種植模式對(duì)板藍(lán)根內(nèi)生真菌多樣性的影響

0引言

【研究意義】板藍(lán)根，因其抗病毒和抗感染功效在一定程度上受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響[1]，而內(nèi)生真菌對(duì)宿主生長(zhǎng)、發(fā)育等具有較大影響，可以刺激宿主植物發(fā)芽和生長(zhǎng)，并且在調(diào)節(jié)宿主植物養(yǎng)分吸收和增強(qiáng)抗逆性等方面發(fā)揮作用[2-4]。板藍(lán)根主要分為春天和夏天種植。不同季節(jié)的板藍(lán)根種植模式可能會(huì)引起土壤微生物群落的變化，從而影響板藍(lán)根的生長(zhǎng)和藥效[5。因此，研究板藍(lán)根的種植模式對(duì)其內(nèi)生真菌群落的影響，對(duì)提高板藍(lán)根的產(chǎn)量和藥效具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】板藍(lán)根生長(zhǎng)與土壤中微生物群落密切相關(guān)。常規(guī)耕作和化肥施用可能導(dǎo)致土壤微生物的失衡，從而影響板藍(lán)根的生長(zhǎng)和藥效[1.6-7]。牟燕等[5]對(duì)南板藍(lán)根（Baphicacanthus cusia（Nees）Bre-mek.）的不同部位分離純化并鑒定出的23株內(nèi)生真菌均屬于子囊菌門，分為3綱7目9科11屬23種；對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑制作用。【本研究切入點(diǎn)】作物播種和種植時(shí)間長(zhǎng)短的不同，可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)生菌和根際微生物的變化。目前，板藍(lán)根內(nèi)生菌及根際微生物研究鮮見報(bào)道。需研究不同季節(jié)板藍(lán)根種植模式下內(nèi)生真菌群落的動(dòng)態(tài)變化。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集新疆1年春季種植（SPS1）、2年春季連作種植（SPS2）以及1年夏季種植（SUS）板藍(lán)根的不同種植模式的板藍(lán)根根系，測(cè)序根系內(nèi)生真菌進(jìn)行高通量，揭示不同的種植模式會(huì)引起內(nèi)生真菌的群落的種類及結(jié)構(gòu)變化，探究春季和夏季種植對(duì)板藍(lán)根內(nèi)生真菌的影響，為板藍(lán)根高產(chǎn)栽培提供研究依據(jù)。

材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)設(shè)在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站。以南北方向種植板藍(lán)根，行距 2 0 c m ，株距13cm，每個(gè)處理板藍(lán)根面積各 。在2023年選擇一年春季種植（SPS）、夏季種植（SUS）和連續(xù)2年春季種植（SPS2）3個(gè)處理開展試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)。SPS2：板藍(lán)根播種時(shí)間為2022年4月15日，收獲時(shí)間為10月18日，第2年播種時(shí)間為2023年4月18日，收獲時(shí)間為10月23日。SPS：板藍(lán)根播種時(shí)間為2023年4月18日，收獲時(shí)間為10月23日。SUS：板藍(lán)根播種時(shí)間為2023年7月22日，收獲時(shí)間為10月23日。各處理基肥和農(nóng)家肥及栽培管理?xiàng)l件一致。在板藍(lán)根收獲期進(jìn)行土壤取樣。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6個(gè)點(diǎn)采集 0 ～ 2 0 c m 土樣；每個(gè)處理同時(shí)采集5株板藍(lán)根，選擇粗度為 根系取樣。采集后立即將土壤和根系樣品放在冰上運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，土樣均過 2 m m 的篩后 下儲(chǔ)存，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。根系樣品 下儲(chǔ)存，用于根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)組成測(cè)定。

1.2 方法

1. 2. 1 內(nèi)生真菌DNA的提取與純化

將板藍(lán)根根系在液氮中磨成粉末，稱取 0 . 3 g 使用MoBioPowerSoilDNA分離試劑盒（MoBioLaboratories，美國(guó)進(jìn)行DNA提取。DNA濃度通過NanoDropND-2000c紫外-可見分光光度計(jì)（NanoDropTechnologies，美國(guó)特拉華州威明頓）進(jìn)

