谷子SiCDPK9基因的克隆、亞細胞定位與鹽脅迫下表達分析

摘要：雜種優勢是指雜交子1代（F1）在生物量、產量、適應性、抗逆性等性狀上優于雙親的現象，其廣泛使用使得玉米、高粱、水稻等作物產量實現大幅提升。近年來，谷子雜交種選育工作也取得較大進展，但關于雜種優勢形成的分子機制和調控網絡的研究尚不多見。SiCDPK9是前期通過轉錄組數據分析獲得的谷子產量性狀雜種優勢相關基因，為闡明其功能及其參與產量性狀雜種優勢形成的作用機制，本研究以谷子強優勢雜交種56229的幼穗為材料，克隆SiCDPK9基因，采用生物信息學方法分析其序列特征，并進行亞細胞定位分析，同時，利用實時熒光定量PCR技術檢測其在鹽脅迫處理下的表達模式。結果表明，SiCDPK9基因的開放閱讀框長度為1 749 bp，編碼582個氨基酸，具有典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域和EF-hand類鈣離子結合結構域；SiCDPK9為不穩定的親水性蛋白，分子質量為64.40 ku，理論等電點為9.08；SiCDPK9蛋白具有48個磷酸化位點和2個棕櫚酰化修飾位點，不含信號肽序列；SiCDPK9蛋白結構以α螺旋和無規則卷曲為主，定位于細胞膜；通過氨基酸序列比對與系統進化分析發現，SiCDPK9與水稻小穗育性相關基因OsCPK9的氨基酸序列相似性高、親緣關系近；外源NaCl處理后，SiCDPK9的表達水平先升后降。以上結果暗示SiCDPK9基因可能通過響應逆境脅迫而參與對谷子產量性狀雜種優勢形成的調控。

關鍵詞：谷子；雜種優勢；鈣依賴蛋白激酶；生物信息學分析；亞細胞定位

中圖分類號：S188；S515.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0178-08

收稿日期：2022-04-05

基金項目：河北省重點研發項目（編號：21326302D）；河北省農業科技成果轉化資金；唐山市應用基礎研究計劃（編號：20130218b）；唐山師范學院科學研究基金（編號：2020A06）。

作者簡介：崔燕嬌（1989—），女，河北灤縣人，博士，講師，主要從事谷子雜種優勢利用研究，E-mail：cuiyj189@163.com；共同第一作者，劉 丹（1989—），女，河北滄縣人，博士，副研究員，主要從事谷子雜種優勢利用和小麥遺傳育種研究，E-mail：dannieliu89@126.com。

通信作者：劉正理，教授，主要從事谷子雜種優勢利用研究。E-mail：liuzhengli65@126.com。

雜種優勢是指雜交子一代在生物量、產量、適應性、抗逆性等多種性狀上優于親本的生物學現象，在自然界中普遍存在。一個多世紀以來，雜種優勢已廣泛應用于玉米（Zea mays L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、水稻（Oryza sativa L.）等重要農作物的生產，促進此類農作物的產量提升和品質改良［1-3］。目前，雜種優勢利用在提高谷子［Setaria italica （L.） Beauv.］雜交種增產潛力方面也取得了一定成績，如張家口市農業科學院培育的張雜谷5號于2007年創造了12 150 kg/hm2的春谷高產紀錄［4］，唐山師范學院選育的冀雜谷5號于2016年創造了11 400 kg/hm2以上的夏谷高產新紀錄［5］。關于雜種優勢的遺傳基礎也有了一定研究，但其具體的分子機制和調控網絡仍不甚清晰，嚴重限制了谷子雜種優勢利用水平的進一步提高。

