結構中，GhPLDα主要位于細胞外、過氧化物酶體和細胞質中，這說明GhPLDα在細胞內外均發揮作用。在蛋白保守基序分析中，大部分GhPLDα擁有完整的10個預測保守基序，僅有GhPLDα3c與GhPLDα3d丟失了一個預測基序，可見GhPLDα 在遺傳過程中仍是高度保守的，但如果該預測基序為功能活性區域，則丟失該基序的蛋白與其他GhPLDα蛋白在功能上會產生一定差異。

經過qPCR測定組培時間 0 d， 4 d， 1 5 d， 3 0 d 陸地棉下胚軸中PLDα1的表達量，可明顯看出下胚軸在開始脫分化時PLDα1高效表達，隨著脫分化的進行接近再分化時，PLDα1的表達量逐漸降低直至接近于0，由此推測GhPLDα1促進了棉花下胚軸初生愈傷組織的形成過程。

本實驗以中間載體 C a s 9 -1 2 1 為模板，通過PCR的方式將兩個sgRNA片段串連在一起形成一個表達框，再將完整的表達框插入最終載體中構成CRISPR/Cas9表達載體。CRISPR/Cas9載體正常表達時，會依據兩個sgRNA序列對基因上的兩個位點進行敲除，兩個sgRNA位點之間的基因序列會全部消失，如此敲除后的基因將會縮短。可以在敲除片段的兩側設計引物，對轉化后的植株進行PCR驗證，敲除后PCR片段應當比敲除前PCR片段短，可由此驗證基因敲除是否成功以及判斷植株是否為純合子。

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Bioinformatics Analysis of Upland Cotton PLD α Gene and Construction of CRISPR/Cas9 Vector

WANG Yongxing ，LANShilei ，CHENG Wenhan

（1.College of Biological Engineering，Jingchu Universityof Technology，Jingmen 448ooo，China； 2.Hubei Engineering Research Center for Specialty Flowers Biological Breeding，Jingmen 448Ooo， China）

Abstract：PLDα belongs tophospholipaseD（PLD）family，and plays a keyrole intheprocess of plant growthanddevelpment，andsignaltransductionundervarioussresss.Inthispaper，uplandcotonwasusedastheresearchmaterial，andhePD genewasanalyzedbybioiformatics methods.TheexpresionofPLDαinthehypocotylsofuplandcotonatdiferenttisseculture stages was examined，andthe CRISPR/Cas9vectors ofPLDα inArabidopsis thaliana and uplandcoton wereconstructed，inorder to promotethesomaticembroregenerationprocesofuplandcotonthrough expressonregulation.Intheexperiment，byaliging thereported PLDαaminoacidsequencesofuplandcotton，thepotentialPLDgene sequences intheuplandcoton wereobtained， andthegenes withhighreliabilitywereselected.The expressionlevelsofthePLDαgene inuplandcoton were analyzed by q -PCR during diferentstages ofsomatic embryogenesis，andthePLDαgene knockoutvectorwasobtainedbyconstructingtheexpression cassete andconnectingitwith theCRISPR/Cas9vector.Theresultsshowed thattherewere34potentialPLDgenefamilymembers inuplandcotonAccordingtoteexpresionanalysisofLDlatfourtimepointsinthehypocotylofuplandcottonduring etissueculture procs，itwasfound thattheexpressionlevelwas hghintheearlystageoftissueculture whenthere werefewercalus， andtheexpresionleveldecreased graduallywiththeextensionoftissueculture timeasthecalusgradually increasedAgrobacteriumcarying the CRISPR/Cas9 knockout vectors for Arabidopsis thaliana PLDαland uplandcoton PLDαl wereobtained through vector construction，which is of great significance for shortening the cotton tissue culture process.

Key words： PLDα；upland cotton； bioinformatics analysis；CRISPR/Cas9

[責任編輯：許立群]