水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因響應病原菌及外源激素的表達分析

劉茹燕，魏炳崢，占昭宏，等. 水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因響應病原菌及外源激素的表達分析［J］. 江蘇農業科學，2025，53（4）：64-72.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.04.008

水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因響應病原菌及外源激素的表達分析

劉茹燕， 魏炳崢， 占昭宏，

（海南大學熱帶農林學院/海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海南海口 570228）

摘要：為了解S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）在水稻逆境響應過程中的作用，首先分析了水稻中SAMS的家族成員SAM2（ZBS2）、SAM1、METK3、ZBS2L和SAM5的同源性及理化性質，其次分析了它們在水稻原生質體中的定位，最后分析了這些基因響應病原菌和植物激素的表達情況。試驗結果表明，SAMS蛋白具有高度同源性，在水稻細胞質、細胞膜和細胞核中均有表達。水稻白葉枯病菌侵染下調ZBS2、SAM5表達，增強METK3、SAM1、ZBS2L表達。外源激素處理也影響SAMS表達：其中乙烯下調所有SAMS表達；赤霉素增強METK3表達，但減弱SAM1、SAM5表達；水楊酸誘導METK3表達，但抑制ZBS2、SAM1、ZBS2L和SAM5表達；脫落酸抑制ZBS2、METK3表達。因此，SAMS家族成員可能調控水稻的抗性反應，但功能和機制存在差異。

關鍵詞：S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）基因家族；水稻；抗病響應；白葉枯病菌；外源激素；基因表達

中圖分類號：S435.111；S511.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0064-09

收稿日期：2025-01-07

基金項目：國家自然科學基金（編號：32460643）。

作者簡介：劉茹燕（1999—），女，江西撫州人，碩士研究生，主要從事植物與病原互作機制研究。E-mail：ruyanliu325@163.com。

通信作者：陶 均，博士，教授，主要從事植物與病原互作機制研究。E-mail：taoj2015@126.com。

作為世界主要糧食之一，水稻（Oryza sativa L.） 長期遭受生物和非生物脅迫。由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是嚴重的水稻病害［1］。在感知到病原體入侵時，植物會迅速激活一個復雜的植物激素信號網絡來進行防御。水楊酸 （SA） 介導植物對生物營養和半生物營養病原體的抗性，而茉莉酸 （JA） 則作用于對抗腐生性病原菌［1-2］。然而脫落酸 （ABA） 參與植物的防御機制尚未完全探究清楚，有研究表明，JA或ABA單一處理均可增強植物的抗性，但JA和ABA共處理下植物對于病原菌的防御效果不如JA或ABA單一處理有效［3-4］。乙烯 （ET） 在病原菌與植物的相互作用中具有雙重功能：一方面，它能夠促進病原菌的侵染；另一方面，ET也是高等植物抗病反應中的重要信號化合物，能夠調控植物的防御反應［5］。在高等植物中，ET合成以甲硫氨酸為前體，通過S-腺苷甲硫氨酸合成酶 （SAMS） 合成 S-腺苷甲硫氨酸 （SAM），然后轉化為1-氨基環丙基-1-羧酸 （ACC），最終通過ACC合成ET［6］。其中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶 （SAMS） 負責S-腺苷甲硫氨酸的合成，在植物響應外界脅迫過程中發揮重要作用。

SAM廣泛存在于生物體中，并參與多個生理生化過程。它不僅是ET和木質素的合成前體，還能夠響應環境脅迫［7-8］。SAM也可作為植物鐵載體的前體，參與植物體內鐵物質的運輸［9］。此外，經脫羧和轉氨丙基的作用下，SAM可生成亞精胺、精胺等多胺，參與細胞生長、凋亡等生理過程［10-12］。在植物受到病原體入侵時，部分多胺被多胺氧化酶 （PAO） 氧化分解，引起下游相關抗病基因和細胞死亡相關基因的表達，進而響應生物脅迫［13］。

