煙草轉錄因子NtWRKY65在響應干旱脅迫中的功能研究

摘要：為研究轉錄因子NtWRKY65在煙草抵御干旱脅迫中的功能，探究NtWRKY65調控煙草干旱脅迫的生理分子機制，以NtWRKY65過表達轉基因株系（OE）和煙草栽培品種K326（WT）為試材，分析正常和干旱脅迫條件下OE株系和WT株系表型特征、相對電導率、根系活力、葉綠素含量、膜脂過氧化指標、激素含量、抗氧化防御系統酶活性以及關鍵基因的表達水平。結果表明，干旱脅迫處理后，OE株系的生長狀態較WT株系良好，生物量約是WT株系的1.5倍，OE-6株系的根系活力較WT株系增加21.53%，WT株系的葉綠素含量較OE-8、OE-11株系顯著降低31.06%、33.58%（Plt;0.05），OE株系的抗旱能力較WT株系明顯提高；與WT株系相比，OE株系的丙二醛含量、過氧化氫含量和超氧陰離子自由基含量顯著降低，并且OE株系的抗氧化酶活性顯著高于WT株系；脫落酸含量較WT株系顯著增加，ABA響應基因、應激相關基因以及干旱相關基因的表達水平均顯著高于WT株系。干旱脅迫下，過表達NtWRKY65可顯著提高OE株系的生物量和葉片含水率，增強植株葉片內活性氧（ROS）清除能力，提高煙草整體抗氧化防御能力，增強耐旱相關基因表達，促進ABA的合成，從而提高煙草的耐旱性，故轉錄因子NtWRKY65正調控煙草耐旱性。

關鍵詞：煙草；NtWRKY65；過表達；干旱脅迫；功能驗證

中圖分類號：S188；S572.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0225-08

收稿日期：2024-08-03

基金項目：河南省煙草公司三門峽市公司科技項目（編號：2024411200200016X、2023411200200008X）；河南省科技攻關項目（編號：242102110288）。

作者簡介：張亞萱（1999—），女，河北保定人，碩士研究生，主要研究方向煙草遺傳育種。E-mail：zhang1085204993@163.com。

通信作者：張小全，博士，教授，主要研究方向煙草遺傳育種。E-mail：zxq013415@163.com。

煙草是一種重要的經濟作物，長期處于干旱脅迫條件下會嚴重影響煙葉的產量和品質［1-3］。為了應對干旱脅迫，植物已在細胞層面、形態結構、生理過程、生化途徑和分子機制上進化出一系列復雜的適應性防御機制。其中，轉錄因子發揮著重要作用。在感知到干旱脅迫后，植物體內與干旱脅迫相關的轉錄因子被激活，通過與下游靶基因啟動子區域的順式作用元件結合，調節相關基因表達并進行信號轉導抵御，從而來提高植物對脅迫的抗性［4］。WRKY、bZIP、NAC、MYB、AP2/ERF等轉錄因子家族在植物抗逆方面被廣泛研究。胡雅丹等綜述了MYB轉錄因子家族響應鹽脅迫、干旱脅迫、極端溫度脅迫以及重金屬脅迫等的作用機制［5］；Li等的研究表明，NtNAC053參與煙草對鹽和干旱脅迫的響應［6］；Zhang等研究發現，CaNAC035能夠提高辣椒的耐旱性［7］。因此，挖掘煙草抗旱相關轉錄因子，對改善煙草的耐旱性具有重要意義。