行測(cè)量。

1.2.2 內(nèi)生真菌測(cè)序

使用PCR擴(kuò)增基因組DNA。使用引物對(duì)ITS1，ITS4擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體積為 ，包括1 . 0 μ L 模板DNA， 0 . 5 μ L 前向和反向引物（16p m o lν μ L ）， 1 0 μ L PCRSuperMix（TransGenBiotechCo.，中國(guó)），以及 8 . 0 μ L 無菌水。擴(kuò)增在熱循環(huán)儀（Bio-Rad，美國(guó)）上進(jìn)行，使用條件： 3 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 （ 延伸，然后 。擴(kuò)增后，純化的PCR產(chǎn)物按摩爾比混合，以獲得定量的樣品DNA文庫(kù)。測(cè)序使用IlluminaMiSeq平臺(tái)。原始序列經(jīng)過解復(fù)用，并使用QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology2（QIIME2）工具包進(jìn)行質(zhì)量過濾。在合并之前，reads末端被修剪，以確保核苷酸質(zhì)量得分 gt; 3 0 ，并將期望誤差（se）的最大值設(shè)置為0.5以進(jìn)行合并reads的過濾序列經(jīng)過質(zhì)量過濾，并根據(jù)DADA2流程在 100 % 的相似性水平上分成操作分類單元（ASVs）。真菌分類使用U-NITE（release8.O）真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)適配。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均在R（版本4.2.0）中進(jìn)行。使用單因素方差分析（ANOVA），并使用最小顯著性差異（LSD）比較每個(gè)變量的均值（ α = 0 . 0 5 ）測(cè)試3種不同模式之間的土壤理化參數(shù)和微生物多樣性差異。使用Bray-Curtis不相似性進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），并通過‘Vegan’包中的adonis進(jìn)行置換多元方差分析（PERMANOVA）確定3種種植模式對(duì)根內(nèi)真菌群落的影響。使用‘Vegan’包進(jìn)行了冗余分析（RDA）。只選擇與RDA模型顯著相關(guān)的環(huán)境變量（ P lt; 0 . 0 5 ， 9 9 9 次置換），使用“funguild”進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植模式對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明，與SUS相比，SPS降低了土壤pH值，提高了土壤TN（水體中總氮）的含量。SPS和SPS2同時(shí)顯著提高了土壤Nmin（土壤無機(jī)氮）和TN含量。此外，SPS2顯著提高了土壤AP（土壤速效磷），卻降低了土壤AK（土壤速效鉀）含量。土壤SOC（土壤有機(jī)質(zhì)），TP（全磷），以及TK（全鉀）含量未受到種植模式的顯著影響。表1

2.2 種植模式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

研究表明，種植模式顯著影響了根際內(nèi)生真菌的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)。對(duì)于微生物 多樣性，盡管真菌Shannon多樣性指數(shù)并未受到種植模式的顯著影響，但是真菌豐富度顯著受到種植模式的影響，與SUS相比，SPS以及SPS2顯著降低了真菌豐富度。對(duì)于微生物 β 多樣性，種植模式顯著改變了真菌的群落結(jié)構(gòu)，3種種植模式的微生物群落顯著區(qū)分（ ， ）。根內(nèi)微生物在門水平上主要由As-comycota、MortierellomycotaBasidiomycotaChytrid-iomycota OlpidiomycotaBlastocladiomycota Glomer-omycota、Rozellomycota 和Mucoromycota組成。與SUS相比，SPS2顯著增加了土壤Ascomycota和Chytridiomycota的豐度，顯著降低了Mortierellomy-cota的豐度。與SUS相比，SPS顯著降低了Neonectria以及Penicillium的相對(duì)豐度但是卻提高了Oedocephalum的相對(duì)豐度，SPS2顯著降低了Mor-tierella的相對(duì)豐度，但是卻提高了Fusarium、As-pergillus、Acremonium、Gibberella 以及 Bisifusarium物種的相對(duì)豐度。與SPS相比，SPS2顯著降低了Mortierella和Plectosphaerella的相對(duì)豐度，但是卻提高了Fusarium Acremonium和Neonectria的相對(duì)豐度。微生物網(wǎng)絡(luò)圖顯示種植模式顯著影響了微生物網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)量，邊數(shù)量以及平均度均受到種植模式的影響，春季種植顯著降低了微生物網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度。