SAMS也參與植物對外界脅迫的響應。外施ABA可降低番茄SAMS基因的表達［14］。野生大豆GsSAMS轉入水稻后，可提高水稻過氧化氫酶活性，進而增強水稻的耐鹽性［15］。缺鐵條件下可誘導擬南芥（Arabidopsis thaliana）根部2個SAMS基因AtSAM1和AtSAM2表達，導致ET產量增加［16］。此外，其他蛋白也可調控SAMS，影響SAM和ET含量［17-18］。在水稻中，F-box蛋白OsFBK12靶向降解OsSAMS1，影響ACC合成，進而調節葉片衰老和種子大小［19］。在不同植物中，SAMS的生理生化功能有所差異，如大麥HvSAM3可增強植物耐鹽性和耐旱性，擬南芥AtSAM3可促進花粉管的生長［20-21］。

在抗病方面，如SA、JA和ET等防御相關植物激素的生物合成可調控植物的抗病響應［22］。作為植物激素ET生物合成的副產物，氰化物可通過限制植物組織中病原菌的生長，進而增強植物對稻瘟病菌的抗性［23］。SAM1不僅通過多胺和H2O2增強番茄對堿脅迫的耐受性，也可增加ET含量，提高水稻抗稻瘟病的能力［24-25］。然而，不同物種所具有的SAMS基因種數有所不同，Ahmadizadeh等認為，水稻有6個SAMS基因［26］。但是，目前對于水稻中SAMS基因家族是否受外源激素調控、是否參與抗水稻白葉枯病仍不清楚。因此，本研究通過生信分析、水稻原生質體亞細胞定位、基因差異表達等分析探究水稻SAMS基因家族成員在水稻抗病及激素響應中的作用，為深入揭示該基因家族的調控功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料、菌株和質粒 試驗于2024年8—12月在海南大學海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室中進行。水稻TP309和ZH11為筆者所在實驗室種植并保存，水稻白葉枯病菌 PXO99A由筆者所在實驗室保存［27］，大腸桿菌DH5α購買于北京博邁德公司。本研究中所用質粒包括pRTVnGFP、ZBS2-GFP、SAM1-GFP、METK3-GFP、ZBS2L-GFP、SAM5-GFP。

1.1.2 引物 本研究所用引物由生工生物科技有限公司合成，如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻原生質體亞細胞定位 利用引物92osBifcF/R、SAMS1BiFcF/R、SAMS3BiFcF/R和SAMSlikeBiFcF/R分別擴增并純化回收目的基因ZBS2、SAM1、METK3、ZBS2L和SAM5。通過無縫克隆技術，將目的片段連接在KpnⅠ酶切后的水稻原生質體亞細胞定位相關載體pRTVnGFP上，獲得正確的重組載體菌株ZBS2-GFP、SAM1-GFP、METK3-GFP、ZBS2L-GFP和SAM5-GFP。利用天根生化科技（北京）有限公司的無內毒素質粒大提試劑盒提取重組質粒ZBS2-GFP、SAM1-GFP、METK3-GFP、ZBS2L-GFP和SAM5-GFP，并置于-20 ℃保存。

以水稻TP309幼苗為材料，參照PEG法制備水稻原生質體，并進行適當修改［28］。將剝殼消毒的水稻TP309種子置于1/2MS固體培養基（2.15 g/L MS、10 g/L蔗糖、8 g/L 瓊脂，pH值=5.8）中，暗培養12～14 d。將水稻莖切片后，先置于109.302 g/L 甘露醇中平衡10 min，然后浸于酶解液（109.3 g/L 甘露醇、1.9 g/L 2-嗎啉乙磺酸、3 g/L 纖維素酶RS、7.5 g/L 離析酶 R10、1 g/L 牛血清白蛋白、0.147 g/L CaCl2·2H2O和0.03% β-巰基乙醇） 50 r/min 下酶解3.5 h。利用篩網過濾溶液，獲得濾液，室溫下100 g離心5 min，棄上清。加入10 mL W5（0.391 g/L 2-嗎啉乙磺酸、 0.373 g/L KCl、 9 g/L NaCl和18.4 g/L CaCl2·2H2O）潤洗沉淀，再次離心去上清。最后加入2 mL MMG（109.302 g/L 甘露醇、3.05 g/L MgCl2·6H2O和0.781 g/L 2-嗎啉乙磺酸），重懸原生質體，并置于室溫暗處保存。

