結(jié)直腸癌組織中天冬酰胺合成酶的表達(dá)及其臨床意義

［摘要］目的探討天冬酰胺合成酶（ASNS）在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法收集2017年1月－2018年12月在本院手術(shù)切除的143例原發(fā)性CRC患者的石蠟組織樣本及臨床病理資料，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CRC組織及其癌旁正常組織中ASNS表達(dá)水平，并分析CRC中ASNS的表達(dá)與患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果CRC腫瘤組織中ASNS表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（χ2=28.078，Plt;0.05）；CRC腫瘤組織中ASNS的表達(dá)水平與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓顯著相關(guān)（χ2=7.042～10.724，Plt;0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，CRC腫瘤組織中ASNS高表達(dá)的患者無病生存期更短（χ2=6.440，Plt;0.05），而ASNS的表達(dá)水平對(duì)于CRC患者總生存期無影響（P＞0.05）。結(jié)論ASNS在CRC腫瘤組織中高表達(dá)，且ASNS的表達(dá)水平與患者無病生存結(jié)局更差有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)CRC預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

［關(guān)鍵詞］結(jié)直腸腫瘤；天冬酰胺連結(jié)酶；免疫組織化學(xué)；腫瘤分期；淋巴轉(zhuǎn)移；脈管癌栓；預(yù)后

［中圖分類號(hào)］R375.34［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Expression of asparagine synthetase and its clinical significance in colorectal cancer tissue" YAO Yifan， LI Na， RAN Wenwen， ZHAO Han， XING Xiaoming （Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of asparagine synthetase （ASNS） in colorectal cancer （CRC） and its association with the clinicopathological features and prognosis of patients. MethodsParaffin-embedded tissue samples and clinicopathological data were collected from 143 patients with primary CRC who underwent surgical resection in our hospital from Ja-nuary 2017 to December 2018. Immunohistochemistry was used to measure the expression level of ASNS in CRC tissue and adjacent normal tissue， and the association of ASNS expression in CRC tissue with the clinicopathological features and prognosis of patients were analyzed. ResultsThe expression level of ASNS in CRC tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue （χ2=28.078，Plt;0.05）， and the expression level of ASNS in CRC tissue was significantly associated with TNM stage， lymph node metastasis， and vascular tumor thrombus （χ2=7.042-10.724，Plt;0.05）. The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with a high expression level of ASNS in CRC tumor tissue tended to have a shorter disease-free survival time （χ2=6.440，Plt;0.05）， while the expression level of ASNS had no influence on the overall survival time of CRC patients （Pgt;0.05）. ConclusionASNS is highly expressed in CRC tissue， and the expression level of ASNS might be associated with the poorer disease-free survival of patients. Therefore， it can be used as a potential biomarker for predicting the prognosis of CRC.

［KEY WORDS］Colorectal neoplasms; Aspartate-ammonia ligase; Immunohistochemistry; Neoplasm staging; Lymphatic metastasis; Vascular tumor thrombus; Prognosis

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種全世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤[1]。手術(shù)是原發(fā)性CRC的首選治療方案，其次是輔助放射治療及藥物治療[2]。然而，對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的CRC患者，目前的治療方案療效有限[3]。因此，深入探討CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找可靠的預(yù)后標(biāo)志物，開發(fā)新治療靶點(diǎn)，是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

腫瘤發(fā)生發(fā)展需要相應(yīng)的能量代謝及物質(zhì)基礎(chǔ)，谷氨酰胺是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所必需的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相較于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞新陳代謝更快，對(duì)谷氨酰胺的需求更高[4]。因此，研究腫瘤組織中谷氨酰胺的代謝狀況，對(duì)于揭示結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)代謝特征以及深入理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。天冬酰胺合成酶（ASNS）基因位于人類染色體7q21.3上[5]，其編碼的蛋白屬于氨基酸轉(zhuǎn)移酶家族成員，由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端催化谷氨酰胺水解，C端催化天冬氨酸（Asp）的羧酸鹽與腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）反應(yīng)生成天冬酰胺。ASNS的主要功能是以ATP依賴性方式催化Asp轉(zhuǎn)化為天冬酰胺（Asn），參與了細(xì)胞的氨基酸代謝以及能量代謝等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ASNS在多種腫瘤組織中高表達(dá)，例如胃癌[7]、黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10-11]等，其表達(dá)水平升高可加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，ASNS在CRC患者腫瘤組織中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚未可知。本研究首先檢測(cè)ASNS在CRC腫瘤組織中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的影響。

1材料與方法

1.1GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

基于GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析ASNS在結(jié)腸癌（COAD）和直腸癌（READ）組織及其癌旁正常組織的表達(dá)情況。

