小麥花粉孔發(fā)育相關(guān)TaINP1基因鑒定及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：小麥；花粉孔發(fā)育；INP1 基因家族；表達(dá)模式；低溫

花粉在高等植物的有性生殖過(guò)程中扮演著傳遞雄性親本遺傳信息的核心角色，是植物遺傳、進(jìn)化、生殖等領(lǐng)域研究的關(guān)鍵對(duì)象[1-4]。花粉粒通常由2個(gè)保護(hù)層構(gòu)成：內(nèi)層與堅(jiān)固的外層。外層又可進(jìn)一步細(xì)分為內(nèi)、外2層，建立在底外層之上，由富含脂質(zhì)且高抗性的孢子花粉素組成。其中，沉積層對(duì)花粉表面孔徑的大小起決定性作用[5-8]。在不同物種間，花粉孔的大小、形狀、位置及數(shù)量均表現(xiàn)出顯著差異。作為外壁沉積層中的間隙，這些微小的孔徑對(duì)花粉的萌發(fā)至關(guān)重要[9‐10]。在谷類作物的花粉中，孔徑通常位于遠(yuǎn)端極點(diǎn)，形成單一的孔道，周圍環(huán)繞著凸起的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并被帽狀鰓蓋所覆蓋[11]。環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為外膜的凸起和增厚邊界，而鰓蓋則是由被稱為Zwischenk?rper的層所支撐的外膜孤立區(qū)域邊界[12]。在擬南芥中，花粉孔徑因子（INP1）通過(guò)促使質(zhì)膜靠近胼胝體壁來(lái)影響花粉孔的形成。這一過(guò)程不僅標(biāo)記了未來(lái)的孔位點(diǎn)，還防止了初壁的形成和孢粉質(zhì)的沉積[13‐14]。在水稻中，花粉孔形成缺陷OsDAF1 基因的分離和表征揭示了其在孔形成中的關(guān)鍵作用[15]。OsDAF1的缺失會(huì)導(dǎo)致花粉環(huán)面消失，進(jìn)而引發(fā)完全的雄性不育，OsDAF1蛋白定位于發(fā)育花粉中未來(lái)的孔位點(diǎn)，此外，OsDAF1與OsINP1共定位并直接相互作用。當(dāng)OsINP1 發(fā)生突變時(shí)，OsDAF1的極定位被破壞，導(dǎo)致整個(gè)孔徑消失，進(jìn)而引發(fā)雄性不育[16]。研究表明，編碼 STRUBBELIG受體家族8蛋白的OsSRF8 基因?qū)τ谒净ǚ劭椎男纬芍陵P(guān)重要，缺失功能性O(shè)sSRF8 的突變體表現(xiàn)出花粉孔徑質(zhì)膜突起和花粉孔徑形成缺陷；OsSRF8 在花藥發(fā)育早期特異性表達(dá)，最初彌漫分布在小孢子細(xì)胞中，在四分體階段，OsSRF8通過(guò)蛋白-蛋白相互作用被OsINP1募集到孔徑前區(qū)域，促進(jìn)花粉孔徑質(zhì)膜突起的形成[17]。上述研究結(jié)果為谷類物種花粉孔形成的調(diào)控機(jī)制提供了見(jiàn)解。

小麥（Triticum aestivum L.）是全球重要的糧食作物之一，其花粉孔徑形成的研究對(duì)于花粉萌發(fā)及授粉結(jié)實(shí)具有不可忽視的重要性[18]。然而，關(guān)于引導(dǎo)花粉孔開(kāi)閉的復(fù)雜過(guò)程在小麥中尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。鑒于此，本研究從花粉孔徑關(guān)鍵調(diào)控因子INP1 出發(fā)，利用小麥全基因組序列信息鑒定小麥TaINPI 基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用qPCR分析其在不同溫度處理下小麥花粉中表達(dá)模式，初步探究TaINP1 基因家族在小麥花粉孔徑開(kāi)閉過(guò)程中的作用，為研究小麥TaINP1 基因家族在花粉發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)，也為小麥分子育種遺傳改良提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料及數(shù)據(jù)來(lái)源

以常規(guī)小麥品種濟(jì)麥22 為試驗(yàn)材料，于2023年10月種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院小麥試驗(yàn)基地。從Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//plants.ensembl. org/index. html） 中下載小麥（Triticumaestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zeamays L.） 、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hordeum vulgare L.）和帕滕斯藻（Physcomitriumpatens L.）的相關(guān)數(shù)據(jù)，主要包括全基因組序列、CDS（coding sequence）序列、全蛋白質(zhì)序列以及基因組注釋信息。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù) （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上搜索小麥INP1 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到INP1 家族的pfam號(hào)：Ff14144；在pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其隱馬爾可夫模型。

