蓼屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析及比較特征

關鍵詞：蓼屬；葉綠體基因組；密碼子偏好性；比較特征；系統發育

蓼屬（Polygonum L.）是蓼科最大的屬，全世界約有230種，常見于北溫帶，我國約113種，其中23種為我國特有，分布于全國各省（自治區、直轄市）[1]。蓼屬植物與人們的日常生活有著密切聯系，它們大多具有減輕炎癥、緩解疼痛、化結減腫、收斂止瀉等作用[2]。同時，蓼屬植物在水土保持和污染防治方面發揮著重要作用[1，3‐4]。

植物葉綠體包含獨立的基因組，具有簡單的基因組結構和相對保守的遺傳特性。葉綠體基因組中rbcL、matK 和trnL～trnF 等基因序列被廣泛應用于植物系統發育研究[4]。近年來，隨著高通量測序技術的發展，NCBI數據庫收錄了越來越多植物葉綠體基因組信息，這有助于提高對植物系統發育和進化的理解[5]。

密碼子在核酸與蛋白質之間起連接作用，在遺傳信息的傳遞過程中起著至關重要的作用[6-8]。在物種長期進化和演變過程中，同一物種或者同一基因中會傾向于使用特定一種或幾種同義密碼子，這些密碼子被稱為最優密碼子，此現象被稱為密碼子偏好性[9]。研究密碼子的偏好性有助于優化密碼子，不僅能夠提高轉基因研究中外源序列的表達效率，還能促進物種進化[10-12]。目前，蓼屬植物葉綠體基因組的相關研究主要以科內個體縱向之間的系統發育研究為主[13-16]，缺乏不同種間密碼子使用偏好性的系統研究。

本研究以蓼屬28個種的葉綠體基因組數據為基礎，系統分析了蓼屬葉綠體基因組密碼子使用偏好性及其影響因素，進一步確定用于葉綠體基因工程的最佳密碼子，并基于同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）和rbcl、matk 基因序列比較蓼屬植物的系統發育關系。研究結果不僅為蓼屬植物的遺傳進化研究提供思路，也為種質資源開發利用和葉綠體基因工程研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 蓼屬葉綠體基因組序列的獲取

28份蓼屬植物葉綠體基因組原始數據來自NCBI 的GenBank 數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）。

1.2 蓼屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析

1.2.1 篩選序列 根據葉綠體基因組各基因的注釋信息獲得蛋白質編碼區（coding sequence，CDS），剔除長度lt;300 bp、ATG 作為起始密碼子、終止密碼子異常以及重復的序列，所得序列用于蓼屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析。

1.2.2 密碼子組成結構分析 通過軟件CodonW和Galaxy（https：//usegalaxy.org）在線分析平臺分析CDS的相關參數[17]，包括RSCU、密碼子適應指數（codon adaption index，CAI）、最優密碼子使用頻率（frequency of optimal codons，FOP）、有效密碼子數（effective number of codon，ENC），統計密碼子第1、2、3 位的GC 含量及GC 平均含量，分別記作GC1、GC2、GC3 和GCall。使用SPSS 軟件進行相關性分析，并通過集思慧遠生信云（Genepioneer）在線分析平臺[10]（http：//112.86.217.82：9929）進行繪圖。

1.2.3 中性繪圖分析 將（GC1+GC2）/2 的值（記作GC12）作為縱坐標、GC3 作為橫坐標繪制散點圖，并對回歸系數進行計算。通過回歸系數與1 的接近程度判斷密碼子偏好性的影響因素[18]。

1.2.4 PR2plot繪圖分析 將G3/（G3+C3）的比值作為橫坐標，A3/（A3+T3）的比值作為縱坐標進行繪圖，同時將A/T的比值為1、G/C的比值為1的位置作為中心點所在位置。比較各個基因位點與中心位點的分布判斷密碼子偏好性的影響因素[19]。

1.2.5 ENc-plot繪圖分析 將有效密碼子數ENC作為縱坐標、同義密碼子第3 堿基的GC 含量（GC3s）作為橫坐標來進行散點圖的繪制，通過各基因位點與標準曲線位置的比較來判斷密碼子偏好性的影響因素[20]。

1.2.6 最優密碼子的確定 將葉綠體各基因的ENC值進行排序后，選取前10％和后10％的基因序列分別組建高表達庫和低表達庫，計算RSCU的差值（ΔRSCU），同時滿足ΔRSCUgt;0.08和RSCUgt;1的密碼子為最優密碼子[21]。