WRKY轉錄因子家族是在植物界中普遍存在的一類轉錄調控蛋白，在介導植物的生長發育過程和響應生物與非生物脅迫防御反應中具有重要作用［8-9］。研究表明，WRKY廣泛參與調節植物干旱等逆境脅迫［10-12］，如蘋果中WRKY17、WRKY50和WRKY115能夠提高蘋果對干旱和鹽脅迫的耐受性［13-14］；SbWRKY30異源表達能夠增強擬南芥和水稻的抗旱性［15］；ZmWRKY40能夠正調控玉米抗旱性［16］。筆者所在實驗室前期研究發現，WRKY家族中有164個候選基因在煙草中均有表達，特別是WRKY65轉錄因子能夠在干旱、鹽和極端溫度脅迫中高表達，表明其可能參與煙草干旱脅迫響應［17］。通過研究發現，WRKY65轉錄因子屬于Ⅱ類WRKY家族成員，其典型特征是含有一個WRKY結構域和C2H2鋅指結構；亞細胞定位結果顯示，NtWRKY65-GFP融合蛋白僅定位于細胞核中；啟動子分析結果顯示，其包含脫落酸（ABRE）、低溫（LTR）、應激（TC-rich）等多種響應元件，表明NtWRKY65可能參與脅迫信號響應途徑；在干旱脅迫條件下，NtWRKY65基因表達量顯著升高［17］。通過構建pCAMBIA1305.1-WRKY65轉基因載體，并通過農桿菌介導的葉盤法轉化普通栽培煙草K326，獲得過表達NtWRKY65轉基因株系，經過篩選鑒定，獲得純合的穩定遺傳的T3代株系。WRKY轉錄因子廣泛響應干旱脅迫，但NtWRKY65對煙草耐旱性的機制尚不清晰。

本研究以煙草栽培品種K326（WT）和過表達NtWRKY65轉基因煙草（OE）為試驗材料，通過對各材料進行自然干旱脅迫處理和正常澆水對照處理，觀察表型特征變化并測定相關生理生化指標，以期探究煙草轉錄因子NtWRKY65在抵御干旱脅迫中的功能，為培育耐旱的煙草新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、時間及地點

本試驗所用的材料為普通栽培煙草品種K326（WT）和NtWRKY65過表達株系（OE-3、OE-6、OE-8、OE-11），由筆者所在實驗室保存。其中，OE株系是通過農桿菌介導的葉盤轉化法將構建的pCAMBIA1305.1-WRKY65轉基因載體轉入普通栽培煙草K326中后，經鑒定、篩選到獲得的純合穩定遺傳的T3代株系。本試驗于2023年3月初至2024年3月初在河南農業大學龍子湖校區煙草學院煙草遺傳育種實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物培養方法

將各材料的種子用牙簽直接點播在盛有營養土（基質 ∶蛭石體積比= 2 ∶1）的 10 cm×10 cm營養缽中，放入人工氣候培養箱內進行培養，并設置環境參數為光照持續16 h，溫度設置為28 ℃，黑暗持續8 h，溫度設置為26 ℃，相對含水量為（56±2）%。生長10 d后，選取生長狀態良好、大小一致的小苗轉移到盛有營養土（基質 ∶蛭石=2 ∶1）的7 cm×7 cm營養缽中，每缽定植1株。

1.2.2 干旱脅迫處理和取樣

煙苗生長45 d后，選取生長狀態良好、大小一致的煙苗，采用自然干旱的方法進行干旱脅迫處理，同時設置正常供水為對照處理。處理前將盛有不同材料的營養缽浸入 3 cm 水層中靜置8 h，在充分吸收水分后使其處于飽和狀態，此后干旱脅迫處理組不再澆水，對照處理組每天測定土壤水分并確保土壤含水率保持在75%～85%。

自然干旱處理10 d出現葉片變黃、萎蔫癥狀時，對照處理和干旱處理的不同材料各取3株，用于生物量、含水率的測定；選取不同處理材料各3株自上至下第3張葉片用于相對電導率測定和相關基因表達分析；選取不同處理材料自上至下第4張葉各3張用于抗逆酶和激素含量測定。

1.3 指標測定方法

1.3.1 表型指標

將WT株系和4個OE株系按順序依次擺放整齊，并置于黑布上拍照。對照處理和干旱處理的不同材料各取3株，經過去離子水徹底清洗干凈植株根系及葉片后，用吸水紙輕柔地吸干表面殘留的水分并稱重，用于生物量的測定。

1.3.2 生理指標

每個材料各選取3株，使用去離子水沖洗煙株地上部和地下部，吸干水分稱重，記為FW，在105 ℃烘箱中殺青并在65 ℃下烘至恒重，稱量干物質量值，記為DW，用于含水率的測定，每次測量重復3次。計算公式：含水率=（FW-DW）/FW×100%。分別選取不同處理材料各6株同一部位、同一朝向的煙葉，使用SPAD儀測定葉片葉綠素含量，每張葉片重復測定3次。使用直徑為0.5 cm的打孔器分別均勻打取8個孔，將其放在已加入5 mL蒸餾水的15 mL離心管中孵育，參照Xu等的方法［18］測定相對電導率。