1.2 小麥TaINP1 基因的鑒定

根據(jù)INP1 基因的隱馬爾可夫模型進(jìn)行HMM搜索及Clustal W 多序列比對(duì)，創(chuàng)建小麥INP1 基因家族特異性的隱馬爾可夫模型，進(jìn)行二次HMM搜索，篩選出Ｅ值lt;0.001的基因，將其對(duì)應(yīng)的蛋白序列提交至Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//smart.embl.de/）進(jìn)行再次確認(rèn)，去除不含INP1 結(jié)構(gòu)域或可信度較低的成員，得到小麥TaINP1 基因家族成員。

1.3 小麥TaINP1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MAGA 11軟件中的Clustal W功能對(duì)小麥、水稻、玉米、擬南芥、大麥共5個(gè)物種的INP1蛋白序列進(jìn)行了多序列比對(duì)。選擇NJ（neighborjoining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并設(shè)定Bootstrap校驗(yàn)參數(shù)為1 000，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，并借助在線網(wǎng)站Evolview （https：//evolgenius.info//evolview）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1.4 小麥TaINP1 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取TaINP1 基因編碼區(qū)上游2 000 bp 序列，并提交到PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）分析順式作用元件的種類和數(shù)量。采用ExPASY 預(yù)測(cè)TaINP1 基因家族成員的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量，通過(guò)Gpos-mPLoc在線網(wǎng)站（http： //www.csbio.sjtu.edu.Cn/ bioinf /Gpos-multi/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.5 小麥TaINP1 基因共線性關(guān)系

利用TBtools 軟件，對(duì)小麥TaINP1 基因組與水稻、擬南芥、玉米間進(jìn)行共線性分析，采用Circos軟件繪制詳細(xì)的共線性圖譜。

1.6 小麥TaINP1 基因網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)組織表達(dá)檢測(cè)

利用ExpVIP 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站 （https：//www.wheatexpression.com/）獲取小麥TaINP1 基因在不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，同時(shí)在WheatOmics 網(wǎng)站 （http：//wheatomics.sdau.edu.cn/） 查閱小麥TaINP1 基因在穗狀早期發(fā)育階段的具體表現(xiàn)。利用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖。

1.7 小麥材料處理及熒光定量檢測(cè)

在小麥抽穗中晚期，采集濟(jì)麥22的根、莖、葉以及穗樣品，迅速放入預(yù)先準(zhǔn)備好的錫箔紙中后，置于液氮中進(jìn)行速凍處理。選擇發(fā)育良好的小麥采集花粉，并置于4 ℃避光保存。由于小麥花粉的活性維持時(shí)間相對(duì)較短（0.5～3.0 h），需盡快進(jìn)行低溫轉(zhuǎn)化處理。采用優(yōu)化的DP419 試劑盒流程，對(duì)處理后的花粉、根、莖、葉及穗樣品高效提取RNA。隨后，利用RT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，設(shè)計(jì)特定引物（表1），利用ChamQ qPCR Mix 進(jìn)行qPCR。qPCR 程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及可視化處理。

1.8 花粉萌發(fā)及顯微鏡觀察

將上述取回的小麥花粉盡快進(jìn)行低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為6、8、10、12和25 ℃；轉(zhuǎn)化液為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20%蔗糖、10% PEG4000、40 mg·L?1 H3BO3、3×10?3 mol·L?1 Ca（NO3）2、10 mg·L?1VB1。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化30 min后，利用Leica光學(xué)顯微鏡（北京德耳斯儀器有限公司）觀察花粉的萌發(fā)狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.9 轉(zhuǎn)RFP 蛋白花粉激光共聚焦檢測(cè)

提取特定的RFP質(zhì)粒，將其與磁性納米顆粒（magnetic nanoparticle，MNP）在25 ℃下輕柔混合，并持續(xù)孵育20 min，使之形成穩(wěn)定而緊密的復(fù)合物（MNP-DNA），準(zhǔn)備具有活力的小麥花粉并加入適量轉(zhuǎn)化液，置于冰上10 min；將磁性納米顆粒和目的質(zhì)粒DNA的復(fù)合物與花粉和轉(zhuǎn)化液混合液混合，并分別在10 和25 ℃處理20 min，每隔10 min利用磁力攪拌器混合以促進(jìn)復(fù)合物與花粉細(xì)胞的充分接觸與內(nèi)化。待所有步驟結(jié)束，將處理后的樣品放置恒溫培養(yǎng)箱，在28 ℃避光培養(yǎng)18 h，并利用Leica TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）觀察紅色熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaINP1 基因的鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

