綜合生理學和轉錄組學揭示外源5-氨基乙酰丙酸調節‘德欽'紫花首蓿耐熱性的分子機制

Abstract： In order to reveal the molecular mechanism of exogenous 5-aminolevulinic acid（ALA） regulating Medicago satiua‘Deqin’and provide theoretical basis for heat-resistant breeding，alfalfa leaves with the same growth at for 35 days of seedling age were treated with different concentrations of ALA to screen the optimal concentration of ALA which could aleviate high temperature stress in this study. The leaves separately treated with room temperature without ALA（CK）， high temperature stress without ALA（Heat），sprayed with ALA and cultured at room temperature or under high temperature stress （ALA or HA） were determined physiological indexes and performed transcriptomic sequencing and bioinformatics analysis.The results showed that ALA improved the physiological indexes of alfalfa under high temperature stress at seedling stage，and the relief effect was the best.The differentially expressed genes（DEGs）among the samples were screened，and 27O DEGs were estimated to be potential genes related to the regulation of exogenous ALA in leaf response to high temperature stress.The results of GO and KEGG enrichment and coexpression trends of DEGs indicated that exogenous ALA mainly involved in key genes mediating two pathways，phenylpropanoid biosynthesis and phytohormone signaling，in response to high-temperature stress.This study provided a basis for the mining of heat-resistant genes in alfalfa and laid a theoretical foundation for molecular breeding in the future.

Key words：Medicago satiua； Exogenous ALA；Heat resistance；Phenylpropanoids；Plant hormone

紫花苜蓿（Medicagosatiua）素有“牧草之王\"的美譽，因其產量高、營養品質優等特點[1-3]，具有極高的飼喂價值、經濟價值和生態價值[4-6]。紫花苜蓿是溫帶牧草，主要在我國北方種植，南方地區也正逐步擴大種植規模[。隨著全球氣候變暖，高溫脅迫已成為限制植物正常生長發育的主要環境因素[8]。溫度高于最佳生長條件 將引起植物熱休克或熱應激[9]。當溫度升高且超過紫花苜蓿適宜生長的日平均氣溫 時，尤其最高氣溫持續超過 ，紫花苜蓿則會受到高溫脅迫，顯著影響它的形態、生理和蛋白質組學過程[10-12]。逐年升高的高溫氣候影響了紫花苜蓿的正常生長，更嚴重限制了紫花苜蓿的生產利用[7。因此，研究紫花苜蓿的耐熱性機制以提高其耐熱性，從而提高苜蓿生產力具有重要的科學意義和現實意義。

5-氨基乙酰丙酸對于緩解植物的逆境脅迫具有重要作用[13]，但相關機制的研究值得進一步探討。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，ALA）是生物界所有四吡咯化合物的共同合成前體14，在許多已知的激素、調節因子或小信號分子中，ALA被認為是植物的關鍵調節器，對人類和牲畜沒有毒害作用，因此，在植物適應非生物脅迫的研究中被廣泛應用[15-16]。ALA可作為響應逆境脅迫的正調控因子，從而提高植物的抗旱性和耐鹽性[17-18]。外源ALA可以誘導葉綠素合成，并促進psbA和psbD的表達，提高光系統II反應中心活性，從而緩解干旱脅迫對小麥（Triticumaestiuum）幼苗的傷害[19]。ALA處理通過提高垂穗披堿草（Elymusnutans）和大豆（Glycinemax）中SOD、APX、GR、CAT、血紅素加氧酶-1（HO-1）活性，從而增強植物的耐冷性[20-21]。在熱脅迫下，使用ALA處理可提高高羊茅（Festucaarundinacea）的光合能力，減少與抗氧化酶活性相關的氧化損傷[22]。Zhang等[23]研究發現，在高溫脅迫下用外源ALA預處理黃瓜（Cucumissati-Uus）幼苗，可提高其葉片中的抗氧化酶活性，減少ROS的積累，進而增強了幼苗的耐熱性。弱光脅迫下ALA處理可提高高羊茅對弱光脅迫的適應能力[24]。外源ALA能提高植物的抗逆性[25]，但現有研究主要集中在蔬菜、瓜果、花卉等園藝作物上。但是，外源ALA在紫花苜蓿的耐熱性提升上的應用研究報道較少。李宛宣等2研究發現，噴施ALA調節植物的生理過程，從而提高紫花苜蓿的抗熱性。然而，外源ALA調控紫花苜蓿耐熱性的分子機制和一些重要的高溫脅迫響應基因尚不清楚，制約了對其耐熱高產的遺傳改良。

