粗葉榕轉錄組SSR位點分析及分子標記開發

摘""要：五指毛桃（Fici"Hirtae"Radix）是一種中藥材，其來源于粗葉榕（Ficus"hirta"Vahl.）的干燥根部。開發利用藥用植物粗葉榕SSR分子標記，為其種質遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、輔助育種等提供理論依據及數據支撐。以粗葉榕全緣、三裂、五裂、七裂4種典型葉片為試材，經轉錄組測序后進行位點特征分析及分子標記開發。結果表明：基于34"375條轉錄組unigene序列，篩選到16"851個SSR位點，分布于12"094條unigene，分布頻率為35.18%，平均每2638"bp有1個SSR位點，分布密度為3.68"kb。共觀察到5種不同核苷酸基序類型，其中最常見的是重復6次的基序，占SSR總數的20.92%，且長度基本小于29"bp。雙堿基重復序列占主導地位，其次是三堿基和四堿基重復類型。其中，（AG/CT）n是最常見的基元，占所有SSR的26.05%；其次是（AT/AT）n基元，占18.69%。隨機選取100條EST-SSR引物，以粗葉榕4種不同葉型的基因組DNA擴增目標產物，其中89條引物在粗葉榕4個種質間表現出多態性。選取9對條帶清晰的引物，對不同地區的31個粗葉榕種質進行DNA擴增和指紋圖譜構建，這些引物組合多態性條帶比例均值達72.04%，并對31個種質進行了有效鑒別，成功建立了DNA指紋圖譜。研究結果證明粗葉榕轉錄組SSR位點信息豐富，利用性高，可為后續研究提供數據支撐。

關鍵詞：粗葉榕；五指毛桃；轉錄組；EST-SSR；DNA指紋圖譜中圖分類號：S567.19""""""文獻標志碼：A

Comprehensive"Analysis"of"SSR"Loci"Within"the"Ficus"hirta"Vahl."Transcriptome"and"the"Developmental"Application"of"Molecular"Markers

YAN"Qing1，"QIN"Yanan1，3，"ZHANG"Hualin1，"LI"Wenxiu1，"YE"Yana1，"HUANG"Anying2，"LUO"Ping1*

1."Zhanjiang"Experimental"Station，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Zhanjiang"Rubber"Understory"Economic"Engineering"Technology"Research"Center，"Zhanjiang，"Guangdong"524013，"China;"2."Research"Institute"of"Fast-growing"Trees，"Chinese"Academy"of"Forestry，"Zhanjiang，"Guangdong"524300，"China;"3."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"650201，"China

Abstract："Fici"Hirtae"Radix，"a"Chinese"herbal"medicine，"is"prepared"from"the"dry"roots"of"Ficus"hirta"Vahl."This"study"aimed"to"provide"theoretical"and"empirical"support"for"the"genetic"diversity"analysis，"genetic"map"construction，"and"assisted"breeding"of"F."hirta"Vahl."by"developing"SSR"molecular"markers."Four"typical"leaves"of"F."hirta"Vahl."were"selected"as"the"samples，"and"site"feature"analysis"and"molecular"marker"development"were"performed"after"transcriptome"sequencing."A"total"of"16"851"SSR"loci"were"identified"from"34"375"transcriptome"unigene"sequences，"distributed"across"12"094"unigene"sequences，"resulting"in"a"distribution"frequency"of"35.18%."The"average"frequency"was"one"SSR"locus"every"2638"bp，"with"a"density"of"3.68"kb."Five"distinct"nucleotide"motifs"were"observed，nbsp;with"the"motif"repeating"six"times"being"the"most"prevalent，"constituting"20.92%"of"all"SSRs，"and"typically"less"than"29"bp"in"length."Di-nucleotide"repeats"were"predominant，"followed"by"tri-and"tetra-nucleotide"repeats."（AG/CT）n"was"the"most"abundant"repeat"motif，"representing"26.05%"of"all"SSRs，"while"（AT/AT）n"was"the"second"most"common，"accounting"for"18.69%."100"EST-SSR"primers"were"randomly"selected"to"amplify"target"product"using"genomic"DNA"from"four"different"leaf"types"of"F."hirta"Vahl."89"primers"exhibited"polymorphism"across"the"germplasms."Nine"primer"pairs，"distinguished"by"the"high"definition"and"clarity，"were"selected"to"perform"DNA"amplification"and"construct"DNA"fingerprints"for"31"specimens"sourced"from"different"regions."The"average"percentage"of"polymorphic"bands"observed"across"these"primers"was"72.04%."The"substantial"degree"of"polymorphism"facilitated"the"unambiguous"identification"of"each"of"the"31"germplasm"samples，"and"robust"DNA"fingerprint"profiles"were"successfully"established"for"each"specimen."This"study"demonstrated"that"SSR"loci"within"the"transcriptome"of"F."hirta"Vahl."were"rich"in"information"and"highly"utilizable，"offering"valuable"data"support"for"future"research"endeavors.