值（ ， P = 0 . 0 0 2 ） 0.64， ）、 A P （ ， ）、AK（ ， ）以及TN（ ， ）顯著影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。在門水平上，Ascomycota的相對(duì)豐度與土壤 N m i n ， A P 、TN含量呈顯著正相關(guān)，與TP顯著負(fù)相關(guān)。與之相反，Mortierellomycota的相對(duì)豐度與 N m i n， A P ， T N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與TP呈顯著正相關(guān)。此外，Mortierellomycota的相對(duì)豐度還與AK顯著正相關(guān)。Chytridiomycota的相對(duì)豐度與 以及TN含量呈顯著負(fù)相關(guān)，在屬水平上，Mortierella相對(duì)豐度與 Δ p H 值、AP含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與AK、TP含量顯著正相關(guān)。Fusarium相對(duì)豐度與Nmin、AP、TN含量呈顯著正相關(guān)。Plectosphaerellas的相對(duì)豐度與 Δ p H 值呈顯著負(fù)相關(guān)，而與AK含量呈顯著正相關(guān)。Coprinellus的相對(duì)豐度與AP呈顯著正相關(guān)。圖5

3討論

3.1新疆春夏兩季水熱氣候差異顯著，新疆春天氣溫回升，但是較為干旱，夏季雖然溫度較高，但是晝夜溫差大[8-9]。水分以及溫度被認(rèn)為是影響微生物群落結(jié)構(gòu)差異的重要因素[10-1]。另一方面，氣候上的差異使得農(nóng)業(yè)管理措施，例如灌水，施肥等，差異顯著[12-13]。降水，施肥等可以影響土壤理化性質(zhì)，例如 Δ p H 值，有效磷等，從而影響微生物群落結(jié)構(gòu)。此外，氣候差異以及管理措施的差異會(huì)影響到植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[12]。春季和夏季植物生長(zhǎng)的生理和生態(tài)需求也不同。春季是植物生長(zhǎng)的起始階段，對(duì)養(yǎng)分和水分的需求較大。而夏季則是植物生長(zhǎng)的高峰期，植物可能需要更多的養(yǎng)分支持生長(zhǎng)。不同季節(jié)植物的生長(zhǎng)狀況和養(yǎng)分需求變化，會(huì)引起土壤中微生物對(duì)養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)和利用方式的變化，從而影響微生物群落的結(jié)構(gòu)[2，14]。研究表明，溫度和水分是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的功能的重要因素。

3.2研究中還發(fā)現(xiàn)與夏季種植相比，春季播種降低了土壤pH值。土壤pH值的降低可能與過多的施肥以及灌水有關(guān)。板藍(lán)根春天種植，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，需要多次施肥以滿足其生長(zhǎng)發(fā)育的需求。過多的氮肥施用會(huì)導(dǎo)致土壤酸化。與春季種植相比，夏季種植顯著降低了土壤無機(jī)氮，速效磷以及全氮等養(yǎng)分。夏季是植物生長(zhǎng)的高峰期，植物對(duì)養(yǎng)分的需求相對(duì)較大，包括氮、磷等養(yǎng)分。當(dāng)植物生長(zhǎng)迅猛時(shí)，會(huì)大量吸收土壤中的無機(jī)氮和有效磷，用于生長(zhǎng)和代謝過程，導(dǎo)致土壤中這些養(yǎng)分的含量降低[16]。此外，夏季通常伴隨著較多的降雨和灌溉，可能導(dǎo)致土壤中的無機(jī)氮和磷被沖刷出土壤，發(fā)生淋洗和流失的過程[15，17]。這種流失現(xiàn)象可能導(dǎo)致土壤中的養(yǎng)分含量減少。土壤養(yǎng)分含量的差異導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步變化[14]