近10年來，隨著高通量測序技術的迅速發展，其成本不斷下降，越來越多的研究人員對植物進行測序并通過生物信息學分析篩選到重要的基因與信號通路，為相關的抗逆境育種工作提供了更加有效的方案[27]。李納鉀[28]在低溫弱光脅迫下使用外源ALA對煙草（Nicotianatabacum）幼苗處理，發現了影響谷胱甘肽代謝途徑的重要基因。本研究對紫花苜蓿苗期采用不同方式的處理，通過研究外源ALA介導的植株耐熱性的生理和分子機制，篩選出參與兩條途徑的重要基因，豐富紫花苜蓿的耐熱基因資源，有助于了解外源ALA介導紫花苜蓿中高溫脅迫耐受性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 植物生長條件與試驗處理

供試材料為‘德欽'紫花苜蓿（Medicagosatiua‘Deqin'）由云南農業大學畢玉芬教授贈送，當年收獲的種子，存于 避光條件下。苜蓿種子處理條件及其種植方法和試驗I處理參照前期課題組研究方法[29]。待長至 苗齡時，試驗I篩選幼苗緩解高溫脅迫 ，晝/夜， 的最適ALA濃度。試驗II用最適ALA濃度 ，處理設為4組，見表1，表中HA代表高溫脅迫 + ALA處理，數字 分別代表5種ALA濃度，4組處理結束后立即取樣。整個實驗在人工智能氣候箱中進行，每個處理重復3次，取樣時采集幼苗頂芽下第一片真葉，放置于一 冰箱保存，用于各項指標的測定。

1.2 生理指標的測定

根據紫花苜蓿生長表型，對每組處理中有代表性的個體進行拍照，觀察植物葉片形態，測定植株葉片的鮮重和干重，葉綠素含量采用Wassie等11的方法稍作修改。根據制造商的說明，使用PocketPEA植物效率分析儀（Hansatech，英國）對幼苗的中上部成熟葉片進行PSI的光化學效率（Fv/Fm）分析。相對電導率（Relativeconductance，REC）參照Fan等[30]的方法稍作修改，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[31]。抗氧化酶活性中的超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性和過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性分別采用氮藍四唑光化還原法和愈創木酚法測定[32]，過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用過氧化氫氧化法測定[3]。滲透調節物質中的脯氨酸（Proline，Pro）、可溶性蛋白（Solubleprotein，SP）和可溶性糖（Solublesugar，SS）含量分別采用芘三酮-磺基水楊酸法、考馬斯亮藍G-250和比色法測定[33]

1.3隸屬函數值和隸屬度[29]

隸屬函數值計算公式：

式中： X 為紫花苜蓿植物中某一指標的測定值， 為該指標測定值的最小值， 為該指標測定值的最大值；當測定指標與植物耐熱性呈正相關時采用公式（1），當測定指標與植物耐熱性呈負相關時采用公式（2）。

隸屬度

式中： 為指標數量。

1.4轉錄組測序與生物信息學分析

轉錄組RNA樣本分別從試驗II中的CK，ALA，Heat，HA處理的葉片中提取。試驗II中同一處理3次重復的6株紫花苜蓿幼苗的功能葉片混合為一個生物學樣品。根據制造商的程序，采用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取RNA。葉片RNA質量檢測合格后，使用IlluminaNovaSeqTM6OOO（北京諾禾致源科技股份有限公司）進行測序文庫構建和測序。經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得后續分析使用的CleanReads。