Keywords："Ficus"hirta"Vahl.;"Fici"Hirtae"Radix;"transcriptome;"EST-SSR;"DNA"fingerprinting

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.007

微衛星標記，又稱簡單重復序列（simple"sequence"repeat，"SSR），是一種在植物遺傳多樣性研究、基因定位、目標性狀定位以及標記輔助選擇育種中被廣泛使用的標記系統。它具有突變率高、分布廣、密度大的優點，已經廣泛應用于種質資源鑒別、遺傳多樣性分析以及指紋圖譜的構建等領域[1]。SSR主要是由串聯重復單元構成，其核心單位含1～6個核苷酸，因重復次數和程度的差異，呈現出高度的多態性。SSR標記具有共顯性特征，穩定性強且等位基因多樣性豐富，根據序列獲得方式不同，可分為基因組SSR（genomic"SSR，"g-SSR）和轉錄組SSR（expressed"sequence"tags"SSR，"EST-SSR）[2]。與g-SSR相比，EST-SSR并不需要對整個基因組進行測序，而是位于基因編碼區內，具有方便快捷、效率高、成本低廉及與表型性狀相關性好等優點。傳統的SSR開發方法難度大、成本高、勞動密集，高通量測序技術的進步和測序成本的降低減少了轉錄組測序的成本，推動了通過轉錄組測序開發SSR標記的快速發展與廣泛應用。轉錄組測序后生成的序列數據中包含大量的有效基因，為評估物種多樣性提供了新方法。目前，通過轉錄組數據開發EST-SSR標記已在黃連、冬蟲夏草、白木香、川貝母、穿心蓮等諸多植物中得到廣泛應用[3]，極大促進了植物的育種進程。

粗葉榕（Ficus"hirta"Vahl.），屬于桑科榕屬的無花果亞屬，是一種木本植物，主要分布于亞洲的亞熱帶地區，中國的熱帶及亞熱帶地區均有分布[4]。中藥材五指毛桃（Fici"Hirtae"Radix）藥食同源，來源于粗葉榕的干燥根，又稱五指牛奶、南芪、土北芪、五爪龍等，具有益氣、健脾、潤肺、祛風濕等功效，在海南、廣東等地被廣泛應用，藥用和食用價值較高[5]。粗葉榕的高遺傳多樣性與低群體分化決定了其更高的適應性與進化潛力[6]，在長期適應不同生境及遺傳漂移的過程中形成了復雜的變型。從已收集的種質資源來看，粗葉榕不同種質間表型差異大，僅通過表型鑒定無法準確及時對其進行區分，同時不同種質間遺傳背景不清晰，遺傳距離不明了，極大限制了植物新品種選育，影響其育種進程。因此，表型評價結合分子標記技術無疑是一個極佳的解決手段，通過轉錄組測序開發粗葉榕SSR標記，對不同種質資源進行精準鑒定，對后續粗葉榕資源評價及基因組選擇育種具有重要意義。