抗逆酶參考李合生的方法［19］測定，丙二醛（MDA）含量通過硫代巴比妥酸法測定，過氧化氫（H2O2）含量通過碘化鉀還原法測定，超氧陰離子自由基（O-2·）含量采用羥胺氧化法測定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用核黃素-NBT法測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定。使用植物ABA ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）通過酶聯免疫法［20］測定脫落酸（ABA）含量。

1.3.3 相關基因表達量

取樣葉片經液氮凍干磨粉后，通過Trizol法［21］進行RNA的提取。確認樣品合格后，依照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（ABM公司）提供的說明進行反轉錄反應，得到cDNA。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）使用SYBR Green PCR Master Mix進行，以NtL25為內參基因，相對基因表達量采用2-△△CT方法計算。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2019進行試驗數據整理和

作圖，并通過SPSS 26.0軟件對數據進行單因素方差分析。采用鄧肯檢驗判斷差異顯著性（α=0.05）。數據以3次獨立試驗的平均值±標準差（x±s）表示。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對過表達NtWRKY65株系表型的影響

由圖1-A可知，處理10 d后，正常澆水的各株系在外觀特征上沒有明顯差異；干旱脅迫處理下，WT和OE株系均表現萎蔫，但WT株系萎蔫得更明顯，說明OE株系比WT株系抗旱能力強。由圖1-B可知，正常澆水處理的各株系整株生物量差異不顯著（Pgt;0.05）；干旱脅迫處理后，OE株系的整株生物量顯著高于WT株系，約是WT株系的1.5倍。

由圖1-C可知，正常澆水條件下，WT株系和OE株系含水率沒有顯著差異；干旱脅迫處理后，WT株系和OE株系含水率均有所下降，且WT株系的葉片含水率顯著低于OE株系，說明干旱脅迫后轉基因株系在一定程度上能夠相對增加葉片含水率。不同處理株系的相對電導率結果如圖1-D所示，可以看出，正常澆水的OE株系相對電導率顯著低于WT株系；干旱脅迫處理組OE株系相對電導率平均比WT株系低41.88%，其中OE-6株系的相對電導率較其他OE株系更高。

對各處理根系活力的檢測結果如圖1 -E所示，可以看出，正常澆水條件下，WT株系和OE-3、OE-6株系沒有顯著差異，OE-8和OE-11株系較WT株系顯著增加；干旱脅迫處理下，各株系的根系活力均有不同程度的升高，其中OE株系相較于WT株系表現出更為顯著的根系活力提升，OE-3根系活力增幅為13.24%，OE-6株系增幅為21.53%。

由圖1-F可以看出，各處理葉片葉綠素含量有較大差異。正常澆水條件下，除OE-11株系的葉綠素含量較低外，其他株系葉綠素含量沒有顯著差異；干旱處理條件下，WT株系的葉綠素含量較OE-8和OE-11株系分別顯著降低31.06%和33.58%，OE-3和OE-6株系的葉綠素含量與WT株系沒有顯著差異，但較WT株系的葉綠素含量有小幅增加。說明干旱脅迫下過表達NtWRKY65能夠提高轉基因煙草葉片中葉綠素含量。

2.2 干旱脅迫對NtWRKY65過表達株系葉片抗氧化性能的影響

2.2.1 對葉片中MDA含量的影響

植物膜脂過氧化過程中伴隨著MDA的積累，故MDA含量可以作為反映植物葉片細胞膜受損程度的一個重要指標［22］。由圖2-A可知，正常澆水條件下，WT株系的MDA含量顯著高于OE株系；干旱脅迫處理后，WT株系煙草葉片中MDA含量增加了105.93%，而OE株系平均升高了40.89%，且WT株系MDA含量顯著高于OE株系。表明過表達NtWRKY65能夠顯著減少干旱脅迫下轉基因煙草葉片中的MDA含量。