為了闡明雜種優勢形成的分子機理，近年來國內外研究人員通過分子標記、基因芯片、轉錄組學、蛋白質組學等技術對雜種優勢相關基因進行挖掘和鑒定。對擬南芥F1雜交后代的轉錄組學分析表明，其生物量雜種優勢與生物和非生物脅迫響應基因表達水平的下調有關，抑制脅迫響應基因的表達可以顯著提高其生物量雜種優勢［6-7］。對2個玉米雜交種ZD808、ZD909及其親本進行比較蛋白質組學分析，發現這2個雜交種的優良農藝性狀分別與一些脅迫響應和代謝功能相關蛋白、光合作用相關蛋白的高表達有關［8］。Li等對兩系超級雜交稻品種JLYHZ、LLYHZ及其親本進行轉錄組測序，篩選得到差異表達基因，功能富集分析表明這些基因主要富集在節律、對水分和低溫等生物和非生物脅迫的響應以及光合作用等途徑，這些基因可能在水稻雜種優勢形成中發揮關鍵作用［9］。這些研究結果表明，逆境脅迫響應基因可能參與雜種優勢的形成和調控，但其具體作用機制尚不清楚。

鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，簡稱CDPK）存在于原生生物、綠藻和植物中，作為一種鈣離子傳感蛋白，它能夠與細胞內重要的第二信使鈣離子結合，將化學信號轉化為動植物體內的一系列生理生化反應。CDPK蛋白由4個結構域構成，分別是N端的可變結構域、蛋白激酶結構域、自抑制連接區和C端用于結合鈣離子的類鈣調素結構域［10］。研究表明，CDPK在植物的生長發育、激素信號通路以及對生物和非生物脅迫的響應中發揮重要的調控作用。在植物中，CDPK由多基因家族編碼。目前，在擬南芥［11］、水稻［12-13］、小麥［14］、玉米［15］、大麥［16］等植物中已分別鑒定到34、31、20、40、27個CDPK基因。項目組在前期研究中鑒定到28個谷子CDPK基因家族成員［17］，但目前關于其功能分析和作用機制的研究十分有限。有報道表明，多數谷子CDPK基因的表達水平都受到干旱、極端溫度、ABA等非生物脅迫的誘導或抑制［18-19］，其中SiCDPK24基因的過表達能夠顯著提高轉基因擬南芥植株在干旱脅迫下的存活率以及抗旱性［18］；SiCDPK7基因是谷子對極端溫度脅迫的正向調節因子，該基因的過表達能夠明顯提高轉基因擬南芥和谷子植株對熱脅迫的耐受性［19］。除非生物脅迫外，谷子CDPK基因可能在生物脅迫響應中也發揮著重要的調控作用，如在接種黑粉菌后，SiCDPK基因的轉錄水平提高59.8%，說明該基因可能是谷子粒黑穗病的抗性基因［20］。