當前對粗葉榕的報道多集中于傳統分類學[7]、化學成分[8-9]、繁育[10]與藥理作用[11]等方面，少有品種選育與精準鑒別方面的研究，缺少豐富的分子標記資源和準確的DNA指紋圖譜信息。國內外對大豆[12]、玉米[13]、水稻[14]等作物的研究結果表明，SSR標記可有效檢測位點多態性，對育種工作具有較好的推動作用。而關于粗葉榕轉錄組SSR分子標記開發利用方面的研究報道較少，僅有LU等[6]基于同屬植物無花果（Ficus"carica"Linn.）的9對SSR引物對18個粗葉榕居群開展的遺傳多樣性分析。截至目前，已有學者開展了全緣、三裂、五裂、七裂4種葉型五指毛桃果實的氨基酸組成比較及營養價值評價[15]，尚無通過不同葉裂類型粗葉榕轉錄組測序開發SSR標記的研究。本研究以不同葉裂粗葉榕葉片轉錄組測序為基礎，利用生物信息學方法分析其SSR位點序列分布特征、堿基重復類型等，開發了4種典型葉型粗葉榕中均具有的多態性的葉片SSR標記，并在31種不同來源種質中進行驗證。為粗葉榕種質遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、輔助育種等提供理論及數據支撐。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為河源全緣、河源三裂、河源五裂、河源七裂4個粗葉榕典型種質（圖1）及31份不同來源粗葉榕種質（表1），經中國熱帶農業科學院湛江實驗站羅萍研究員鑒定為粗葉榕。樣品采自中國熱帶農業科學院湛江實驗站粗葉榕種質圃，該種質圃位于廣東省東南部，年均氣溫為23.8"℃，年均降水量為1396.3～1759.4"mm。選取生長良好，已分化且分化明顯的不同種質新鮮葉片各3片，液氮快速冷凍后置于?80"℃冰箱保存，備用。

1.2""方法

1.2.1""轉錄組測序及組裝""采集典型種質河源全緣、河源三裂、河源五裂、河源七裂4個種質各3份葉片，提取RNA后分別反轉錄構建cDNA文庫，然后利用Illumina"HiSeq"TM"2000平臺測序。使用Trinity軟件對原始數據進行過濾、重組、去除冗余和同源轉錄本聚類，從而得到unigene序列。

1.2.2""DNA提取""取不同葉型及不同來源的12個粗葉榕種質葉片分別研磨，采用改進的CTAB方法提取DNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢查其完整性。使用時檢測濃度與純度，最后將其稀釋到一致的濃度后再使用。

1.2.3""轉錄組SSR位點鑒別及EST-SSR引物設計""利用MISA"1.0軟件對粗葉榕的轉錄組數據查找SSR位點時，重復序列的要求為：二核苷酸≥6；三核苷酸≥5；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸均≥4。此外，如果2個SSR之間的距離小于100"bp，則認為是1個SSR。使用Primer"3.0軟件設計引物，設計預測產物長度為100～280"bp，序列長度為8～25"bp，GC含量為40%～60%，退火溫度為（60±5）℃，上下游引物的退火溫度之間的差異不超過5"℃。

1.2.4""EST-SSR引物篩選及遺傳多樣性分析""（1）EST-SSR引物篩選。從引物組中隨機選取100對長度超過20"bp的SSR序列，以全緣、三裂、五裂、七裂4種不同種質粗葉榕葉片DNA為模板進行擴增。PCR擴增體系為10"μL：上下游引物各0.4"μL，1"μL"DNA，5"μL"Mix，3.2"μL"ddH2O。PCR擴增程序為：98"℃預變形5"min，98"℃變性10"s，60"℃退火15"s，72"℃延伸45"s，35個循環，72"℃延伸2"min。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，設定電壓為200"V，電流為120"A，電泳2"h。電泳結束后，進行銀染洗脫，記錄結果。