利用HISAT2軟件將CleanReads與‘中牧1號’（M.satiua‘ZhongmuNo.1'）基因組[34進行序列比對，使用subread軟件中的featureCounts工具[35]對比對到參考基因組上的Reads進行計數，并采用FPKM值來歸一化基因表達水平[36]，以|log2（FoldChange）|3 1 8 . FDR lt; 0 . 0 5 為篩選條件，獲得處理組間的差異表達基因（DEGs）。使用R軟件中的gplots根據FPKM表達值對DEGs進行層次聚類。最后利用GeneOntology數據庫中找出與整個基因組背景相比，在DEGs中顯著富集的GO條目。為確定紫花苜蓿應答高溫脅迫的代謝途徑，利用KOBAS軟件對DEGs進行KEGGPathway富集分析。

1. 5 差異表達基因的qRT-PCR分析

根據轉錄組測序結果，從植物激素信號轉導途徑和苯內烷類生物合成途徑中，共選擇12個DEGs用于qRT-PCR驗證。將12個DEGs的cDNA序列作為模板，用NCBI在線工具Primer-BLAST設計引物，以MsActin為內參基因，詳細的引物信息如表2所示。qRT-PCR定量反應體系為

FastqPCRMix（SYBRGreen ，上下游引物各 ，cDNA模板 。反應程序為： 預變性 變性 退火 ，

延伸20s，40個循環； 每s升溫0.11。DEGs的相對表達量采用 法計算[37]，并設置3次重復。

1.6 數據處理與分析

用Exce12019計算和整理數據；用SPSS26.0對不同處理的各指標進行單因素方差分析（ P lt; 0.05），用LSD和DunnettT3對各參數平均數進行顯著性檢驗和多重比較；用Origin2019做柱形圖和熱圖；在NovoMagic售后平臺（https：//magic.novogene.com）對轉錄組數據進行進一步的分析和相關繪圖。

2 結果與分析

2.1基于高溫脅迫下紫花苜蓿苗期ALA濃度的 篩選

為篩選紫花苜蓿抗高溫脅迫的外源ALA最適濃度，對紫花苜蓿進行不同濃度的外源ALA處理，測定各項指標的變化，并觀察其表型形態（圖1）。

本研究外源ALA濃度梯度處理對高溫脅迫下苗期葉片的影響表現出濃度效應。與CK相比，Heat處理使其葉片發生了枯萎失綠現象，而HA1～HA5處理下，葉片枯萎失綠程度則降低，HA4處理的失綠程度最小（圖1A）。高溫脅迫抑制植株葉鮮重和葉干重，降低葉綠素含量和抗氧化酶活性，增加REC和MDA含量，而外源ALA的應用顯著改善了這些參數。HA4的植物葉片鮮重干重、葉綠素含量、抗氧化酶活性得到提升，且顯著高于其他濃度處理，顯著降低REC和MDA含量（圖1B）。為了能夠清晰的反映不同濃度ALA處理對植株耐熱性的影響，采用隸屬函數分析所測定的8個指標進行了綜合排名，HA4處理的指標隸屬函數值高于其他處理，隸屬度為0.786，排名第1，說明 ALA處理對紫花首蓿苗期高溫脅迫的緩解效果最佳，其耐熱能力也最強（表3）。

2.2外源ALA對紫花苜蓿幼苗耐熱性緩解作用的檢測

以 ALA為處理條件，對幼苗進行不同處理，測定高溫脅迫下植株苗期各耐熱性生理指標，并觀察在高溫脅迫下外源ALA對植株的影響（圖2）。Heat下幼苗的REC和MDA含量分別增加了 1 5 2 . 8 3 % 和 1 4 8 . 7 6 % ，而HA處理顯著降低了高溫脅迫下的電解質泄露和MDA含量 ，但與CK植株相比差異不顯著。與CK植株相比Heat處理導致苗期葉片的 顯著降低了 8 . 6 4 % ，HA處理的 有所緩解，但差異不顯著。滲透調節物質可作為高溫脅迫緩解的指標，Heat處理葉片的Pro和SP含量均顯著降低（ ，SS含量略微升高，而HA處理下葉片的 ，SP和SS含量均顯著增加 ，但與CK植物相比差異不顯著。

植物會涉及復雜的抗氧化防御系統，為應對非生物脅迫引發的氧化損傷，包括一些功能相關的抗氧化酶。Heat處理下的CAT，SOD，POD活性分別降低了 3 8 . 8 0 % ， 23 . 0 0 % 和 3 5 . 4 8 % ，而HA處理的幼苗中CAT，SOD，POD活性顯著增加 ，但與CK植株差異不顯著。噴施外源ALA后施加高溫脅迫的紫花苜蓿各生理指標有著顯著變化，則外源ALA可提高其耐熱性。

