適用于玉米螟蟲蛻DNA 提取方法的篩選與驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：S436.41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2025）02-0379-07

0 引言

【研究意義】玉米螟俗稱玉米鉆心蟲、箭桿蟲[]，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，世代重疊，除為害玉米外，還為害高梁、谷子、蠶豆、菜豆等多種農(nóng)作物[2-5] 。目前在全球主要有歐洲玉米螟Ostrinianubilalis（Hubern）（Europeancornborer，ECB）和亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis （Guenee）（Asian corn borer，ACB）為害玉米。亞洲玉米螟主要分布于東亞、東南亞和西太平洋島嶼附近[6]。歐洲玉米螟主要分布于歐洲、北美洲、北非和西亞[7]，中國(guó)新疆伊犁河谷地區(qū)是亞洲玉米螟和歐洲玉米螟的混生區(qū)[8-9]。利用形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確分類鑒定亞洲玉米螟與歐洲玉米螟難度較大，線粒體基因近年用作分類鑒定的輔助手段，COI基因是線粒體基因中應(yīng)用最為廣泛的基因，同時(shí)COI基因常被用于分析親緣關(guān)系較為密切的種、亞種及地理種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但DNA提取是運(yùn)用該技術(shù)的必要前提[10-12]。因此以玉米螟末齡幼蟲的蟲蛻為材料，不損傷蟲體，通過比較分析不同方法提取玉米螟蟲蛻效果，篩選出適用于玉米螟提取蟲蛻DNA方法，對(duì)后續(xù)亞歐玉米螟物種分離鑒定及分子試驗(yàn)相關(guān)研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鄭美艷等[13利用斜紋夜蛾、二點(diǎn)委夜蛾、小菜蛾末齡幼蟲蟲蛻和蛹?xì)ぬ崛NA用于昆蟲基因功能的單對(duì)交配策略相關(guān)研究。對(duì)于與斜紋夜蛾和二點(diǎn)委夜蛾相近或更大的昆蟲，可以利用單頭末齡幼蟲蛻或蛹?xì)ぬ崛』蚪MDNA，均較準(zhǔn)確。劉文彬等[14利用搖蚊蛹期蛻皮提取DNA用于不同蟲態(tài)配套、近緣種區(qū)分等相關(guān)研究，提供了質(zhì)量高、純度大的搖蚊科蛹期蛻皮痕量DNA方法。【本研究切入點(diǎn)】利用末齡蟲蛻提取DNA，是一種可以被應(yīng)用于無(wú)損傷提取鱗翅目幼蟲的方法，需通過提取玉米螟老熟幼蟲蟲蛻基因組DNA（gDNA），從而建立一套應(yīng)用于鱗翅目昆蟲玉米螟的無(wú)形態(tài)特征損傷、經(jīng)濟(jì)適用、操作簡(jiǎn)單和提取質(zhì)量高方法，不影響試驗(yàn)蟲體正常生長(zhǎng)發(fā)育，且得率高的一種gDNA提取方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以玉米螟蟲蛻為材料，改進(jìn)試驗(yàn)室常規(guī)提取DNA方法，篩選一種經(jīng)濟(jì)適用、操作簡(jiǎn)單、快速且能滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增能力的基因組DNA提取方法，以滿足無(wú)損傷提取蟲蛻DNA準(zhǔn)確獲得歐洲玉米螟室內(nèi)種群的目的。

一 材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 蟲蛻獲得

供試玉米螟蟲源為2022年3月上旬采自新疆伊犁哈薩克自治州新源縣塔勒德鎮(zhèn)（ 的越冬代老熟幼蟲，單頭放置于 1 . 5 m L 離心管中，室內(nèi)補(bǔ)水解除滯育，放置于 、相對(duì)濕度 R H= 7 5 % ± 5 % 、光周期 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，待其化蛹，于室內(nèi)使用人工飼料飼養(yǎng)[15]。取 內(nèi)玉米螟末齡幼蟲化蛹前的蟲蛻。圖1

1.1.2 儀器與設(shè)備

精密移液槍（德國(guó)Eppendorf）；Sorvall ST16ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾）；迷你離心機(jī)（Cubee）; H H- S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）； T C- 9 6 / G/ H（ b） （ C熒光定量PCR擴(kuò)增儀（杭州博日科技股份有限公司）；DYY-6D型電泳儀（北京市六一生物科技有限公司）；Dolphin-DocPlus凝膠成像儀（美國(guó)Wealtec公司）；超微量分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.1.3試劑