（2）EST-SSR引物多態性分析。選取來自廣東、廣西、福建和云南4個省（區）的31份粗葉榕種質資源（表1）進行EST-SSR引物驗證。以上述種質DNA為模板，對1.2.4-（1）篩選得到的9對引物進行PCR擴增，電泳后讀帶。將讀帶結果進行統計，采用Popgen"32軟件分析不同引物條帶數量、觀測等位基因數（observed"number"of"alleles，"Na）、有效等位基因數（effective"number"of"alleles，"Ne）、香農指數（Shannon’s"information"index，"I）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s"gene"diversity"index，"H）及不同種質間的遺傳距離；采用Genalex軟件分析期望雜合度（expected"heterozygosity，"He）與無偏期望雜合度（unbiased"expected"heterozygosity，"uHe）。將數據輸入到NTSYS軟件中，利用非加權組平均法在NTSYS軟件的相似性模塊中建立聚類樹，具體方法：從NTSYS軟件的相似性模塊中獲取相似性矩陣或距離矩陣，在Clustering模塊中得到聚類樹，然后將種質相關資料輸入二維碼制作工具，從而為各粗葉榕資源創建二維碼形式的DNA分子身份標識[16-17]。

2""結果與分析

2.1""轉錄組的組裝

通過對河源全緣、河源三裂、河源五裂、河源七裂4種典型種質進行轉錄組測序，共得到12組序列。對轉錄組組裝質量統計分析，共得到34"375條unigene，其總長度為44"450"502"bp，平均長度為1293"bp；最長的unigene長度為

14"243"bp，最短的unigene長度為201"bp；GC含量為41.50%；N50長度為2186"bp，是平均長度的1.69倍；N50數量為6808條，是總組裝數量的19.81%，說明粗葉榕轉錄組的組裝質量好。

2.2""粗葉榕葉片轉錄組中SSR位點分析

利用MISA軟件進行分析，在粗葉榕的34"375條轉錄組unigene序列數據中，12"094條unigene上含有16"851個SSR位點，含SSR位點的unigene數占unigene總數的35.18%，而SSR位點的數量則占unigene總數的49.02%，平均每2638"bp有1個SSR位點。此外，還發現有4756個unigene包含至少1個以上的SSR位點。

2.3""粗葉榕葉片轉錄組SSR重復類型分析

從表2可以看出，在粗葉榕的轉錄組SSR位點中，雙堿基和三堿基重復類型的頻率較高，分別占24.83%和10.71%。四堿基、五堿基和六堿基重復類型的頻率相對較低，分別僅占3.14%、1.48%和1.63%。平均每19.88"bp堿基長度出現1個雙堿基重復序列，平均每19.56"bp堿基長度出現1個雙堿基至四堿基，而每24.16"bp堿基長度時才可能會出現五、六堿基，可見雙堿基、六堿基與其他類型堿基間的平均分布長度差異較大，特別是雙堿基在長度分布上占有很高的優勢地位。雙堿基和三堿基的總長度達到了20多萬的數量級，剩余類型堿基長度總和也有236.48"kb，但四堿基、五堿基、六堿基類型總長度只有45.38"kb左右。在總的unigene序列上平均每2.64"kb出現1個重復基序，各種類型的基序出現距離由雙堿基、三堿基、四堿基、五堿基到六堿基依次增加。

2.4""粗葉榕葉片轉錄組中SSR位點類型

在粗葉榕轉錄組中，單一出現頻率高于2%的主要有7種重復單元，其中包含雙堿基重復3種，即AC/GT重復、AG/CT重復、AT/AT重復，尤以AG重復數量最多，為4389個，比例達26.05%。三堿基重復基元重復次數較多的共8種，AAG/CTT重復最多，出現頻率為7.62%，ATC/ATG重復較少，頻率為1.41%；四堿基重復中，數量最多的是AAAT/ATTT，出現頻率為3.41%；五堿基重復數量最多的為AAAAT/ATTTT單元。其他類型出現頻率低于0.90%的重復單元共占總SSR的21.97%（圖2）。