1.3 蓼屬葉綠體基因組的比較分析

通過集思慧遠生信云（Genepioneer）在線分析平臺（http：//112.86.217.82：9929）對葉綠體基因組進行邊界差異比較分析并繪圖；用Perl語言[22]對序列處理后通過mVISTA[23]對葉綠體基因組進行序列比較并繪圖。

1.4 蓼屬系統發育分析

通過在線分析平臺GENE DENOVO（https：//www.omicshare.com），基于RSCU值對28個蓼屬植物進行聚類分析并繪制熱圖。利用軟件MEGA11基于葉綠體rbcl 和matk 基因序列采用最大似然法（maximum likelihood estimation，MLE）構建28 個蓼屬植物的系統發育樹[24]。

2 結果與分析

2.1 密碼子組成結構分析

CAI和FOP值的范圍均為0～1，越接近1說明偏好性越強，越接近0說明偏好性越弱。從表1可得，28 種蓼屬植物的CAI 在0.163～0.165，FOP 在0.350～0.354，平均值分別為0.164和0.351，即CAI和FOP值均較低，說明蓼屬植物葉綠體基因組密碼子的偏好性較弱。ENC值的范圍為20～61，越接近20說明偏好性越強，越接近61說明偏好性越弱，一般ENC 值小于35時，可認為偏好性較強。28種蓼屬植物的ENC為50.88～51.32，平均51.16，即ENC值均大于35，進一步說明蓼屬植物葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱。28種蓼屬植物密碼子的GC1、GC2、GC3 含量分別為45.64%～47.12%、37.67%～38.96%、30.96%～31.68%，平均為45.96%、37.80%、31.32%，即表現為GC3lt;GC2lt;GC1lt;50%，說明蓼屬葉綠體基因組密碼子主要以A和U結尾。

RSCU大于1的密碼子可稱為高頻密碼子，根據高頻密碼子可以判斷葉綠體基因組密碼子末尾堿基的使用偏好性。從圖1可得，蓼屬葉綠體基因組中高頻密碼子共計30個，除1個以G結尾外，其余均以A或U結尾，進一步說明蓼屬葉綠體基因組的密碼子主要以A或U結尾。

2.2 密碼子相關性和偏好性影響因素分析

根據蓼屬植物的生活周期，從28種蓼屬植物中選取8 種代表物種，分別為4 種1 年生蓼屬植物：扛板歸（P. perfoliata）、光蓼（P. glabra）、柔莖蓼（P. kawagoeana）、冰川蓼（P. glacialis）；4 種多年生蓼屬植物：兩棲蓼（P. amphibia）、火炭母（P.chinensis）、蠶繭草（P. japonica）、頭花蓼（P.capitata），進一步對這8種代表蓼屬植物葉綠體基因組序列的蛋白質編碼區進行密碼子相關性和偏好性影響因素分析以及葉綠體基因組的比較分析。

2.2.1 密碼子相關性分析 由圖2 和表2 可得，GC1、GC2與GCall呈極顯著正相關；GC3、GCall與GC3s呈極顯著正相關；GC3與GCall呈顯著正相關；GC1與GC2呈顯著正相關；GC3s、GC3與ENC呈顯著正相關。由此表明，蓼屬植物葉綠體基因組不同位置的堿基組成相似性較低，密碼子偏好性主要受第3位堿基組成的影響，葉綠體基因序列長度對堿基組成和密碼子偏好性影響較小。

2.2.2 中性繪圖分析 從圖3可得，絕大部分基因分布于對角線上方，僅有少部分基因沿對角線分布，斜率為0.255～0.363、R2為0.014～0.036，表明蓼屬植物葉綠體基因組不同位置的堿基含量存在顯著差異，GC12與GC3相關性較弱。突變對密碼子使用模式的影響占0.255～0.363，選擇壓力對密碼子使用模式的影響占0.745～0.637，即蓼屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性主要受選擇壓力的影響。