在小麥基因組中共鑒定出53個(gè)TaINP1 基因家族成員（表2），它們編碼的蛋白序列長(zhǎng)度為198～573 aa，等電點(diǎn)為5.24～10.37，有32個(gè)表現(xiàn)為酸性特征，另有21個(gè)呈現(xiàn)堿性特征。所有TaINP1蛋白的總親水性指數(shù)在?0.647～?0.078，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)在43.61～70.75，均超過(guò)40，為穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)TaINP1蛋白定位于細(xì)胞核中，少數(shù)定位于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，表明細(xì)胞核可能是其發(fā)揮功能的主要場(chǎng)所。

2.2 小麥TaINP1 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建小麥與水稻、玉米、擬南芥、大麥、帕滕斯藻INP1 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖1 所示。將這6個(gè)物種共計(jì)126個(gè)INP1 基因劃分為4個(gè)Group。其中，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP4.1、TaINP4.4和TaINP1.1基因?qū)儆贕roup 4。TaINP3.2、TaINP3.7 和TaINP3.12 基因位于Group 4 的末端。在Group 1 中，小麥TaINP6.2、TaINP6.4、TaINP6.6 基因與水稻Os02t0661300-01基因位于同一分支，表明二者間親緣關(guān)系較近。每個(gè)Group 中都包含有擬南芥、水稻、玉米、大麥、帕滕斯藻的INP1 基因，說(shuō)明該家族基因在不同物種中比較保守。

2.3 小麥TaINP1 基因啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件

分析小麥TaINP1 基因啟動(dòng)子上游2.0 kb區(qū)域的順式作用元件，共鑒定出37 種順式作用元件（圖2），主要包括光響應(yīng)元件（light responsiveelements，LRE）、激素響應(yīng)元件（hormone responsiveelements，HRE）、組織特異性元件（tissue specificelements，TSE）和其他響應(yīng)元件（other responsiveelements，ORE）。植物激素、光和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件存在于所有TaINP1 基因的啟動(dòng)子區(qū)，其中包括脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）和赤霉素（gibberellin，GA）等激素的響應(yīng)元件。在小麥TaINP1 基因家族中，大多數(shù)成員都包含ABA響應(yīng)元件AB RE以及 MeJA響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif；每個(gè)TaINP1基因都包含1～6個(gè)響應(yīng)低溫、缺氧、干旱等脅迫的元件SRE；在組織特異性元件中有RY-element、CATbox和GCN4-motif等順式作用元件，分別與種子、分生組織和胚乳發(fā)育及休眠相關(guān)；在18個(gè)TaINP1基因的啟動(dòng)子中均由低溫響應(yīng)元件LTR；TaINP2.2、TaINP3.2、TaINP3.9 等基因還有TGACG-motif、ABRE、LTR、TGACG-motif順式作用元件，表明TaINP1 基因可能具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制和多種功能，能夠響應(yīng)多種內(nèi)、外信號(hào)，并參與多種生物學(xué)過(guò)程。

2.4 小麥TaINP1 基因共線性分析

共線性分析結(jié)果（圖3A）表明，共識(shí)別出10對(duì)共線性基因，表明這些基因?qū)赡茉从诨蚪M的大片段復(fù)制事件。TaINP1 基因在2、4、6、7 同源群染色體上保持了良好的共線性，表明這些區(qū)域在小麥屬不同物種間高度保守，其中3和7同源群染色體上展現(xiàn)出良好的共線性，推測(cè)這些區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了較少的重組或重排。同時(shí)，將小麥與擬南芥、水稻、玉米的INP1 基因進(jìn)行跨物種共線性分析，結(jié)果（圖3B）表明，小麥與水稻間的共線性關(guān)系優(yōu)于玉米，這表明小麥TaINP1 基因與水稻在序列上可能具有更高的同源性。