2.5""粗葉榕葉片轉錄組SSR重復次數分析

利用MISA軟件對轉錄組中的所有unigene進行搜索，并分析SSR基元的重復次數。SSR重復單元的重復次數分布在4～13次之間，其中4～9次重復的有14"235個，占78.46%；10～13次重復的SSR位點有3908個，占21.54%。6次重復基元出現的頻率最高，占總SSR位點數的20.92%；其次為5、7次重復基元出現的頻率，分別占總SSR位點數的14.98%、13.49%。從SSR的重復次數來看，雙堿基主要集中在6～11次，占雙堿基分布總數的86.01%；三堿基主要集中在5～7次，占三堿基分布總數的81.30%；四堿基主要集中在4～6次，占四堿基分布總數的96.21%；五堿基主要集中在4～5次，占五堿基分布總數的95.51%；六堿基主要集中在4～5次，占六堿基總數的94.84%（圖3）。

2.6""粗葉榕葉片轉錄組SSR可用性評價

篩選的SSR基序長度分布在12～407"bp范圍內，在該范圍內，基序長度為12～19"bp的中度多態性位點共有7631個，占比為45.29%；基序長度≥20"bp的高度多態性位點有9220個，占54.71%（圖4）。說明可以從該葉片轉錄組中開發出具有高度多態性的SSR引物。

2.7""EST-SSR引物篩選與遺傳多樣性分析

2.7.1""EST-SSR引物篩選""利用16"851個SSR位點，最終設計得到12"336對EST-SSR引物。以全緣、三裂、五裂、七裂4種不同葉型粗葉榕DNA為模板進行驗證，隨機選擇100對EST-SSR引物進行擴增。結果顯示，有89對引物可擴增出目標產物，其中55對引物在4種不同葉型粗葉榕中表現出多態性，篩選出9對條帶清晰的引物（表3）。

2.7.2""EST-SSR引物遺傳多樣性分析""以31份不同粗葉榕種質DNA為模板，對篩選出的9對EST-SSR引物進行擴增及遺傳多樣性分析，并構建系統進化樹及DNA分子身份證。利用9對EST-SSR引物對31份不同粗葉榕種質進行擴增，計算獲得遺傳多樣性指標和多態性信息含量（表4）。9對引物的觀測多態性條帶數在3～5條之間，平均多態性條帶數量為4.44條；觀測等位基因數（Na）在0.903～1.839之間，平均值為1.577；有效等位基因數（Ne）為1.273～1.656，平均值為1.476；香農指數（I）介于0.235～0.543之間，平均值為0.405；期望雜合度（He）介于0.158～0.372之間，平均值為0.274；無偏期望雜合度（uHe）介于0.181～0.414之間，平均值為0.309；Nei’s基因多樣性指數（H）為0.158～0.372，平均值為0.274。多態性條帶比例分布范圍在41.94%～"90.32%之間，平均值為72.04%。結果表明，篩選的9對引物在31份種質中的多態性較高。

31份粗葉榕種質的遺傳相似系數在0.35～"0.90之間，種質間均存在遺傳差異。CY1與FLT7的遺傳相似系數最小（0.35），遺傳差異最大；FLT1與FLT5的遺傳相似系數最大（0.90），遺傳差異最小。基于NTSYS軟件進行聚類分析構建系統進化樹（圖5），結果表明，31個種質被有效區分，且結果穩定可重復，表明基于EST-SSR分子標記體系能對粗葉榕種質資源進行遺傳多樣性分析，通過聚類分析能有效區分與鑒定不同種質的遺傳多樣性。同時可構建不同粗葉榕種質指紋圖譜，為粗葉榕資源創建二維碼形式的DNA分子身份標識（圖5為部分種質指紋圖譜）。