綜上，脅迫響應基因可能與雜種優勢的形成有關，而CDPK基因又參與植物抗逆過程的調控，因此，CDPK基因很可能是雜種優勢形成的重要調控因子。筆者所在項目組在前期研究中通過轉錄組測序，篩選到一個潛在的谷子產量性狀雜種優勢相關基因SiCDPK4，通過對其時空表達模式的分析，發現在灌漿期SiCDPK4基因在強優勢雜交種葉、穗中的表達水平顯著高于弱優勢、中優勢雜交種［17］，進一步證明CDPK基因在雜種優勢中的關鍵作用。SiCDPK9是前期轉錄組測序中篩選到的另一潛在的產量性狀雜種優勢相關基因，該基因在強優勢雜交種谷子幼穗中的表達水平顯著高于弱優勢、中優勢雜交種和常規品種。本研究以谷子強優勢雜交種56229的幼穗為材料，克隆到SiCDPK9基因，對其序列和進化特征進行分析，構建35S：SiCDPK9-GFP表達載體并瞬時轉化谷子原生質體，對其進行亞細胞定位分析，并通過鹽脅迫下的表達模式分析，初步探明SiCDPK9基因的功能及其參與谷子產量性狀雜種優勢形成的作用機制，以期為進一步提升我國谷子雜種優勢利用的研究水平、發揮谷子雜交種的增產潛力提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子強優勢雜交種56229和常規品種冀谷32由唐山師范學院谷子研究所保存。2018年6月將56229種植于唐山師范學院灤南谷子科研試驗站，并于8月孕穗期取長1.5～2.0 cm的幼穗為試驗材料，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，待提取RNA，用于SiCDPK9基因的克隆。2022年6月將冀谷32種植于唐山師范學院谷子研究所，并對4～5葉期的幼苗噴施50 mmol/L NaCl，分別取NaCl處理0、1、2、3、4、6 h的葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存，待提取RNA，用于SiCDPK9基因的表達模式分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 SiCDPK9基因的克隆 采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取谷子總RNA，利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116）合成cDNA，于-20 ℃冰箱中保存備用。在谷子產量性狀雜種優勢轉錄組數據中篩選獲得SiCDPK9基因（SETIT_034847mg）序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計全長擴增引物SiCDPK9-F（5′-GCAACAGCAACTCCAGGTA-3′）和SiCDPK9-R（5′-AGACAACCCTATCTCCATTCA-3′）。以谷子cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，退火溫度為60 ℃。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，與pEASY-Blunt Cloning Vector載體（北京全式金生物技術股份有限公司）連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態并培養，挑取經菌落PCR檢測的陽性克隆送測序。

1.2.2 SiCDPK9基因的生物信息學分析 使用NCBI網站的ORF Finder軟件查找SiCDPK9基因的開放閱讀框，并在DNAMAN軟件中推導出其氨基酸序列。利用ProtParam網站分析蛋白的理化性質，采用在線軟件ProtScale分析親疏水性，通過SignalP 5.0 Server對信號肽進行預測，利用SMART網站預測保守結構域，采用NetPhos 3.1在線工具預測磷酸化位點，利用GPS-Lipid網站對N-豆蒄酰化、棕櫚酰化位點進行預測，通過SOPMA數據庫對蛋白二級結構進行分析，利用SWISS-MODEL對蛋白三級結構進行同源建模。采用DNAMAN軟件將谷子SiCDPK9與水稻、高粱、玉米、小麥（Triticum aestivum L.）、二穗短柄草［Brachypodium distachyon （L.） Beauv.］、大麥（Hordeum vulgare L.）的CDPK氨基酸序列進行多重比對，利用MEGA 7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹（Bootstrap為1 000）。

1.2.3 SiCDPK9基因的表達分析 提取NaCl處理的谷子樣品總RNA，反轉錄合成cDNA。根據克隆的SiCDPK9基因序列，設計實時熒光定量PCR引物qRT-SiCDPK9-F（5′-GGCGATGAACAAGCTGAAGAA-3′）和qRT-SiCDPK9-R（5′-CGAACATGTCCCGGATCAC-3′），以谷子Actin（qRT-SiActin-F序列為GGATACTCTTTCACCACCTC；qRT-SiActin-R序列為ACCTCAGGGCACCTAAAC）作為內參基因，應用QuantStudioTM 6 Flex實時熒光定量PCR系統（美國Applied Biosystems公司）分析鹽脅迫下SiCDPK9基因的表達水平。反應體系按照天根生化科技（北京）有限公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（FP205）說明設置。反應程序為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，95 ℃ 15 s，共40個循環。每個處理設置3次生物學重復，按照2-ΔΔCT法計算SiCDPK9基因的相對表達量。