2.3測序數據質量評估

進一步解析外源ALA調控高溫脅迫下植株苗期耐熱性的分子機制，使用IlluminaNovaSeqTM6000測序平臺對4組樣品進行了葉片的轉錄組測序。對測序數據相關信息進行統計，各樣品的GC含量均大于 40 % ，并經過測序質量控制后，共得到

25.69GbCleandata，堿基Q3O的百分比在9 3 . 7 9 % ～ 9 4 . 4 2 % 之間。以紫花苜蓿中牧1號基因組作為參考，將Cleanreads與其序列進行比對，各樣品的比對率均大于 7 5 % （表4）。根據RNA-seq的基因表達值用FPKM對測序深度和基因長度進行了校正和組內及組間樣品的相關性分析，所有樣品中基因表達量的FPKM值表達趨勢一致，呈正態分布，樣品組內相關性大于組間相關性，樣品組間有差異（圖3），表明測序質量較好，所選參考基因組的組裝結果可靠，能滿足后續的數據分析。

2.4不同處理下差異表達基因的鑒定

對不同處理下葉片的DEGs進行兩兩比較分析發現，在‘ALAvsCK，HeatvsCK，HAvsCK，HAvsHeat'4個比較組中，檢測到總的基因中DEGs分別有4802（2112上調，2690下調），6749（3139上調，3610下調），6063（2779上調，3284下調）和4599（2557上調，2342下調）（圖4A）。韋恩圖可以較為直觀地看出各處理比較組DEGs的數量，4個比較組中特有的DEGs個數分別為1699，1429，1261和868個，有270個DEGs是不同處理下所共有的（圖4B），推測這些共有的DEGs是外源ALA調控‘德欽'紫花苜蓿葉片響應高溫脅迫的潛在相關基因。

2.5高溫響應核心DEGs的GO和KEGG富集 分析

將共有的270個DEGs進行GO和KEGG富集分析。GO富集結果（圖5A）表明：不同ALA預處理后植株高溫脅迫共有的葉片DEGs主要富集到生物刺激反應（Responsetobioticstimulus）、防御反應（Defenseresponse）、黃素單核苷酸結合（FMN-binding）、蛋白異源二聚體活（Proteinheterodimerizationactivity）、氧化還原酶活性（Oxidoreductaseactivity）相關的條目，以上富集較多的過程中涉及的DEGs可能參與了外源ALA調控紫花苜蓿高溫脅迫過程。KEGG富集結果（圖5B）表明：共有的270個DEGs涉及的代謝通路中，類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis， ）、苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis， ）、植物晝夜節律（Circadian rhythm-plant，koO4712）、亞油酸代謝（Linoleicacid metabolism，koOO591）和谷胱甘肽代謝（Glutathionemetabolism， 富集程度最高。其中，類黃酮和苯丙烷類生物合成與植物抵抗逆境脅迫的抗氧化酶活性物質如POD活性相關，植物晝夜節律與植物的光合作用有關，亞油酸代謝與植物抗旱相關，谷胱甘肽代謝也是植物體內很好的自由基清除劑和抗氧化劑。結果表明，注釋到這些代謝通路上的基因可能均由外源ALA調控誘導而發生差異，與‘德欽'紫花苜蓿耐熱相關。

2.64個比較組中所有DEGs的共表達趨勢分析

為更深入地了解外源ALA處理對紫花苜蓿高溫脅迫的影響，將4個比較組中所有的11370個DEGs使用主流層次的聚類分析，通過基因FPKM值將其分為4個基因聚類表達模式，并將4個聚類結果進行KEGG通路富集分析（圖6）。結果顯示，4個不同處理下的DEGs在聚類表達模式1和2中有兩個轉折點，分別在ALA和Heat處理點中上調或下調；在聚類表達模式3中DEGs平均變化模式呈直線水平趨勢，在4組處理上穩定波動；在聚類表達模式4中，4組處理的DEGs呈直線上升趨勢且在HA處理點上達到峰值。

