普通煙草NtARF2基因克隆及表達模式分析

摘要：為探究生長素響應因子NtARF2基因在調控煙草鉀的吸收和利用過程中的功能，將煙草K326 NtARF2的cDNA作為模板通過PCR反應進行克隆，利用生物信息學軟件分析其結構和功能，通過亞細胞定位技術判斷其表達位置，運用qRT-PCR等技術對NtARF2基因的表達模式進行研究。結果表明，NtARF2基因全長2 556 bp，可編碼851個氨基酸；NtARF2蛋白相對分子質量為94.528 05 ku；理論等電點為6.37，酸性；不穩定指數為55.11，屬于不穩定蛋白，并且不包含跨膜結構域；同源性和進化樹分析表明，煙草NtARF2與擬南芥AtARF2同源性和親緣性較高。亞細胞定位結果表明該蛋白是一個核蛋白；啟動子分析和不同脅迫（低鉀、高溫、干旱、低溫、高鹽）處理下的qRT-PCR結果顯示，NtARF2基因能夠響應低鉀、高溫、干旱和鹽脅迫反應，尤其是低鉀響應；進一步研究發現該基因具有組織表達特異性，且低鉀條件下煙株根、莖和葉片部位該基因表達量顯著降低，推測其參與了不同脅迫下鉀離子的吸收和再利用，且可能是一個負調控因子。

關鍵詞：普通煙草；NtARF2基因；基因克?。槐磉_模式；低鉀脅迫

中圖分類號：S188；S572.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0094-06

收稿日期：2023-12-22

基金項目：中國煙草總公司貴州省公司重點項目（編號：2022XM06）。

作者簡介：武博寒（2001—），女，碩士研究生，主要從事煙草生物技術研究。E-mail：18738852057@163.cm。

通信作者：賈宏昉，博士，副教授，主要從事煙草生物技術研究。E-mail：jiahongfang@126.com。

煙葉中的鉀含量是影響煙葉品質的關鍵因素之一，高含量的鉀不僅可以增強煙葉的燃燒性和減少焦油的產量，對提高香氣質和香氣量有很大幫助，并且有利于提高煙葉外觀和內在品質［1］。在我國，大多數煙草產區的煙葉鉀含量僅為1.5%，這一數值遠遠低于優質煙葉鉀含量（2%），因此，提高煙葉鉀含量是我國煙草行業發展亟需解決的問題。植物在受到低鉀脅迫時會誘導相關基因和蛋白表達，例如鉀調控轉錄因子（WRKY、GRAS等）、鉀轉運蛋白（HAK、KUP等），增強植物對鉀離子的吸收與利用［2-6］。同時也有研究表明，植物通過調控激素信號，改變根系構型，增加主根長度和側根數量，增加根系活力，以便從土壤中吸收更多的鉀元素［7］。植物激素中的生長素在調控植物鉀離子吸收過程中也發揮關鍵作用［8］。

ARF家族基因作為一類關鍵的轉錄因子，它們在轉錄過程中調節生長素響應基因的表達，從而參與生長素的信號傳遞路徑［9］。目前，對植物中的ARF基因家族的研究主要聚焦于擬南芥、水稻和番茄等作物，分別鑒定出23、25、21個，其中大部分成員的功能都與植物根、葉、花、果、種子的生長發育有關。如克魯夫等發現擬南芥AtARF2參與調控擬南芥種子和花大??；王德凱等發現在ARF7/19通過激活LBD/ASL基因的表達調控側根發育，且兩者之間存在功能冗余；劉松瑜等發現番茄SIARF12基因負調控番茄果實膨大；水稻OSARF1基因在調控植株的生長速率、葉片大小和植株矮化程度上起到了關鍵作用［10-16］。同時存在少部分成員參與植物逆境脅迫響應，如Bouzroud等發現通過運用CRISPR/Cas技術下調或喪失番茄SIARF4基因均能提高番茄對干旱和鹽脅迫的耐受性［17］；趙帥等發現AtARF2在低鉀條件下減輕了鉀轉運蛋白HAK5轉錄的抑制［18］；ZmARF2具有與玉米ZMHAK家族中的ZMHAK1啟動子區域結合的能力，并且能夠對玉米中鉀的吸收和利用進行調控［19］。