1.2.4 SiCDPK9基因的亞細胞定位 以SiCDPK9-pEASY-Blunt質粒為模板，設計引物SiCDPK9-HindⅢ-F（5′-CCCAAGCTTATGGGCAACGTGTGCTTCTG-3′）和SiCDPK9-SpeⅠ-R（5'-GGACTAGTGCGCGCCATGCCGA-3′）進行PCR擴增，去除SiCDPK9基因3′端終止密碼子，分別在上、下游引入HindⅢ和SpeⅠ酶切位點，同時將pCAMBIA1300-GFP載體質粒用HindⅢ和SpeⅠ雙酶切。將PCR擴增產物和酶切后的載體質粒目的片段回收，用T4 DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態，構建C端與GFP融合的35S：SiCDPK9-GFP表達載體，培養過夜后挑取經PCR檢測的陽性菌落送測序。參照Yoo等建立的方法［21］提取谷子原生質體，并在PEG介導下將融合載體質粒轉入原生質體，經暗培養后通過激光共聚焦顯微鏡觀察SiCDPK9的亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 谷子SiCDPK9基因的克隆

以谷子強優勢雜交種56229的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得SiCDPK9基因序列全長，測序結果表明，該基因開放閱讀框長度為1 749 bp，編碼582個氨基酸（圖1）。

2.2 SiCDPK9序列分析

2.2.1 SiCDPK9蛋白保守結構域分析 SMART在線程序分析結果顯示，SiCDPK9蛋白含有典型的CDPK蛋白保守結構域，N端具有絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域（位置109～367），C端具有4個 EF-hand 類鈣離子結合結構域（位置414～550）（圖2）。

2.2.2 SiCDPK9蛋白理化性質分析 ProtParam在線工具分析表明，SiCDPK9蛋白的分子式為C2 821H4 517N843O839S23，分子質量為64.40 ku，理論等電點為9.08，屬于堿性蛋白。該蛋白由20種氨基酸組成，其中色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）占比最低（1.0%），丙氨酸（Ala）占比最高（11.9%）。SiCDPK9蛋白不穩定指數為40.61，親水性平均值（GRAVY）為-0.473；ProtScale分析結果表明多肽鏈第56位的賴氨酸親水性最強，得分為-2.944，第300～302位的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸疏水性最強，得分為2.822，且整體親水性位點多于疏水性位點，推測該蛋白為不穩定的親水性蛋白（圖3）。

2.2.3 SiCDPK9蛋白信號肽和磷酸化位點預測 SignalP 5.0 Server軟件分析結果顯示，SiCDPK9蛋白不含信號肽序列和信號肽切割位點。NetPhos 3.1軟件預測結果表明，SiCDPK9蛋白有24個絲氨酸磷酸化位點，19個蘇氨酸磷酸化位點，5個酪氨酸磷酸化位點，共計48個磷酸化位點（圖4）。

2.2.4 SiCDPK9蛋白脂質修飾位點預測 采用GPS-Lipid在線工具對SiCDPK9蛋白的脂質修飾位點進行預測，發現其N末端第5位和第7位的Cys（MGNVCFCGTTST）為潛在的棕櫚酰化修飾位點。

2.2.5 SiCDPK9蛋白結構預測 SOPMA數據庫分析結果表明，SiCDPK9蛋白包含244個α螺旋、55個β轉角、59條延伸鏈、224個無規則卷曲，分別占總氨基酸的41.92%、9.45%、10.14%、38.49%（圖5-A），因此α螺旋和無規則卷曲是該蛋白二級結構的主要元件。 通過SWISS-MODEL在線軟件進

行同源建模，選取與SiCDPK9蛋白相似度最高的4ieb.1.A為模板，對其103～550位氨基酸進行三級結構的預測（圖5-B），總體來看，SiCDPK9蛋白三維結構與二級結構預測結果一致，均以α螺旋和