2.5 小麥TaINP1 基因數(shù)據(jù)庫(kù)表達(dá)模式分析

基于Wheatomics （WheatOmics sdau. edu. cn）和Wheat Expression Browser （https：//www. wheatexpression.com/） 在線數(shù)據(jù)庫(kù)，分析53 個(gè)小麥TaINP1 基因家族成員在不同組織及穗早期各發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，TaINP4.4、TaINP2.8 和TaINP3.14 基因在根和籽粒中特異性高表達(dá)，表達(dá)量為其他TaINP1 基因相對(duì)表達(dá)量的2 倍以上（圖4A）；TaINP2.2 和TaINP2.5 基因在根、莖、葉、籽粒、穗中表達(dá)量均較高，較其他TaINP1 基因高4倍（圖4B），表明它們可能參與小麥從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)整個(gè)生命周期的多個(gè)發(fā)育階段，意味著這2個(gè)基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能具有重要作用。TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP4.1 和TaINP4.6 在小麥穗的單棱期、二棱期、護(hù)穎分化期、小花分化期和雌雄蕊分化期均表達(dá)活躍，表達(dá)量最高達(dá)到30（圖4C），表明TaINP1是小麥穗部生長(zhǎng)及發(fā)育的重要因子。不同溫度處理下，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.12、TaINP4.1、TaINP4.6 等基因在4、12、23、27 ℃下的相對(duì)表達(dá)量高于其他基因（圖4D），表明這些基因在不同溫度條件下均保持較高的轉(zhuǎn)錄活性，可能在小麥生長(zhǎng)發(fā)育或環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.12、TaINP4.1、TaINP4.6 在多種組織及多種溫度處理下的表達(dá)量均較高。

2.6 小麥TaINP1 基因組織特異性和低溫表達(dá)模式分析

進(jìn)一步篩選出11個(gè)表達(dá)水平顯著較高的基因，包括TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.4、TaINP3.7、TaINP3.9、TaINP3.12、TaINP3.14及TaINP4.4。進(jìn)一步分析這11個(gè)TaINP1 基因在濟(jì)麥22號(hào)中的組織表達(dá)模式，結(jié)果（圖5）表明，在不同組織間，11個(gè)TaINP1 基因在穗部表達(dá)量幾乎都在1.0～2.0，與在線結(jié)果一致。TaINP3.2和TaINP3.7 基因在根、莖、葉及穗中的相對(duì)表達(dá)量均較高，表明它們?cè)谛←溦麄€(gè)發(fā)育過(guò)程中可能均發(fā)揮著重要作用。TaINP2.5 和TaINP3.14 基因在莖中的表達(dá)量最高，其中TaINP2.5 的相對(duì)表達(dá)量為3.5，表明它們可能與莖的伸長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)相關(guān)； TaINP2.2、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.7、TaINP3.12、TaINP3.9 基因在葉中的表達(dá)量最高，其中TaINP3.7 相對(duì)表達(dá)量最高，表明它們可能與光合作用及葉片發(fā)育緊密相關(guān)；TaINP3.4、TaINP4.1、TaINP4.4 基因在穗部表達(dá)量最高。

由圖6 可知，TaINP2.2、TaINP2.5、TaINP2.8、TaINP3.2、TaINP3.7、TaINP3.14、TaINP4.1、TaINP4.4 基因在25 ℃ 處理下的表達(dá)量最高；TaINP3.9、TaINP3.12 基因在10 ℃處理下的表達(dá)量最高；TaINP3.4 基因在6 ℃處理下的表達(dá)量最高。

2.7 花粉萌發(fā)及光學(xué)顯微觀察

為進(jìn)一步探究溫度對(duì)小麥花粉萌發(fā)效率的影響，將花粉轉(zhuǎn)化液分別于6、8 、10、12和 25 ℃轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30 min，對(duì)不同溫度處理的小麥花粉進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，結(jié)果（圖7）表明，隨著環(huán)境溫度的升高，小麥花粉萌發(fā)率呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明溫度是影響花粉萌發(fā)的關(guān)鍵因素之一。在10～12 ℃，花粉萌發(fā)率達(dá)到42.6%～50.0％，較25 ℃處理降低8％左右，而在6～8 ℃，花粉萌發(fā)率為31.0%～31.8%。由此表明，10～12 ℃是小麥花粉活性低溫保存的最佳條件。

2.8 RFP 基因花粉轉(zhuǎn)化及紅色熒光可視化檢測(cè)分析

由圖8可知，RFP 基因成功轉(zhuǎn)入小麥花粉中，轉(zhuǎn)化后的花粉不僅展現(xiàn)出良好的萌發(fā)與生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，且RFP 基因的熒光表達(dá)穩(wěn)定。進(jìn)一步對(duì)不同視野下熒光圖像深入分析發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)溫度下的花粉在熒光強(qiáng)度上存在差異，總體來(lái)說(shuō)10 ℃條件下檢測(cè)到的RFP紅色熒光信號(hào)較強(qiáng)，說(shuō)明在該溫度下含有RFP 基因的質(zhì)粒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化效率較高。