3""討論

本研究對4種不同葉型的粗葉榕葉片進行轉錄組測序，開發了SSR分子標記。研究顯示，4種葉型粗葉榕葉片轉錄組中的SSR位點總數為16"851個，出現頻率為49.02%，分布于12"094條unigene上，平均每2.64"kb有1個SSR位點。出現頻率高于同桑科植物桑樹（17.09%）[18]，并高于防風（15.51%）[19]、白三葉（13.25%）[20]、八角（18.85%）[21]等藥用植物，平均分布距離高于辣椒花（7.9"kb）[22]、苦蕎（3.04"kb）[23]、海帶（7.07"kb）[24]等植物，低于薏苡（0.20"kb）、三七（0.13"kb）等[25]。這種差異可能和物種之間SSR位點的表達差異有關，也可能是由于物種遺傳特性、SSR搜索標準的差異，數據量的大小以及選擇分析軟件的不同導致的[26-29]。總體來看粗葉榕轉錄組中SSR位點的出現頻率較高，平均分布距離較短，說明粗葉榕轉錄組中SSR位點的數量較多且種類豐富。

不同物種的SSR位點重復基元類型存在差異。主要體現在不同植物SSR位點數量、重復類型及占比有所不同。本研究中，粗葉榕轉錄組中的SSR基元類型豐富多樣，包括雙堿基到六堿基的重復，其中雙堿基和三堿基的重復占據主導地位，這2類基元類型構成的SSR位點共計72.49%，而且以雙堿基重復位點數量最多，6次重復基元出現的頻率最高。蔣爽等[30]通過對枇杷轉錄組SSR重復類型進行分析，發現該轉錄組中的二核苷酸重復數量占總數的71.1%，以AT/TA為主，三核苷酸重復類型占15.0%，以AAG/CTT為主，雙堿基和三堿基重復為主要類型，共占總SSR位點的86.1%，這與本研究結果一致。本研究中雙堿基重復類型較多，占總SSR位點的50.65%，郭俊等[31]通過對油梨轉錄組SSR重復類型進行分析，也發現該轉錄組的重復以二核苷酸和三核苷酸為主，占SSR總數的87.15%。陳友吾等[32]對多花黃精轉錄組SSR位點分析發現，SSR位點中的主導類型是二核苷酸重復，占總SSR的53.14%，其次是三核苷酸重復，占比達33.31%，均與本研究結果相似。

評估分子標記的適用性需要考慮其多態性程度，而具有豐富多態性和高潛力的低級SSR重復基序是開發這些標記的關鍵條件[20，"28]。已有研究表明，當基序長度lt;12"bp時，SSR的多態性較低；而當基序長度≥12"bp時，隨著基序長度的增加，SSR的分布頻率則降低；基序長度為12～19"bp時，SSR的多態性顯著下降；基序長度≥20"bp時，多態性較高[33]。在本研究中，粗葉榕轉錄組中基序長度超過20"bp以上的SSR位點有9220個，占SSR總數的54.71%，這部分多態性較高的SSR具有良好的開發應用價值，大多可作為后續研究的基礎。隨機選擇100對引物進行驗證，結果顯示，89對引物可擴增出目標產物，有效性達89%；55對引物具有多態性，多態性引物比例達55%，說明該轉錄組多態性潛能高。55對多態性引物中挑選9對條帶清晰的引物進行引物遺傳多樣性分析，成功將來源不同的31個粗葉榕種質進行合理區分并成功構建指紋圖譜，且9對引物在31份種質中多態性條帶比例高，均值達72.04%。

綜上所述，本研究對粗葉榕轉錄組測序后進行位點特征分析及分子標記開發，證實粗葉榕轉錄組SSR位點信息豐富，可利用性高。本研究結果可用于后續種質資源評價及遺傳多樣性分析等研究，是對現有粗葉榕轉錄組數據的進一步發掘和利用，所獲得的分子標記對豐富榕屬植物的分子標記類型及開展特定性狀的輔助選擇具有重要意義。

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