1.2臨床組織樣本的收集

收集2017年1月－2018年12月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的143例原發(fā)性CRC患者的石蠟組織樣本（腫瘤組織及癌旁正常組織）和臨床病理資料（包括患者性別、年齡及腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓情況），并且隨訪患者的預(yù)后情況，末次隨訪時(shí)間為2024年1月5日。所有患者術(shù)前均未行新輔助治療，無結(jié)直腸癌家族史，未合并其他惡性腫瘤。

1.3組織芯片制備及免疫組織化學(xué)染色

將患者的腫瘤組織及癌旁正常組織石蠟樣本制備成厚4 μm、直徑2.0 mm的組織芯片，經(jīng)脫蠟水化處理后，以EDTA修復(fù)液（pH值為9.0）對(duì)切片高壓修復(fù)2 min，置于3%過氧化氫溶液中室溫反應(yīng)30 min。以PBS洗滌3次后，使用5%牛血清白蛋白封閉10 min，滴加ASNS一抗稀釋液（1∶600），4 ℃孵育過夜。滴加通用型二抗37 ℃反應(yīng)30 min，滴加DAB試劑顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染后，用中性樹膠封片。

使用光學(xué)顯微鏡觀察切片的染色情況，染色結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)分，當(dāng)評(píng)分不一致時(shí)，再增加1位病理醫(yī)師進(jìn)行判讀。以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為ASNS染色陽性，無著色為ASNS染色陰性。染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時(shí)陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性細(xì)胞比例lt;25%為1分，25%≤陽性細(xì)胞比例lt;50%為2分，50%≤陽性細(xì)胞比例lt;75%為3分， 75%≤陽性細(xì)胞比例≤100%為4分。綜合得分計(jì)算方法：染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞比例評(píng)分。根據(jù)腫瘤組織中ASNS的綜合得分將所有患者分為兩組，ASNS無-低表達(dá)組（1～3分）和ASNS高表達(dá)組（4～12分）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Graphpad Prism 7軟件繪圖。兩組間比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法和Log Rank檢驗(yàn)用于生存分析，所有檢驗(yàn)為雙尾，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

COAD和READ腫瘤組織中ASNS基因表達(dá)水平顯著高于正常組織（Plt;0.05）。

2.2ASNS在臨床樣本中的表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，143例原發(fā)性CRC患者癌旁正常組織當(dāng)中ASNS高表達(dá)者36例（25.17%），ASNS無-低表達(dá)者107例（74.83%）；腫瘤組織中ASNS高表達(dá)者80例（55.94%），ASNS無-低表達(dá)者63例（44.06%）。CRC腫瘤組織當(dāng)中ASNS高表達(dá)者比例顯著高于癌旁正常組織（χ2=28.078，Plt;0.05）。見圖1。

2.3CRC腫瘤組織中ASNS表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤組織中ASNS表達(dá)水平與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及脈管癌栓有關(guān)（χ2=7.042～10.724，Plt;0.05），而與患者年齡、性別及腫瘤大小、分化程度、神經(jīng)侵犯情況無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

2.4CRC腫瘤組織中ASNS表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

CRC患者隨訪時(shí)間1～84月，中位隨訪時(shí)間62（35，72）月。截至隨訪結(jié)束，ASNS無-低表達(dá)組患者的中位無病生存時(shí)間64（60，71）月，無病情進(jìn)展患者39例；復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者20例（腸局部復(fù)發(fā)3例，腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移8例，肺轉(zhuǎn)移4例，骨轉(zhuǎn)移1例），其中18例患者死亡；另有4例患者失訪。ASNS高表達(dá)組患者的中位無病生存期55（24，74）月，無病情進(jìn)展患者28例；復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者44例（腸局部復(fù)發(fā)12例，腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例，遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移13例，肺轉(zhuǎn)移10例，骨轉(zhuǎn)移4例），其中18例患者死亡；另有8例患者失訪。Kaplan-Meier生存分析顯示，相較于ASNS無-低表達(dá)組的患者，ASNS高表達(dá)組患者無病生存期更短（χ2=6.440，Plt;0.05），兩組患者的總生存期無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

3討論

CRC作為臨床上常見的惡性消化道腫瘤，其治療手段包括放療和免疫治療等，但患者的生存率和疾病控制情況仍然有待提高。本研究發(fā)現(xiàn)ASNS在CRC組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓顯著相關(guān)，ASNS高表達(dá)的患者無病生存期更短。