DNAisoReagent購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；乙二胺四乙酸鈉（EDTA-2Na）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、（Tris-HCI）購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)于普博欣生物工程有限公司；Nonidet 緩沖液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿、 ?β -巰基乙醇（β-Mercaptoethanol）硅膠模離心吸附柱購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Taq酶、RNA酶、蛋白酶 PCR master-MixII、DL2OOOPlusDNAMarker購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司;引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

（1）提取液a：采用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA提取DNAisoReagent試劑盒提取液。

（2）提取液b：Tris（ p H= 8 . 0 ）， 5 0 μ L ;0.5MEDTA ， Nonidet P- 4 0 ， 5 0 μ L; 2 0 m g/ mL 蛋白 補(bǔ)至 1 0 m L 。

（3）提取液c：CTAB， EDTA， 6 m L ： 1PVP， 巰基乙醇 補(bǔ)至100m L 。

（4）提取液d：清水。

（5）洗脫液：10mmol/LTris和1mmol/LED-TA （ ）。

1.2 方法

1.2. 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將3種提取玉米螟蟲蛻基因組DNA方法步驟與提取液a ?? b?? c? d 重新組合，細(xì)胞壁的破碎采

用滅菌后的配套研缽進(jìn)行充分研磨。表1

1.2.2 基因組DNA的提取方法

使用DNAiso Reagent 試劑盒法（KM）[16]、蛋白酶法（PM）[17]、Cetyltrimethylammonium Bromide

（CM）[13.18]，3 種方法提取玉米螟蟲蛻基因組DNA，細(xì)胞壁的破碎采用滅菌后的配套研缽充分研磨。表2

1.2.3 DNA純度和濃度檢測(cè)

改進(jìn)常規(guī)提取方法，提取蟲蛻DNA，使用微量分光光度計(jì)，以 作為空白對(duì)照，進(jìn)行檢測(cè)。讀取所測(cè)定DNA質(zhì)量濃度（ n g / μ L ）和純度（ ）[19]。利用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和顯著性分析。

1.2.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

3種方法共使用96頭蟲體和96個(gè)蟲蛻為提取樣本，各步驟分別對(duì)32頭蟲體、32個(gè)蟲蛻進(jìn)行提取，每種步驟分別使用不同提取液對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行提取，8個(gè)樣本互為生物學(xué)重復(fù)，技術(shù)重復(fù)3次。使用引物GU093522.1，上游引物5’-GCT-

CAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物5’ -TAAACTTC TGGATGTCCAAAAAATCA -3’，擴(kuò)增玉米螟mt COI，反應(yīng)體系 5 0 μ L ，其中DNA模板 2 . 4 μ L ，上下游引物各 PCRmaster Mix 2 5 μ L 。PCR程序?yàn)椋? 預(yù)變性5 變性20s， 5 2 % 退火 3 0 s ， 7 2 c 延伸1 個(gè)循環(huán)，最后 延伸 。取 5 μ L 產(chǎn)物在 1 % 的瓊脂糖凝膠， 1 0 0 V 電泳分離35 。在Dolphin-DocPlus凝膠成像儀檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取DNA濃度和純度檢測(cè)比較

研究表明，不同方法所提取DNA濃度和純度存在顯著性差異。DNA提取濃度最高是PM與提取液b組合 ） n g / μ L ，濃度最低是KM與提取液 c 組合 ） n g / μ L 。利用KM與提取液c組合提取的DNA純度最高（ ，純度最低為PM與提取液 b 組合（ 。KM與提取液c組合所提取的蟲蛻得率最高，且可以獲得純度較好的基因組DNA，PM與提取液b組合所提取蟲蛻所得的DNA濃度最高，但得率不高。2種方法可適用于玉米螟蟲蛻DNA的有效提取。表3

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

研究表明，KM中蟲體PCR擴(kuò)增成功24頭，蟲蛻PCR擴(kuò)增成功為8頭；PM中蟲體PCR擴(kuò)增成功8頭，蟲蛻PCR擴(kuò)增成功為8頭；CM中蟲體PCR擴(kuò)增成功9頭，蟲蛻PCR擴(kuò)增成功為0頭。以提取的蟲蛻gDNA做模板，僅KM中處理3、PM中處理6可得到單一、明顯的條帶，且大小與預(yù)期目的片段一致。處理3電泳條帶最明亮清晰，提取的DNA完整性較高，且濃度較純。處理6蟲蛻電泳條帶較暗，PM提取DNA濃度雖高，但質(zhì)量不穩(wěn)定，得率不高。CM中9-12處理經(jīng)多次嘗試未能擴(kuò)增出預(yù)期片段。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果。圖2，表4