目前研究已發現煙草中有46個ARF家族成員存在，這些基因參與了煙草生長及生理代謝相關功能的調節，然而在煙草中，ARF家族基因對于鉀在煙草中吸收轉運過程中的作用機制尚不清楚。因此，克隆ARF家族的NtARF2基因，對其采用生物信息學軟件、qRT-PCR和亞細胞定位等多種技術進行系統分析，旨在進一步探究出NtARF2基因響應非生物脅迫的功能［20］。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為K326。將種子置于避光環境下萌發3 d，同時環境溫度設置為28 ℃，后將萌發的種子轉移至人工氣候箱內，培養箱內白天和夜晚的交替周期、光照度、溫度、相對濕度分別設置為 16 h—8 h（光—暗）、300 μmol/（m2·s）、28 ℃—22 ℃（光—暗）、60%。

具體操作方法：在種子露白后，先用1/4霍格蘭培養液（以下以正常營養液代稱）進行3 d的水培培養，再換為1/2正常營養液進行3 d的培養，最后換為正常培養液培養4 d，培養完成后對煙苗進行低鉀（0.1 mmol/L K+處理7 d）、高鹽（150 mmol/L NaCl處理7 d）、干旱（10%的PEG-6000處理7 d）、高溫（45 ℃處理6 h）和低溫（4 ℃處理3 h）處理。在處理完成之后，選擇3株生長狀態一致的煙苗，用蒸餾水進行清洗后，分別提取各樣品的根、莖和葉，用于檢測NtARF2基因在不同部位的相對表達量。

1.2 試驗時間與地點

試驗于2023年7月在河南農業大學煙草學院煙草營養高效育種實驗室進行。

1.3 目的基因克隆

對煙草葉片進行總RNA的提取，并對提取產物進行D260 nm/280 nm比值的測定判斷其純度，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳法對其進行分離和鑒定，后進行反轉錄獲得cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設計所需引物，以煙草葉片cDNA為模版，采用標準的 20 μL PCR反應體系（1 μL cDNA模板，上下游引物各1 μL，PCR mix 10 μL，7 μL ddH2O），反應條件：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，最后設置72 ℃保溫 5 min，克隆獲得全長基因后交由武漢伯遠公司負責測序驗證工作。

1.4 序列分析方法

通過BioEdit軟件進行NtARF2基因序列蛋白翻譯；通過NetPhos 2.0 Serve對NtARF2蛋白進行磷酸化位點預測；通過TMHMM 2.0線上預測NtARF2蛋白的跨膜結構域；通過DNAMAN將NtARF2與擬南芥、玉米、水稻等其他植物進行氨基酸序列比對；通過MEGA 6.0軟件對比NtARF2與其他物種ARF家族成員進行親緣關系分析以構建系統進化樹［21］。

1.5 啟動子分析

以煙草NtARF2基因全長序列為探針，使用Sol Genomics Network網站上的Blast工具進行基因全長序列的檢索，后選取起始密碼子上游長度為 2 000 bp 的序列，并將其提交到Plant CARE網站進行啟動子順式作用元件在線分析。

1.6 亞細胞定位分析

將無末端密碼子的NtARF2 cDNA融合到pBWA（V）HS載體中GFP基因的N末端，構建目的基因表達載體pBWA（V）HS-NtARF2-GLosgfp，采用注射法導入煙草葉片，用35S：：GFP對對照細胞進行同樣的轉化，轉化后在黑暗條件下25 ℃放置16 h。之后使用共聚焦顯微鏡對樣品進行檢測，觀察并記錄綠色熒光蛋白（GFP）信號的即時表達情況［22］。