無規則卷曲為主。

2.2.6 SiCDPK9編碼的氨基酸序列比對及系統進化分析 將谷子SiCDPK9與NCBI網站上下載的其他6種禾本科植物CDPK的氨基酸序列進行比對（圖6-A），發現其與玉米ZmCPK9（XP_008644596.1）、高粱SbCDPK30（XP_002466648.1）的序列相似性最高，分別為90.97%、90.60%，與水稻OsCPK9（XP_015631324.1）、小麥TaCPK19-4B（ABY59015.1）、大麥HvCPK9（ASL69961.1）、二穗短柄草BdCDPK4（XP_003559564.1）的序列相似性均較高，分別為81.71%、81.26%、80.92%、80.03%，且都具有典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域和EF-hand類鈣離子結合結構域，表明其具備高度保守性。為了進一步研究這7個物種CDPK之間的系統進化關系，利用其氨基酸序列構建了系統發育樹（圖6-B），結果顯示這些CDPK被分為2組，SiCDPK9與同屬黍亞科的ZmCPK9、SbCDPK30以及稻亞科的OsCPK9聚為一組，同屬早熟禾亞科的TaCPK19、HvCPK9、BdCDPK4聚為一組，其中SiCDPK9與ZmCPK9、SbCDPK30親緣關系最近，這與多序列比對的結果以及物種的實際進化歷程一致。

2.3 SiCDPK9基因表達分析

為了研究SiCDPK9基因的功能和作用機制，對50 mmol/L NaCl處理后不同時間點的谷子葉片中SiCDPK9基因的表達模式進行分析。實時熒光定量PCR結果表明，在NaCl處理后，SiCDPK9基因的表達水平出現了先升后降的趨勢，約在處理后3 h達到峰值（圖7），說明其在植物對鹽脅迫的響應中發揮作用。

2.4 SiCDPK9亞細胞定位分析

利用基因重組技術，將去掉終止密碼子的SiCDPK9基因片段插入到pCAMBIA1300-GFP載體中，構建35S：SiCDPK9-GFP表達載體（圖8-A），并將其轉入谷子原生質體，通過激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的位置，發現在原生質體細胞膜上能夠觀察到明亮的綠色熒光信號，表明SiCDPK9蛋白定位于細胞膜（圖8-B）。

3 討論與結論

谷子作為一種重要的雜糧和飼料作物，在我國已有7 000多年的栽培歷史。但是，由于谷子主要分布在中國、印度等發展中國家，科研相對滯后，雜種優勢利用研究比較薄弱，在雜種優勢相關基因的挖掘和雜種優勢分子機理方面的研究更是缺乏。為了剖析谷子雜種優勢的分子機制，筆者所在項目組在前期研究中篩選到一個潛在的產量性狀雜種優勢相關基因SiCDPK9，本研究在谷子幼穗中克隆了SiCDPK9基因，對其編碼蛋白的理化性質、結構功能進行生物信息學分析，結果表明，SiCDPK9具有CDPK蛋白的基本特征，N端含有絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域，C端具有EF-hand類鈣離子結合結構域，屬于典型的CDPK家族蛋白，期待可為闡明SiCDPK9的功能及其在谷子產量性狀雜種優勢形成中的作用機制提供依據。

為了解析SiCDPK9的功能，本研究將谷子SiCDPK9與6種其他禾本科植物的CDPK蛋白進行同源性分析并構建系統發育樹，發現這些蛋白在序列和結構上非常保守，親緣關系較近，因而可能具有相似的生物學功能。研究表明，水稻OsCPK9基因的轉錄受到外源ABA、PEG-6000和鹽處理的誘導，OsCPK9可以通過促進氣孔關閉、提高植株的滲透調節能力，而促進植株抗旱性的提高［22］；小麥

TaCPK19基因響應高鹽和小麥白粉病菌侵染而上調表達［14］；在低溫、H2O2等脅迫條件下，二穗短柄草BdCDPK4基因的表達水平受到顯著的誘導或抑制［23］。由此推斷，谷子SiCDPK9可能也在對生物和非生物脅迫以及激素信號的響應中發揮著重要的調控作用，進而提高谷子對逆境條件的耐受性和抗旱耐瘠能力，提高谷子在逆境條件和干旱、瘠薄條件下的產量。本研究對NaCl處理后谷子中SiCDPK9基因表達的實時熒光定量PCR檢測結果也進一步支持了這一猜測，暗示對高鹽等環境脅迫應答的調控可能是SiCDPK9參與谷子產量性狀雜種優勢形成的關鍵機制。