2.2.2 對葉片中H2O2和O-2·含量的影響

由圖 2-B可知，正常澆水條件下，WT株系H2O2含量顯著高于OE株系；干旱處理后，WT株系葉片中H2O2含量升高了80.59%，而OE株系平均升高了46.30%，WT株系增幅明顯高于OE株系。由圖 2-C 可知，正常澆水條件下，WT株系的O-2·含量與OE-3、OE-6株系沒有顯著差異，但顯著高于 OE-8 和OE-11株系；干旱處理后，WT株系葉片中O-2·含量大幅增加，達到對照處理的3.96倍，OE-3 葉片中O-2·含量較對照處理升高了 75.57%。表明過表達NtWRKY65能夠顯著降低干旱脅迫下轉基因煙草葉片中H2O2和O-2·的含量。

2.2.3 對葉片中抗氧化酶活性的影響

由圖2-D可知，正常澆水處理條件下，OE株系的SOD活性顯著高于WT株系；干旱脅迫處理下，各株系的SOD活性均表現出不同程度的升高，其中OE-3和 OE-8 株系的增幅大于WT株系。由圖2-E可知，正常澆水條件下，OE-11株系的POD活性顯著高于其他株系，且其他各株系POD活性間均沒有顯著差異；干旱脅迫處理后，各株系的POD活性大幅升高，且OE株系的平均POD活性是WT株系的1.31倍。由圖2-F可知，正常澆水條件下，OE株系CAT活性均顯著低于WT株系，干旱處理后OE株系的酶活性較對照分別升高了2.79倍、3.73倍、7.20倍和6.47倍，而WT株系的酶活性僅升高了1.38倍。結果表明，過表達NtWRKY65能夠提高抗氧化酶活性，增強轉基因株系在干旱脅迫下ROS清除能力，減少ROS的積累。

2.3 干旱脅迫對NtWRKY65過表達株系葉片中ABA含量的影響

由圖3可知，正常澆水條件下，OE株系的ABA含量均顯著高于WT株系； 干旱脅迫下，WT株系葉

片中ABA含量升高了15.25%，OE株系平均升高了38.35%。其中，OE-11株系葉片中ABA含量增幅較大，是對照處理的1.71倍。說明在受到干旱脅迫后，過表達NtWRKY65能夠提高轉基因株系葉片中ABA含量。

2.4 干旱脅迫對NtWRKY65過表達株系葉片中相關基因表達量的影響

2.4.1 對抗氧化相關基因表達量的影響

不同處理下抗氧化相關基因的相對表達量測定結果如圖 4-A、圖4-B、圖4-C所示，可以看出，在對照處理下，WT株系抗氧化相關基因的表達量均顯著低于OE株系；干旱脅迫處理后，OE株系的抗氧化相關基因的表達量大幅升高，其中OE-3株系的NtCAT1和NtSOD表達量分別是WT株系的9.72倍和5.28倍，OE-6和OE-8株系的NtAPX表達量大約是WT株系的7.5倍。說明干旱脅迫后，NtWRKY65通過提高抗氧化酶基因的表達，從而提高轉基因煙草抗氧化酶活性，提高其清除葉片中活性氧的能力，緩解葉片損傷。

2.4.2 對ABA相關基因表達量的影響

圖4-D、圖4-E、圖4-F為不同處理下ABA相關基因NtLTP、NtAREB1和NtDREB3基因的相對表達量測定結果。可以看出，對照處理下，WT株系的ABA相關基因表達量均低于OE株系；干旱脅迫處理后，OE株系ABA相關基因表達量均大幅升高，WT株系基因表達量雖有所升高，但仍明顯不如OE株系。對照處理下，各株系NtLTP、NtDREB3基因表達量均在10以下；干旱脅迫處理后，除OE-11株系外，各OE株系NtLTP基因表達量達到了60以上，除OE-6株系外，各OE株系NtDREB3基因表達量均達到55以上，而WT株系NtLTP基因表達量不到30，NtDREB3基因表達量仍在10以下。說明干旱脅迫下過表達NtWRKY65能夠激活ABA相關基因的表達。

2.4.3 對干旱應激相關基因表達量的影響

對煙草干旱脅迫應激相關基因NtLEA5、NtERD10c、NtCDPK2、NtTIP、NtCOR14a和NtDREB4的相對表達量進行測定，結果如圖5所示。可以看出，在對照處理下，各株系的6個基因相對表達量均明顯低于干旱脅迫下的表達量，WT株系各基因表達量均較低且顯著低于OE株系；干旱處理下，WT株系各基因相對表達量雖有上調，但上調幅度遠低于OE株系。OE-3株系受到干旱脅迫后，NtLEA5、NtERD10c、NtCDPK2、NtCOR15a基因上調幅度明顯高于WT株系。結果表明，過表達NtWRKY65能夠激活轉基因煙草葉片中干旱應激相關基因的表達。