（A） （B） microtubul Lysine biosynthesis DNA binding transcr 氨酸生物合成 sequence- 列 Vitamin B6 motabolism 維生素B6新陳代謝 proteinser Brassinosteroid biosynthesis 蕓苔素類固醇生物合成 xire Fatty acid degradation * 脂肪酸降解 加氧麗活性 Protein processing in endoplasmic reticulum O

uodiosea xidreduct 小 . ： 0 8 H 100 moveentll 0.00 alphaLinolencad酸代 0.00 protein-DNAcoe n Sunitc olex . Gut新代 -亞麻酸代謝 小體 . Linoleic acid metabolism chromatin ·亞油酸新陳代謝 nucleosor 核小體組裝 ·Crcadlan carb 前 Phenylpropanodosynss 固碳作用 responsetob物激反應 defense r 都H . . Fa 苯丙類生物合成 0.02 0.04 0.06 0.08 0.05 0.10 0.15 GeneRatio GeneRatio 基因比例 基因比例

本研究重點分析聚類表達模式1和2，兩種表達模式中的外源ALA能誘導高溫脅迫下植株葉片的次生代謝物，KEGG富集通路主要為異喹啉生物堿的生物合成（ko00950）、苯丙烷類生物合成 ）類黃酮生物合成（ko00941）、酪氨酸代謝（ko00350）、光合作用天線蛋白（ko00196）、植物MAPK信號通路（ko04016）以及植物激素信號轉導途徑（ko04075）（圖6B）。因此，4組處理共有的DEGs功能分類的結果與所有的DEGs共表達聚類富集分析的結果類似，以上途徑為進一步挖掘‘德欽'紫花苜蓿耐熱基因提供了新的思路。

2.7苯丙烷類生物合成的關鍵基因表達譜分析

從共聚類表達模式1得知，HA處理誘導了葉片中苯丙烷類生物合成途徑，進一步分析了不同處理條件下DEGs在這條途徑中的表達（圖7）。苯丙烷類生物合成途徑中8個家族的34個DEGs存在顯著差異，包括編碼 β -葡萄糖苷酶（ β -GLU）、苯丙氨酸解氨酶 （ P A L ）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A（4CL）羥基-肉桂酰輔酶A莽草/荃寧酸酯轉移酶（HCT）、咖啡酸-O-甲基轉移酶（COMT）、咖啡酰輔酶A-3-O-甲基轉移酶（CCoAOMT）過氧化物酶（ P O D ）的基因。在‘Heat/CK'中上游的5個P A L 基因顯著上調表達，但大部分 β -GLU基因下調表達，并且 H C T 基因顯著下調，導致下游的10個P O D 基因也顯著下調；與之相反的是‘HA/Heat'上游的6個 P A L 和3個 β -GLU基因顯著下調表達，但H C T 基因顯著上調，導致下游的3個 P O D 基因顯著上調表達。由此結果推測外源ALA可以誘導‘德欽'紫花苜蓿葉片在高溫脅迫下促進苯丙烷類生物合成途徑的中間產物 H C T 基因的表達來增加POD活性以提高其耐熱性。

2.8植物激素信號轉導途徑的關鍵基因表達譜分析

共表達聚類模式2及功能富集分析中，HA刺激了葉片中的植物激素信號轉導途徑（圖8）。植物激素信號轉導途徑中，不同比較組除赤霉素以外的7大類激素轉導相關的59個DEGs存在顯著差異。生長素、脫落酸、乙烯和茉莉酸通路中，4個比較組均存在顯著性DEGs較多，推測HA處理調控這4種激素信號轉導途徑來響應高溫脅迫的可能性更高。