2.2.3 PR2-plot繪圖分析 從圖4可得，蓼屬植物葉綠體基因組在平面4個區域的分布不均勻，散點分別與中心線位置差異較大。水平線以下的散點數量大于水平線以上的散點數量，垂直線右側的散點數量大于垂直線左側的散點數量。由此表明，蓼屬植物葉綠體基因組第3位堿基的使用頻率表現為Tgt;A、Ggt;C，進一步印證了蓼屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性主要受選擇壓力的影響。

2.2.4 ENc-plot繪圖分析 從圖5可得，蓼屬植物葉綠體基因組的ENC 為35.34～55.83，GC3s 為21.30～37.90，散點大部分位于標準曲線下方，少數散點位于標準曲線上，即蓼屬植物葉綠體基因組的ENC實際值與預期值存在差異，且ENC實際值lt;ENC預期值。由此表明，蓼屬植物葉綠體基因組密碼子的使用模式同時受選擇壓力和突變2種因素的影響，且選擇壓力是主要影響因素。

2.2.5 最優密碼子分析 從表3可得，蓼科代表植物葉綠體基因組的最優密碼子數為15～19個，其中兩棲蓼和頭花蓼的最優密碼子數量最多；扛板歸和冰川蓼的最優密碼子數量最少。蓼屬植物葉綠體基因組的共有最優密碼子為GCU、CGU、UGU、GGU、AAA、CCU、UCU、GUA、GUU，且共有最優密碼子均以A/U結尾，進一步說明蓼屬葉綠體基因組的密碼子主要以A和U結尾。

2.3 蓼屬葉綠體基因組的比較分析

2.3.1 邊界比較分析 從圖6可得，冰川蓼、火炭母、頭花蓼的大單拷貝區（large single copy，LSC）和反向重復區B（inverted repeat region B，IRB）的連接位點（junction of LSC and IRB，JLB）均位于rps19 上，冰川蓼與頭花蓼的rps19 位于序列上端且在IRB上的長度均為143 bp，火炭母的rps19 位于序列下端且在IRB上的長度為108 bp，其余5種蓼屬植物的JLB均位于rpl22 與rps19 之間，光蓼、柔莖蓼、蠶繭草的rpl22 到JLB距離相等，扛板歸、光蓼、柔莖蓼、火炭母的rps19 至JLB距離相等。8種蓼屬植物的小單拷貝區（small single-copy，SSC）和IRB 區的連接位點（junction of SSC and IRB，JSB）均位于ndhF 上，除柔莖蓼和蠶繭草的ndhF在SSC的長度都為2 188 bp外，其余6種蓼屬植物的ndhF 在SSC 的長度均不相同，分別是2 180、2 510、2 175、2 186、2 184、2 206 bp，另外柔莖蓼、火炭母、蠶繭草的ycf1 至JSB距離相等。除頭花蓼的SSC 和反向重復區A（inverted repeat regionA，IRA）的連接位點（junction of SSC and IRA，JSA）位于ndhH 和ycf1 之間外， 其余7種蓼屬植物的JSA均位于rps15 和ycf1 之間，柔莖蓼、火炭母、蠶繭草至JSA距離相等。冰川蓼和火炭母的LSC和IRA 區的連接位點（junction of LSC and IRA，JLA）位于rpl2 與trnH 之間，頭花蓼的JLA 位于rps19，其余5 種蓼屬植物的JLA 均位于rps19 與trnH 之間，扛板歸、光蓼、柔莖蓼、蠶繭草的rps19至JLA距離相等，光蓼、柔莖蓼、兩棲蓼、蠶繭草的trnH 至JLA距離相等，冰川蓼與頭花蓼的trnH 至JLA距離相等。

2.3.2 序列比較分析 從圖7可得，光蓼、蠶繭草、抗板歸的葉綠體基因組序列變異程度不顯著，且在ndhB、psaA、psaB 等基因上均無變異性；兩棲蓼、火炭母、頭花蓼、冰川蓼、扛板歸的葉綠體基因組序列變異程度顯著，如trnK-UUU 和rps16 之間、trnCGCA和petN 之間。從整個序列來看，LSC和SSC變異位點較多，非編碼區的變異程度大于編碼區，蓼屬植物葉綠體基因組序列間存在明顯差異，表明葉綠體基因序列適合用于蓼屬植物進行分類鑒定。