3.3相比與夏季種植，春季種植顯著降低了Neonectria以及Penicillium的相對(duì)豐度，提高了Oedocephalum的相對(duì)豐度。Penicillium（青霉屬）能夠產(chǎn)生赤霉酮。赤霉酮是植物激素的一類，對(duì)植物的種子萌發(fā)、莖伸長(zhǎng)和開花等生理過程起著關(guān)鍵作用[18]。Neonectria 和Oedocephalum被鑒定為真菌病原菌，能夠?qū)е伦魑锂a(chǎn)量的下降。春季連續(xù)2年種植顯著富集了Fusarium和Acremoni-um，物種的相對(duì)豐度，降低了Mortierella的相對(duì)豐度。Fusarium是一種廣泛存在的植物病原菌，能夠?qū)е轮参锔。瑢?duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。Acremonium可能引起植物的病害，例如枯萎病等。Mortierella物種是一些重要的腐生真菌，能夠分解有機(jī)物質(zhì)，釋放出養(yǎng)分供植物吸收。此外，一些Mortierella菌株被發(fā)現(xiàn)對(duì)一些植物病原菌具有抑制作用。Mortierella屬中的一些物種可以與植物形成菌根共生關(guān)系，這種關(guān)系對(duì)植物的生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收有積極影響。

4結(jié)論

不同種植模對(duì)土壤理化性質(zhì)以及微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。與夏季種植相比，春季種植降低了土壤pH值，但是卻提高了土壤速效養(yǎng)分。土壤理化性質(zhì)的變化，尤其是pH值、 N m i n . A P 、AK以及TN，進(jìn)一步引起了根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。春節(jié)種植顯著降低了真菌豐富度。此外，春季種植還降低了Penicillium以及Mortierella相對(duì)豐度的提高，但是卻富集了Fusarium和Acre-monium等多種病原菌。春季種植模式顯著降低了微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，增加了微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，降低了合作關(guān)系。

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Effects of planting pattern on the diversity of fungi in Isatidis Radix

CHEN Yong1 ，SONG Suqin2， LIN Caixia3，QIAO Xu4

（1. Institute of Soil， Fertilizer and Agricultural Water Conservation， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences ，Urumqi 830091，China; 2. ;Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern Oasis，Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Xinjiang Key Laboratory of Agricultural Bio-safety， Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 83O091，China;3. Agricultural Technology Extension Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830O11，China;4. Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine/ Ministry of Education National Enginering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Collge，Beijing 1Oo193，China）

Abstract：【Objective】Endophytic fungi have a significant impact on thephysiology，development and health of the host，can stimulate the germination and growth of the host plant，and play an important role in regulating the nutrient absorptionand enhancing the stressresistanceof the host plant.This study aims to reveal the effects of different planting patterns of one-year spring planting（SPS1），two-year spring continuous planting （SPS2）and one-year summer planting （SUS）on the fungal community structure of Isatidis root in Xinjiang.【Methods】High throughput sequencing technology was used to identify and analyze endophytic fungi community structureof Radix isatidis root.【Results】At the phylum level，endorhizoidal fungi were mainlycomposedof Ascomycota，Mortierelomycota，Basidiomycota， Chytridiomycota，Olpidiomycota，Blastocladiomycota，Glomeromycota，Rozelomycota and Mucoromycota. Compared with SUS， SPS1 decreased the relative abundance of Neonectria and Penicillum significantly，but increased the relative abundance of Oedocephalum.SPS2 increased the abundences of Ascomycotaand Chytridiomycota significantly，but significantly decreased the abundences of Mortierellmycota.However，it increased the relative abundance of Fusarium，Aspergillus，Acremonium， Gibberell and Bisifusarium. Compared with SPS1，SPS2 decreased the relative abundations of MortierellaandPlectosphaerella significantly，but increased therelativeabundancesof Fusarium， Acremonium and Neonectria.【Conclusion】The population structure of endophytic fungi in isatidis root is differentunder different planting patterns.Continuous planting would decrease the abundance of beneficial fungi and increase the relative abundance of pathogenic fungi and increase the risk of continuous cropping obstacles.

Key words：Isatidis Radix ； diferent planting patterns; high -throughput sequencing；endophytic fungus diversity ; community composition