在‘Heat/CK'下，與IAA信號轉導相關的負調控因子 （ A U X / I A A 絕大部分顯著下調，具有吲哚乙酸氨基酸化合成酶功能的（ G H 3 顯著上調，編碼鈣調素結合蛋白的（SAUR）上下調都有，但‘HA/Heat'下的DEGs情況卻相反（圖8A），說明高溫脅迫下的外源ALA誘導的生長素信號轉導途徑中起到負調控作用的基因轉錄更活躍，使生長素信號轉導強度在高溫期間有所降低，可能存在某種反向保護機制。在ABA信號轉導途徑中 S n R K 2 ， P P 2 C 以及ABA受體 P Y L 基因的表達在‘Heat/CK'下呈下降趨勢，暗示葉片生長過程中與ABA信號轉導相關基因的轉錄受到明顯抑制，而‘HA/Heat'可促進ABA信號轉導相關基因上調表達（圖8C）。ET信號轉導途徑的關鍵因子EIN4基因（MsG0780041690.01）以及下游的正調控器EIN3基因（MsG0380015861.01）均下調，暗示外源ALA使高溫脅迫下的葉片對ET敏感性有所降低（圖8F）。JA信號轉導途徑相關DEGs整體表達趨勢與ET類似（圖9G）。

其他植物激素中，4個與SA信號轉導有關的基因在‘Heat/CK'下均顯著下調，而‘HA/Heat'與‘Heat/CK'相比顯著上調，表明外源ALA在整個高溫脅迫過程中可能起促進作用（圖8B）。與之不同的是3個與BR信號途徑相關基因表達在‘Heat/CK'下整體呈上升趨勢，而在‘HA/Heat'后與‘Heat/CK'相比顯著下調（圖8D）。4個與CTK信號途徑相關基因，在‘Heat/CK'下上下調各一半，而在‘HA/Heat'后與‘Heat/CK'相比4個基因均顯著上調（圖8E）。

2.9qRT-PCR驗證轉錄組數據

由于RNA-seq具有一定的缺陷，可能會得到假陽性的結果，為了驗證RNA-seq數據的可靠性，從植物激素信號途徑和苯丙烷類生物合成途徑中，各隨機選取了6個DEGs用于qRT-PCR驗證（圖9）。

（MsG0580028603.01）、COMT （MsG0580030145.01）、PAL（MsG8780040944.01）（圖9A）；植物激素信號轉導途徑中5個上調基因為 A U X / I A A （MsG0180004272.01、MsG0380015754.01、MsG0480021367.01）、MsG0480021366.01和 A R R - B （ M s G0780040418.01），1個下調基因為 P Y L （ M s G 0 480018569.01（圖9B），所有基因表達的差異趨勢與RNA-seq數據高度一致，這證實了本研究的DEGs是可信的。

3討論

外源ALA在農林生產上具有廣闊用途，可調節植物的生長發育[38]，從而提高植物的抗逆性。如 的ALA有利于紫花苜蓿生長，提高植株的耐熱性[26] 可以增強辣椒（Capsicumannum）幼苗的耐熱性[39]； 處理可有效減輕高溫脅迫對裸燕麥（Avenanuda）的傷害[40]； 的5-ALA緩解芍藥（Paeonia lac-tiflora）夏季高溫脅迫，且改善其觀賞品質效果最佳[41]。不同植物間的反應有所差異，而外源ALA能明顯提高植物的抗熱性。本研究的表型和生理指標結果表明， 的外源ALA可減輕 高溫脅迫下苜蓿的生長抑制，有效緩解高溫脅迫對其傷害，增強‘德欽'紫花苜蓿對高溫脅迫的適應能力，這與張鶴等[29]的研究結論一致。

轉錄組測序技術在苜蓿屬中廣泛用于鑒定重要性狀相關的關鍵基因，例如篩選疾病應答基因[42]，響應鋁脅迫基因[43]，篩選鹽脅迫相關候選基因[44-45]。轉錄組的趨勢分析可用來挖掘具有相同表達模式的基因，其實質是對表達趨勢相同的基因進行歸類。李博等[46]對金花茶（Camellianitidissima）花瓣轉錄組分析，利用趨勢分析對花瓣發育調控進行基因挖掘。徐俊等[47]對菊花（Chrysanthemum）根狀莖的基因表達模式的Cluster分析，篩選出根狀莖發育的關鍵基因。本研究利用轉錄組測序對4個比較組鑒定出的270個共有DEGs功能分類以及全部DEGs的共表達趨勢分析，發現外源ALA處理后紫花苜蓿葉片經高溫脅迫的DEGs顯著富集到苯丙烷類生物合成和植物激素信號轉導途徑。