向100 μL原生質體懸浮液中加入10 μL的 0.5 g/L 質粒混合液（1 ∶1混合），輕搖混勻。然后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液（145.748 g/L 甘露醇，0.4 g/L 聚乙二醇4000和0.781 g/L CaCl2·2H2O），輕彈混勻，室溫暗處轉化15 min。加入440 μL

W5溶液，上下緩慢顛倒2次，室溫下100 g離心 5 min，棄上清。加入400 μL WI 溶液（109.302 g/L 甘露醇，0.298 g/L KCl和14.702 g/L 2-嗎啉乙磺酸），重懸原生質體，室溫培養12～16 h，置于激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.2 野生型水稻ZH11接種PXO99A 從-80 ℃冰箱中取出菌株PXO99A，并在PSA固體培養基（10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 蔗糖，1 g/L 谷氨酸鈉，15 g/L 瓊脂）上活化，28 ℃倒置培養2 d。用無菌槍頭挑取單克隆菌落接種于 5 mL PSA液體培養基（10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 蔗糖、1 g/L 谷氨酸鈉）中，28 ℃、200 r/min過夜培養。用滅菌ddH2O將菌液濃度調至D600 nm=1.0，通過剪葉法接種ddH2O、PXO99A于生長30 d且長勢一致的野生型水稻ZH11葉片上。接種0、1、8、48 h后分別剪取5 cm水稻葉片，裝于10 mL離心管中，液氮速凍，置于 -80 ℃ 保存。

1.2.3 野生型水稻ZH11激素處理 選取生長 30 d 且長勢一致的野生型水稻ZH11，分別噴施 150 mL/盆等體積的ddH2O、0.014 47 g/L乙烯利 （ETH）、0.034 64 g/L赤霉素 （GA）、0.013 81 g/L SA和0.026 43 g/L ABA 于水稻葉片上。為使激素附著于水稻葉片上，噴施液中各加入75 μL Silwet L-77。0、1、3 h后分別剪取5 cm水稻葉片，裝于10 mL離心管中，液氮速凍，置于-80 ℃保存。

1.2.4 RT-qPCR 利用購于艾科瑞公司的SteadyPure RNA提取試劑盒提取植物總RNA，并使用賽默飛世爾科技公司的RevertAid第1鏈cDNA合成試劑盒反轉錄獲取cDNA。然后，使用諾唯贊公司的模板示蹤型染料法定量PCR檢測試劑盒配制qPCR反應體系（所用引物見表1），分裝于96孔板中，封板并離心。置于美國伯樂公司的CFX Opus 96實時熒光定量PCR儀進行檢測分析，反應條件為：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火 30 s，循環40次。待擴增循環結束后，進入熔解曲線，即先升溫至95 ℃，15 s，再降溫至60 ℃，1 min，最后加熱升溫至95 ℃，15 s。最后，采用循環閾值法（CT值法，即2-ΔΔCT法）分析基因在不同處理下的相對表達水平。

1.2.5 水稻中SAMS的同源性分析 使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索并下載日本晴 （Oryza sativa Japonica Group） 中SAMS家族成員序列，運用DNAMAN軟件對它們進行氨基酸序列比對分析。借助MEGA 6 軟件對SAMS進行同源分析，構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 構建SAMS家族進化樹

SAMS對植物生長發育至關重要。本研究以水稻ZBS2的氨基酸序列為參考，發現水稻有多個SAMS基因，日本晴共有ZBS2、SAM1、METK3、ZBS2L、SAM5等5個SAMS基因。該結果與Ahmadizadeh等的研究結果［26］相似，區別在于本研究所鑒定的SAMS以SAM合成結構域為基本結構，不含此結構域的被排除在外。序列比對發現它們具有高度相似性，其高度保守區間位于N端（圖 1-A）。進化樹分析結果顯示，這5個蛋白大體分為2類：Ⅰ類包括 SAM1和METK3；Ⅱ類包括ZBS2、ZBS2L與SAM5（圖1-B）。