1.7 基因表達分析

實時熒光定量qRT-PCR檢測嚴格按照試劑盒說明書操作，將GenBank：L18908.1-NtL25基因作為內參基因，試驗重復3次以確保數據真實可靠，使用公式2-ΔΔCT計算基因表達量。綜合數據與分析結果運用GraphPad作圖。

2 結果與分析

2.1 NtARF2基因的PCR擴增結果

由圖1可見，擴增條帶長度在2 000～3 000 bp 范圍內。進一步對克隆出的NtARF2基因進行測序分析，其全長2 556 bp，可編碼851個氨基酸，將其測序結果與NCBI上的NtARF2基因參考序列（XM_016621326.1）進行對比，發現兩者的核苷酸序列完全吻合，具有100%的相似性，這表明克隆得到的序列是NtARF2基因CDS序列。

2.2 NtARF2蛋白的理化性質及結構域預測結果

NtARF2可編碼851個氨基酸，分子式為 C4 134H6 478N1 184O1 294S33，分子量為94.528 05 ku，理論等電點（pI）為6.37，顯示該蛋白呈酸性；不穩定指數（Ⅱ）為55.11，屬于不穩定蛋白。對該蛋白結構域進行預測，其二級結構由4種不同組件構成，包括 α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲和β-折疊，各部分占比不同，分別為24.91%、19.51%、46.18%和9.40%。進一步對NtARF2蛋白序列進行分析，該

蛋白共包含72個絲氨酸、26個蘇氨酸和5個酪氨酸，推測以上一些位點可能會發生磷酸化。

2.3 NtARF2蛋白的氨基酸序列比對及系統發育分析結果

由圖2可知，煙草NtARF2與擬南芥AtARF2、玉米ZmARF2和水稻OsARF2的同源性分別為61.87%、25.32%和52.16%。利用MEGA分析其親緣關系，構建系統發育進化樹，結果（圖3）顯示，NtARF2與擬南芥AtARF2位于同一進化分支，同源性較高，推測兩者可能具有相似的功能。

2.4 NtARF2基因啟動子區域的順式作用元件分析結果

由圖4可知，除了包含啟動子所必需的 TATA-box和CAAT-box外，NtARF2啟動子區域還具有可以與生長素響應因子結合后調控生長素信號的元件，即TGA-element；同時存在多個與逆境脅迫響應相關的順式作用元件（LTR和MBS）以及與防御和應激響應相關元件（TC-rich repeats），這些元件有助于提高植物在脅迫中的抵抗力；此外還包含與植物激素脫落酸，茉莉酸甲酯相關元件（ARBE和MeJA）。

2.5 NtARF2蛋白的亞細胞定位結果

通過NtARF2蛋白的亞細胞定位結果（圖5）觀測到綠色熒光信號僅出現在細胞核中，并且與核定位標記蛋白的位置完全一樣，這一現象表明NtARF2蛋白為核蛋白。基于這一發現，推測NtARF2可能作為一個重要的轉錄因子，在基因表達調控中發揮關鍵作用。

2.6 NtARF2基因在不同非生物脅迫下的表達水平分析結果

為了解NtARF2基因在非生物脅迫條件下的反

應，以未經脅迫處理的植株為對照，觀測不同非生物脅迫下的NtARF2基因的表達水平，結果如圖6所示，NtARF2基因在低鉀、高溫、干旱和高鹽脅迫下的表達水平顯著低于對照，在低溫條件下，NtARF2的表達水平與對照之間無顯著差異（Pgt;0.05）。這表明NtARF2基因在煙草植株對低鉀、高溫、干旱和高鹽脅迫的反應中起到了關鍵作用，其中低鉀脅迫下NtARF2基因的表達水平與對照差異最為顯著。