蛋白質的亞細胞定位與其功能和作用機制密切相關，因此，為進一步明確SiCDPK9的功能，本研究利用PEG介導的原生質體瞬時轉化方法分析了SiCDPK9的亞細胞定位，結果顯示，SiCDPK9屬于膜

定位蛋白。當植株受到外界逆境脅迫時，CDPK蛋白作為一種鈣離子傳感器，可以將細胞中的鈣信號向下游組分傳遞，引起相關基因的表達，從而對環境脅迫作出響應。而外界刺激導致的細胞內鈣離子濃度的升高，主要依賴于鈣離子經質膜上的離子通道內流。因此，SiCDPK9在細胞膜的定位可能與其接收鈣信號，進而調控逆境脅迫響應的功能密切相關。研究表明，植物中CDPK蛋白的亞細胞定位具有多樣性，包括定位于細胞膜、細胞質、細胞核、內質網、脂質體、過氧化物酶體等［24-25］，其N端的可變結構域在蛋白的定位方面起重要作用。如擬南芥AtCPK2、水稻OsCPK2、番茄LeCPK1等多個膜定位的CDPK蛋白N末端均含有一段保守的MGXXXSXX序列（X代表任意氨基酸），使其被豆蒄酰化，促進蛋白的膜定位；此外，在豆蒄酰化修飾位點Gly殘基附近的Cys殘基可以被棕櫚酰化，進而增強蛋白的膜結合能力，使其穩定地錨定在脂雙層中［26-29］。因此，N末端的豆蒄酰化和棕櫚酰化修飾對于很多蛋白的膜定位是至關重要的。本研究利用GPS-Lipid在線工具對SiCDPK9的脂質修飾位點進行預測，結果顯示，SiCDPK9蛋白N末端第5位和第7位的Cys為潛在的棕櫚酰化修飾位點，據此推測N末端的棕櫚酰化修飾位點可能在其與細胞膜的結合中發揮著重要功能。

有研究發現，CDPK蛋白不僅在調控植物對逆境脅迫的應答中發揮功能，而且參與對作物產量性狀的調控。TaCPK34是小麥CDPK家族成員，其不僅參與對干旱脅迫響應的正向調控，而且其沉默植株的成熟籽粒在千粒質量、粒長、粒寬、淀粉含量等與產量密切相關的籽粒性狀方面均表現出了顯著的下降［30］。OsCPK18/OsCPK4是水稻免疫應答的負調節因子［31-32］，同時也是干旱和高鹽脅迫響應的正調節因子［33］。最近的研究還發現，OsCPK18的敲減株系對稻瘟病的抗性增強，并且表現出株高、分蘗數和千粒質量等產量相關性狀的顯著下降，而過表達植株則表現出相反的表型［34］，說明OsCPK18正向調控水稻植株高度和產量。另一水稻CDPK蛋白OsCPK9不僅能提高植株對干旱脅迫的耐受性，而且可以提高花粉活力，進而增加小穗育性，而小穗育性是水稻產量的重要組成部分［22］。同時，育性也是作物雜種優勢的重要性狀，本研究通過多重序列比對和系統進化分析，發現SiCDPK9與OsCPK9序列相似性高，親緣關系近，這也進一步支持了SiCDPK9在谷子產量性狀雜種優勢調控中的潛在作用。

綜上，SiCDPK9可能在逆境脅迫響應和產量性狀雜種優勢中均起著重要調控作用，而抗逆基因又與雜種優勢的產生有關，因此，推測SiCDPK9基因很可能是通過調控谷子對環境脅迫的響應而在產量性狀雜種優勢的形成和調控中發揮功能的，但其具體的功能和分子機制仍有待深入探究。

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