ASNS是一種在ATP依賴性反應(yīng)中將天冬氨酸和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為天冬酰胺和谷氨酸的酶，但其功能不僅限于催化天冬酰胺的合成，其還參與了細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)[12]。腫瘤組織中ASNS基因表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織。雖然ASNS在CRC中作用及機(jī)制研究尚未明確，但在其他實(shí)體腫瘤中已有相關(guān)研究。DENG等[13]發(fā)現(xiàn)p53的缺失可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)氨代謝重組，破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中天冬酰胺和天冬氨酸的平衡狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，p53的缺失可以上調(diào)ASNS的表達(dá)。LI等[8]研究顯示，敲降A(chǔ)SNS基因表達(dá)可以抑制黑色素瘤細(xì)胞和表皮樣癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞在G0/G1細(xì)胞周期停滯，說明ASNS可能會(huì)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。通過調(diào)節(jié)ASNS的活性或表達(dá)水平，可以影響腫瘤細(xì)胞對(duì)氨基酸的利用，從而干擾其代謝適應(yīng)性[14]。

腫瘤細(xì)胞常處于低氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的微環(huán)境中，因此它們通過加強(qiáng)糖酵解過程來滿足其快速增殖和細(xì)胞分裂的能量需求。研究表明，在葡萄糖缺乏條件下，增強(qiáng)ASNS的表達(dá)可以促進(jìn)JNK/SAPK活化，保護(hù)胰腺癌細(xì)胞免受由葡萄糖剝奪和順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，ASNS在胰腺癌細(xì)胞中可能起到抗凋亡作用，可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及腫瘤形成[10]。這表明ASNS在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝通路中發(fā)揮作用，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用和能量的產(chǎn)生。ASNS在腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng)和凋亡調(diào)節(jié)當(dāng)中起到促進(jìn)作用[15]。研究表明，ASNS的表達(dá)水平在細(xì)胞應(yīng)激的條件下上調(diào)，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受應(yīng)激損傷，而ASNS的過度表達(dá)與細(xì)胞凋亡逃逸和治療抵抗相關(guān)[15-17]。研究結(jié)果顯示在GEPIA數(shù)據(jù)庫中COAD和READ組織中ASNS基因表達(dá)水平均顯著高于正常組織。基于上述結(jié)果，本研究進(jìn)一步收集并檢測(cè)了本院143例原發(fā)性CRC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織樣本。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，腫瘤組織中ASNS高表達(dá)者占比55.94%，癌旁正常組織ASNS高表達(dá)者占比25.17%，腫瘤組織中ASNS高表達(dá)比例顯著高于癌旁正常組織，與先前研究結(jié)果基本一致。另外本研究中，腫瘤組織中ASNS表達(dá)水平與CRC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓顯著相關(guān)，與患者年齡、性別及腫瘤大小、分化程度、神經(jīng)侵犯情況無顯著相關(guān)性，表明ASNS高表達(dá)者腫瘤的生物學(xué)行為更差，上述結(jié)果均提示ASNS可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮一定作用，也與先前的研究結(jié)果基本一致。基于上述研究結(jié)果，我們推測(cè)ASNS高表達(dá)在CRC中可能起促癌作用，ASNS有望成為CRC治療的潛在靶點(diǎn)。

ASNS是否在不同腫瘤中具有相似的生物學(xué)功能，且是否與患者預(yù)后緊密相關(guān)是一個(gè)值得關(guān)注的問題。GAN等[18]研究顯示，ASNS可以作為腎透明細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。另有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ASNS的表達(dá)水平與患者的腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ASNS陽性是乳腺癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立因素[19-20]。而在非實(shí)體腫瘤中，有研究發(fā)現(xiàn)在急性淋巴細(xì)胞白血病中，ASNS的表達(dá)水平往往較低[21]。本研究中ASNS高表達(dá)組患者相較于ASNS無-低表達(dá)組，其無病生存期顯著縮短，表明了ASNS高表達(dá)與CRC患者預(yù)后不良有關(guān)，與先前ASNS在實(shí)體腫瘤中提示不良預(yù)后的研究結(jié)果基本一致。

ASNS在腫瘤進(jìn)展中的調(diào)控作用為未來的腫瘤治療策略提供了新的視角。一方面可通過開發(fā)特異性的ASNS抑制劑干擾腫瘤細(xì)胞對(duì)天冬氨酸的合成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖，削弱其代謝適應(yīng)性和生存能力[22-25]；另一方面可采用聯(lián)合治療策略，將ASNS抑制劑與其他治療方法（如化療藥物或放療）相結(jié)合，可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果[6，14]。ASNS抑制劑可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而降低治療劑量和副作用。

綜上所述，ASNS在CRC患者腫瘤組織中呈高表達(dá)，且ASNS高表達(dá)與CRC的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后相關(guān)。未來的研究工作將進(jìn)一步探索ASNS在CRC中的作用機(jī)制，從而為CRC的防治提供新思路。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL28161）。所有試驗(yàn)過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：邢曉明、姚一凡、冉雯雯、趙涵參與了研究設(shè)計(jì)；姚一凡、李娜參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）