2.4 蓼屬植物系統發育分析

基于葉綠體基因組的RSCU值對28種蓼屬植物進行聚類，結果（圖8）表明，將28種蓼屬植物分為3個類群，其中蓼藍單獨為一個類群；頭花蓼、火炭母、冰川蓼、刺蓼、扛板聚為一個類群；其余22種蓼屬植物聚為一個類群。同時將葉綠體基因組分成3大類。

分別基于matk 和rbcl 基因序列對28種蓼屬構建系統發育樹，結果（圖9）表明，2個發育樹結構相似，均將28種蓼屬植物劃分為3個類群，但各類群內部存在差異，如長戟葉蓼基于matk 序列時與蓼藍聚在一起，而基于rbcl 序列時則與叢枝蓼聚在一起。根據《中國植物志》[25]，可將28種蓼屬植物劃分為蓼組、頭狀蓼組、刺蓼組和柔莖蓼。基于matk 和rbcl 基因序列的系統發育樹與其存在差異。其中尼泊爾蓼、長戟葉蓼、蓼子草和蓼組聚為一類；兩棲蓼、刺蓼組和頭狀蓼組聚為一類；柔莖蓼與蓼組聚為一類。

綜上，基于RSCU 值和基于matk 和rbcl 基因序列的系統發育樹存在差異，這可能是由于堿基的插入、缺失或替換和非編碼序列的影響導致。

3 討論

本研究表明，28種蓼屬植物的CAI為0.163～0.165、FOP為0.350～0.354，ENC為50.88～51.32，說明蓼屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性較弱[26]，這與睡蓮屬[6]的研究結果相同。28 種蓼屬植物的GC1、GC2、GC3 含量分別為45.64％～47.12％ 、37.67％～38.96％、30.96％～31.68％，說明蓼屬植物葉綠體基因組密碼子主要以A或U結尾，這與茶樹[27]的研究結果基本一致。進一步對RSCU分析也表明，蓼屬葉綠體基因組密碼子主要以A或U結尾。相關性分析、中性繪圖分析、PR2-plot繪圖分析、ENc-plot繪圖分析均表明，蓼屬植物葉綠體基因組密碼子的偏好性主要受第3位堿基組成的影響，在第3位堿基密碼子中堿基的使用頻率表現為Tgt;A、Ggt;C，且密碼子偏好性主要受選擇壓力的影響，這與蒲桃屬[28]、油麥吊云杉[29]的研究結果一致。蓼屬植物共有的最優密碼子為GCU、CGU、UGU、GGU、AAA、CCU、UCU、GUA、GUU，進一步印證了蓼屬植物葉綠體基因組密碼子主要以A和U結尾，主要受第3位堿基組成和選擇壓力的影響，而突變和基因長度的影響較小。

葉綠體基因組序列適用于物種的分類鑒定[30-32]。本研究通過對蓼屬植物葉綠體基因組進行分析發現，不同蓼屬植物葉綠體基因組間存在較明顯的序列差異，且JLB、JSB、JSA和 JLA在葉綠體基因組序列上的位置也存在明顯差異，表明葉綠體基因序列適合用于蓼屬植物的分類鑒定。

基于RSCU值進行聚類分析，將28種蓼屬植物分為3個類群，同時將葉綠體基因組也分為3類，但與傳統的分組方式有所不同。分別基于matk 和rbcl 基因序列組建系統發育樹，結果與《中國植物志》[25]的分組存在差異，其中尼泊爾蓼、長戟葉蓼、蓼子草與蓼組聚為一類；兩棲蓼與刺蓼組和頭狀蓼組聚為一類；柔莖蓼與蓼組聚為一類。由于目前NCBI中的蓼屬植物葉綠體全基因組序列較少，蓼屬植物的遺傳進化有待進一步探索。基于RSCU值的系統發育樹與基于matk 和rbcl 基因序列的系統發育樹雖然存在一定差異，但對于大類的結果一致，進一步說明基于RSCU值對蓼屬植物進行進化分析具有一定的參考價值[33]，這與唐松屬[9]、苔蘚植物[34]的研究結果一致。

以上研究結果對蓼屬植物系統發育研究和分子遺傳育種具有重要參考價值，同時為蓼屬植物葉綠體基因組的遺傳變異研究和葉綠體基因工程提供了數據支持。