注：M為DL2000DNAmarker，數(shù)字1＼～8為樣本蟲蛻 Notes：M representsDL2OOO DNAmarker，Numbers1-8 indicatethe molt of the specimen

3討論

鄭美艷利用試劑盒法對(duì)小菜蛾末齡幼蟲蛻和蛹?xì)ぬ崛DNA，由于小菜蛾末齡幼蟲蛻和蛹?xì)ぬ?，DNA濃度太低，PCR擴(kuò)增失敗。但是試驗(yàn)利用PM提取蟲蛻的DNA濃度最高，為（ 2 3 . 0 3 ± 0 . 0 1 ） n g / μ L ，其純度不高，有較模糊的條帶，可能是雜質(zhì)較多RNA未除凈，對(duì)DNA模板的干擾嚴(yán)重，不利于后續(xù)PCR擴(kuò)增。CM中處理11，可以提取出玉米螟蟲體DNA、但無(wú)條帶顯現(xiàn)，且均有不同程度的彌散，表明該法提取的DNA中可能含有未被除掉的蛋白質(zhì)，和一些其它的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有粘黏性，易跟DNA結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致DNA完整性不好。與前人結(jié)果存在一定差異。PM整體耗時(shí) 4 0 m i n ，用時(shí)最短，在需快速獲得DNA并對(duì)DNA質(zhì)量要求不高的情況下可選擇此法。處理3提取蟲蛻的DNA濃度平均值為 （ 8 . 4 6 ± 0 . 2 2 ） n g / μ L ，符合提取要求，純度較高為1.86，能提取到滿足普通PCR擴(kuò)增要求的較高質(zhì)量DNA樣本，而且該提取方法穩(wěn)定高效。研究?jī)H提取了玉米螟老熟幼蟲蟲蛻，對(duì)玉米螟蛹蛻和其他鱗翅目大小相近的昆蟲尚未進(jìn)行試驗(yàn)嘗試，因此，后續(xù)有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

滿足蟲蛻COI分子標(biāo)記的擴(kuò)增需求僅有處理3和處理6。處理3可用于玉米螟蟲蛻的DNA提取，即使用試劑盒法的步驟搭配c提取液，該方法對(duì)樣本無(wú)損傷、成本低、步驟簡(jiǎn)單，可滿足后續(xù)玉米螟物種鑒定及玉米螟分子試驗(yàn)研究的相關(guān)需求。

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Screening and verification of DNA extraction methods suitable for corn borer molting

SUN Jianbo1，2 ，DING Xinhua2 ，JIA Zunzun2，GAO Guowen1，2， FU Kaiyun2，Tuerxun Ahemaiti2，Anniwaer Kuerban1，GUO Wenchao2 （1. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 83O052， China; 2. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis， Ministryof Agriculture and Rural Affairs / Xinjiang Key Laboratory of Agricultural Biosafety/Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy ofAgricultural Sciences， Urumqi ，China）

Abstract：【Objective】 Ostrinia furnacalis is the main pest that causes maize yield reduction in Xinjiang. Ostrinia nubilalis（Hubern）and Ostrinia furnacalis （Guenee）are sister species that are dificult to be identified by morphology.The Yili River Valley in Xinjiang is a mixed occurrence area of the Eurasian corn borer， so it is very important to carryout accurate isolationand identification ofthe Eurasian corn borer in this area. a non-destructive extraction method forthe corn borer willbe used to eficiently establish a pure line population，which is very important for the later biological ecology research.【Methods】The purpose of this paper is to establish a DNA extraction method without morphological damage，economical，simple，rapid and can met the subsequent PCR amplification detection technology. Based on the common DNA extraction methods such as screening kit method （KM），protease method（PM and CTAB method（CM），the DNA extraction，target C O I （20 sequence amplification and agarose gel detection of cor borer molt were carried out.【Results】The screening results showed that the effective extraction method for the molt was treatment 3：protease method.The DNA concentration of the molt extracted by the protease method was the highest，which was （ ）ng/ μ L ，but its purity was not high，which was not conducive to subsequent PCR amplification. The average concentration of DNA extracted by treatment 3 was （ 8 . 4 6 ± 0 . 2 2 ） n g / μ L ， meeting the extraction requirements， and the purity was 1.86，meeting the subsequent PCR amplification experiment.【Conclusion】 The treatment 3 and protease method mentioned in this paper can be used to extract gDNA from corn borer molt in large quantities，and at the same time to cary out population identification and subsequent experimental research. Both of them have the advantages of no damage to corn borer，low cost，simple steps，avoiding the harm of chloroform and isopropanol to human body，and it has higher amplification efciency than the protease method.

Key words：corn borer;larval exuviate；DNA extraction; kit method;protease method