3 結論與討論

作為高等植物中規模最為龐大的轉錄因子家族之一，WRKY轉錄因子家族在調控植物生長發育過程及抵御逆境脅迫中扮演著至關重要的角色。水稻、小麥、葡萄、陸地棉、苜蓿和番茄中的WRKY轉錄因子參與調控耐旱性的研究均有報道［23-28］，但NtWRKY65調控煙草耐旱性的研究相對有限。本研究發現，在干旱脅迫處理10 d后，過表達NtWRKY65轉基因株系表現出較為良好的生長狀態，葉片萎蔫程度顯著輕于WT株系，整株生物量較大，具有較高的葉片含水率和較低的相對電導率，說明過表達NtWRKY65能夠減小干旱脅迫對煙草生長發育造成的影響。根系活力的高低對植物吸收利用土壤中水分和營養元素等造成直接或間接的影響，是株系受到干旱脅迫后最先產生響應的部位［29-30］。測定不同株系根系活力后發現，干旱脅迫處理后，轉基因株系在受到干旱脅迫后，根系活力均顯著高于WT

株系，說明NtWRKY65能夠使轉基因株系在受到脅迫后能夠保持相對較高的根系活力，這可能是NtWRKY65能夠提高株系耐旱性的一個重要原因。

在受到干旱等逆境脅迫后，植物體內會積累過量的活性氧等物質，導致細胞膜脂發生過氧化，從而使細胞膜的結構和功能受損。抗氧化酶通過清除葉片中過剩的活性氧，在維持細胞正常生理功能中發揮關鍵作用［31］。本研究發現干旱脅迫處理后，與抗氧化過程相關的基因表達水平顯著上調，OE株系均顯著高于WT株系，測定抗氧化相關酶活性發現，OE株系抗氧化相關酶活性顯著高于WT株系，這與前人的研究結果［24-25，32］基本一致，表明干旱脅迫后，NtWRKY65可能促進抗氧化相關基因的表達上調，進而提高抗氧化酶活性，增強ROS的清除能力，減少干旱脅迫對株系造成的影響。干旱脅迫能夠使葉片中與脅迫相關基因表達發生改變，從而在分子水平上響應脅迫。OE株系干旱脅迫相關基因的表達顯著高于WT株系，表明NtWRKY65可能通過上調干旱脅迫相關基因的表達水平從而提高煙草對干旱脅迫的抗性。

前人已在多種植物中發現WRKY轉錄因子通過ABA信號通路參與干旱脅迫，ZmWRKY79通過與玉米原生質體中ZmAAO3基因啟動子特異性結合，促進ABA的生物合成從而提高玉米的抗旱性［33］。Liu等的研究結果表明，GmWRKY17直接與GmDREB1D和GmABA2的啟動子結合，并在干旱脅迫下激活他們的表達，增強大豆的耐旱性［34］。本研究發現，OE株系在干旱條件下比WT株系具有更高的ABA含量。進一步qRT-PCR研究發現，OE株系中參與脅迫相關的基因NtTIP、NtAREB1和NtDREB3顯著上調表達（圖5），該結果表明，NtWRKY65能夠調節轉基因煙草的耐旱性可能與ABA的合成有關。本研究對NtWRKY65提高轉基因煙草耐旱性的功能進行分析，并對其響應干旱脅迫的原因進行初探，但并未深入研究其作用途徑。李滿證明了NtWRKY65蛋白具有轉錄激活活性［35］，后續可通過轉錄組測序技術和染色質免疫沉淀測序技術尋找NtWRKY65的靶基因，并通過酵母單雜試驗和雙熒光素酶試驗等進行驗證。

在干旱脅迫下，過表達煙草轉錄因子NtWRKY65能夠降低葉片的相對電導率及MDA含量，上調抗氧化相關基因的表達，從而提高抗氧化酶活性，增強轉基因煙草抗氧化性能，提高ABA相關基因和應激相關基因表達，促進ABA的生物合成，增強轉基因煙草的耐旱性。NtWRKY65具有正調控煙草耐旱性的功能，可以作為煙草抗旱育種的候選基因資源。

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