2.7 低鉀脅迫下NtARF2基因的表達水平分析結果

為進一步研究NtARF2基因的表達特性，采用qRT-PCR技術檢測了NtARF2基因在低鉀處理（0.1 mmol/L K+）和正常供鉀條件（2 mmol/L K+，對照）下不同組織中的相對表達量（圖7）。正常供鉀和低鉀處理條件下的NtARF2基因在煙草的根、莖、葉中都有所表達，但在根和莖中的表達水平相對較高，葉片中略低，這表明NtARF2基因存在明顯的組織表達特異性。并且在低鉀脅迫處理下，煙草根、莖和葉中NtARF2基因的相對表達量明顯低于對照水平，推測該基因可在煙草中起到一個負調控的作用。

3 討論

本研究從煙草K326中克隆出NtARF2基因并鑒定分析了煙草NtARF2基因，該基因全長 2 556 bp，編碼851個氨基酸。通過生物信息學分析發現，NtARF2與其他植物中ARF蛋白氨基酸序列具有高度相似性，且與擬南芥AtARF2的親緣關系最近，推測二者在功能上有可能相似。

ARF基因在多種植物中發揮著至關重要的作用，它們不僅參與到相關植物激素響應中，而且還與植物應對非生物脅迫相關，這些基因的表達和調控對于植物的生長以及逆境生存具有非常重要的意義。高鹽和干旱條件下，番茄ARF4在脈管系統和氣孔中降低表達通過增加根生長和密度以及增加糖含量和葉綠素含量而提高對鹽和干旱的耐受性［24］。也有研究表明番茄ARF4能夠通過下調來改變植物生長、氣孔功能提高番茄對鹽度和滲透脅迫的耐受性［25］。ARF轉錄介導的生長素信號途徑能夠通過調控細胞分裂、伸長和分化來影響植物的生長發育［26］。植物在脅迫下會調控相關基因表達（轉錄因子）對此做出相應變化［27］。這一發現為深入理解轉錄因子如何精準調控下游基因表達的機制提供了有力的科學依據。

為了進一步研究NtARF2基因在不同非生物脅迫條件下的表達水平，本研究檢測了NtARF2基因在低鉀、低溫、干旱、高鹽和高溫脅迫條件下的表達水平，結果推測NtARF2基因參與了非生物脅迫鉀離子的吸收和再利用過程。通過進一步分析NtARF2基因在低鉀條件下的表達水平，發現該基因在低鉀條件下表達水平顯著降低，且不同部位表達水平也顯著不同，這也表明該基因在不同組織中的表達存在特異性。前人的研究表明，ARF家族成員可以調控下游的靶基因，參與各種生物與非生物脅迫［28］。趙帥等發現在擬南芥中，AtARF2基因可以通過調控下游HAK5基因的表達從而調控擬南芥對鉀的吸收與利用［18］。本研究發現，NtARF2基因在高溫和高鹽條件下，表達水平極顯著降低，故推測NtARF2基因在該條件下可能涉及到某些分子機理去應對脅迫。因此在接下來的研究中，可以通過構建突變體和過表達材料，酵母單雙雜和BiFC技術去確定NtARF2基因的下游靶基因，同時結合生理指標測定，明確NtARF2基因在高溫或者高鹽脅迫下如何調控鉀吸收與利用的調控機制。

4 結論

在煙草中克隆NtARF2基因，通過對NtARF2的同源性、蛋白質結構和亞細胞定位進行分析，發現該蛋白為核蛋白。啟動子分析和不同脅迫（低鉀、高溫、干旱、低溫、高鹽）處理下的qRT-PCR結果顯示，NtARF2基因能夠響應低鉀、高溫、干旱和鹽脅迫反應，尤其是低鉀響應；進一步研究發現該基因具有組織表達特異性，且低鉀條件下煙株根、莖和葉片部位該基因表達量顯著降低，推測其參與了不同脅迫下鉀離子的吸收和再利用，且可能是一個負調控因子。

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