苯丙烷類生物代謝途徑是植物次生代謝產物的主要合成方式之一，起始反應由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶催化，進而產生木質素和類黃酮兩類最主要的分支代謝產物[48]。目前苯丙烷類生物代謝研究中，高溫可促使水稻（OryzasatiuaL.）穎花苯丙烷類代謝關鍵酶活性，從而增強其耐熱性[48-49]。高溫脅迫下‘德欽'紫花苜蓿根中苯丙烷代謝途徑富集顯著，從而應對熱脅迫[50]。本研究發現苯丙烷類生物合成途徑富集顯著，促進蔗糖分解成葡萄糖的3個 β -GLU下調表達，說明HA處理下首蓿葉片生長發育不消耗多余能量，Heat下葉片耗能降低。外源ALA誘導高溫下葉片積累更多的蔗糖含量，最終導致葉片可溶性糖含量也相應增加，進而提高植株苗期耐熱性，這與本研究的生理結果表現一致。與CK相比，Heat下苯丙烷類生物合成途徑大部分關鍵基因顯著下調，尤其是 P O D ，催化苯丙醇類物質轉化為木質素類。但與之相比，HA處理下的中間產物 H C T 顯著上調，使得下游的大部分 P O D 基因下降趨勢得到緩解，導致POD活性得到提高，這一研究結果與趙穎[5]研究相反，原因可能是外源ALA處理可誘導高溫脅迫下首蓿葉片HCT基因的表達從而提高POD活性。

植物內源性激素是植物防御反應的主要調節劑之一，在幫助植物適應不利環境方面發揮著關鍵作用[52-53]。生長素在調節植物生長發育中起著關鍵作用，可控制植物對脅迫的生長反應[54]。脫落酸是一種脅迫激素，它充當介導植物對脅迫反應的重要內部信號，并且脅迫會誘導ABA的合成[55]。本研究的植物激素信號轉導途徑中大部分DEGs與IAA和ABA信號通路有關，這與趙雁等[56]研究結果相似。IAA信號轉導第一步是生長素受體與AUX/IAA的相互作用，從而導致AUX/IAA降解[57]。本研究結果表明Heat下AUX/IAA蛋白編碼的DEGs S A U R 和IAA顯著下調，而HA下S A U R 和 I A A 顯著上調。在ABA信號轉導途徑中，PYR/PYL受體能間接調控SnRK2的活性[58]。當ABA與PYR/PYL受體結合后能觸發受體的構象變化，從而使受體-ABA復合物與 P P 2 C 結合并抑制其活性[59]。本研究發現7個ABA受體 P Y L 的表達在Heat下顯著受到抑制，唯一的DEGsSnRK2和2個 P P 2 C 也在Heat的表達顯著下調，表明葉片在高溫脅迫過程中ABA信號轉導減弱，ABA對植物氣孔調節機制的抑制作用顯著降低，而HA中大部分 P Y L 也顯著下調且下調倍數高于Heat下的倍數。高溫脅迫下，外源ALA預處理可上調 S A U R 和 I A A 表達，同時下調 P Y L ，這意味著外源ALA通過調控 和 P Y L 這些基因在高溫脅迫下的表達來提高‘德欽'紫花苜蓿的耐受性。

4結論

本研究綜合了生理學和轉錄組學探究外源ALA調節‘德欽'紫花苜蓿對高溫脅迫的響應變化，發現 的外源ALA緩解苜蓿高溫脅迫效果最佳。在響應高溫脅迫的過程中，4個比較組的差異表達基因主要被富集到苯丙烷類生物合成和植物激素信號轉導相關通路。經qPT-PCR試驗驗證兩條通路中隨機挑選的12個基因符合轉錄組數據，外源ALA通過調控兩條通路的 H C T ， S A U R ，I A A ， P Y L 等核心基因來提高‘德欽'紫花苜蓿耐熱能力。生理特性研究和轉錄組分析篩選出的關鍵基因及代謝通路，將為調控紫花苜蓿耐熱性機理研究提供一定的理論基礎，為外源ALA在紫花苜蓿耐高溫生產中的應用和耐熱育種等方面提供參考。

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（責任編輯 彭露茜）