3 討論

本研究在小麥基因組中共鑒定到53 個(gè)TaINP1 基因，主要定位于細(xì)胞核，意味著這些基因主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，位于同一類群的基因成員可能擁有相似或相同的功能；共線性分析識(shí)別出33對(duì)具有共線性的基因，其中水稻中有9個(gè)INP1 基因與小麥TaINP1基因具有共線性關(guān)系，推斷它們可能起源于共同的祖先[19]。啟動(dòng)子上游區(qū)域的順式作用元件對(duì)于調(diào)控應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)起到至關(guān)重要的作用，并能增強(qiáng)植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件特異性結(jié)合，從而參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)等多種過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaINP1 基因的啟動(dòng)區(qū)域包含多種順式作用元件，其中包括植物激素、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件，這些原件作為種子休眠的主要調(diào)控因子，并涉及花發(fā)育、種子成熟等生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)能對(duì)生物和非生物脅迫作出響應(yīng)。其中RY-element、CAT-box 和GCN4_motif順式作用元件分別與種子、分生組織和胚乳發(fā)育相關(guān)，作為種子休眠的關(guān)鍵調(diào)控因子，能夠與ABA協(xié)同作用以延遲種子萌發(fā)[19-21]。

研究表明，OsINP1 和OsDAF1 是水稻APMP和花粉孔徑形成的重要調(diào)節(jié)因子[16]，STRUBBELIG 受體家族8 蛋白的禾本科特異性O(shè)sSRF8 基因?qū)τ谒净ǚ劭椎男纬芍陵P(guān)重要[17]。因此，小麥TaINP1 基因在小麥花發(fā)育和種子萌發(fā)中也扮演著關(guān)鍵角色。由于參與花發(fā)育的基因通常在植物的花器官中表達(dá)，其表達(dá)模式相當(dāng)復(fù)雜，涵蓋多個(gè)基因家族和不同的時(shí)期，這些基因在植物花器官中的表達(dá)模式既復(fù)雜又精細(xì)[16]，所以本研究進(jìn)一步分析了常規(guī)小麥種質(zhì)不同組織中TaINP1 基因的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，TaINP3.4、TaINP4.1 和TaINP4.4 基因在穗中高度表達(dá)，并且包含響應(yīng)種子休眠的順式作用元件DOG1 和bZIP superfamily，推測(cè)這些基因可能在小麥種子發(fā)育和休眠調(diào)控中起著重要作用。鑒于INP1 基因是花粉孔徑因子，本研究對(duì)小麥常規(guī)品種的成熟花粉進(jìn)行了表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TaINP2.5、TaINP3.2基因在花粉中顯著表達(dá)。同時(shí)，考慮到INP1 基因在小麥中可能與花粉孔開(kāi)閉有關(guān)，采用低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化并進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察花粉萌發(fā)狀態(tài)，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)10 ℃花粉轉(zhuǎn)化液處理后，花粉萌發(fā)狀態(tài)極佳。因此，10～12 ℃的處理可以視為較理想的條件，用于后期納米磁珠轉(zhuǎn)化的依據(jù)。為了后期研究TaINP1 基因和遺傳物質(zhì)的有效轉(zhuǎn)化，結(jié)合納米磁珠方法將RFP 報(bào)告基因轉(zhuǎn)入小麥花粉，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)這些花粉顆粒散發(fā)出明亮且均勻的紅色熒光，對(duì)于優(yōu)化低溫條件下的小麥高效遺傳轉(zhuǎn)化體系研究具有重要意義，而且為小麥分子改良開(kāi)辟了新途徑。該結(jié)果間接證明了小麥TaINP1 基因在10 ℃低溫下調(diào)控花粉孔的高效開(kāi)放，為小麥花粉納米磁珠遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中花粉的科學(xué)處理與保存提供了強(qiáng)有力的理論支持與實(shí)踐指導(dǎo)，對(duì)小麥TaINP1 基因遺傳轉(zhuǎn)化及納米磁珠轉(zhuǎn)化具有重要意義[22]。然而，關(guān)于小麥TaINP1 基因是否通過(guò)低溫表達(dá)調(diào)控花粉孔開(kāi)閉的直接證據(jù)還有待于進(jìn)一步深入研究。綜上所述，本文通過(guò)全基因組水平的基因家族鑒定及表達(dá)譜分析有效地篩選出了響應(yīng)的靶基因并預(yù)測(cè)基因功能。然而，關(guān)于TaINP1 基因在花粉孔徑及開(kāi)閉相關(guān)性方面的功能研究，仍有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。