水稻SAMS的分子量在17.8～43.31 ku之間，等電點 （pI） 小于7，說明SAMS蛋白為酸性蛋白。此外，這5種蛋白的親疏水性均為負值且脂肪族指數偏高，說明它們具有親水性、可接受溫度范圍較寬。SAM5不穩定性指數Ⅱ為42.34，表明該蛋白不穩定（Ⅱ≥40），而其余蛋白均具有較好的穩定性（表2）。

2.2 SAMS蛋白定位位置

為確定SAMS蛋白在水稻細胞內的定位，筆者將目的片段ZBS2、SAM1、METK3、ZBS2L、SAM5與gfp序列融合的瞬時表達載體，轉化水稻原生質體，用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號。結果顯示，在轉入空載GFP的水稻細胞中，綠色熒光分布于整個細胞上。重組質粒ZBS2-GFP、SAM1-GFP、METK3-GFP、ZBS2L-GFP和SAM5-GFP轉入水稻細胞內，綠色熒光分布與空載GFP沒有明顯差異，表明這5種SAMS蛋白在水稻細胞中無特異性定位，均存在于細胞質、細胞膜和細胞核中（圖2），與其他生物中的SAMS定位相似［25，29］。

2.3 Xoo侵染改變水稻葉片SAMS基因的表達水平

利用Xoo菌株PXO99A侵染野生型水稻ZH11，分別于0、1、8、48 h后取樣，提取RNA，然后RT-qPCR分析SAMS基因表達變化（圖3）。與對照（接種水）相比，Xoo侵染顯著抑制了ZBS2基因的表達（圖3-A）。Xoo侵染1 h后幾乎檢測不到ZBS2的mRNA，8 h后雖然有所回升，但仍處于較低狀態，且一直低于對照。SAM1的mRNA水平僅在接種后 1 h 極顯著低于水處理，8 h與水處理相近，但在接

種后期極顯著高于水處理。這暗示Xoo侵染先抑制水稻SAM1表達，然后在侵染后期誘導該基因表達（圖3-B）。在0～48 h期間，Xoo侵染明顯上調了METK3表達（圖3-C）。ZBS2L的表達量顯著高于對照，僅在侵染8 h無顯著差異（圖3-D），說明Xoo侵染可誘導該基因表達。SAM5的RNA水平在侵染后均顯著低于對照，但隨著侵染時間的增加，差異性逐漸縮小，說明該基因表達受Xoo負調控。綜上所述，水稻中5個SAMS基因可能均參與水稻抗病響應，但各個基因的具體作用可能是不一樣的，有的可能正調控水稻抗性（如METK3、ZBS2L），有的可能負調控水稻抗性（如ZBS2、SAM5）。

2.4 ETH、GA、SA和ABA調控水稻SAMS基因表達

外源激素可通過調控植物體內部分基因的表達，進而影響酶活性，達到調節植物生長、耐受性等目的［30-31］。本研究采用同一濃度的ETH、GA、SA和ABA處理野生型水稻ZH11葉片，并通過 RT-qPCR 檢測了處理后不同時間點水稻葉片中SAMS基因表達的變化情況。

由圖4-A可知，在不同激素處理下ZBS2基因的表達變化表現出明顯的差異性。與水處理相比，ETH、SA和ABA處理降低了ZBS2的表達量。具體而言，ETH和ABA處理后ZBS2表達量隨著處理時間的推移而逐漸降低。但SA處理后ZBS2表達量變化不是特別明顯。GA處理后ZBS2轉錄水平呈現先增加后降低的特征。這表明ETH和ABA對ZBS2基因表達具有顯著的抑制作用，而GA可能在處理早期快速促進ZBS2的表達。ETH、GA和SA處理后SAM1表達量均顯著低于水處理，說明這些激素抑制了該基因的表達。但ABA處理下，SAM1基因在1 h表現出較高的表達量，隨后表達量逐漸下降，并顯著低于水處理組（圖4-B）。這一變化表明，ABA在調控SAM1基因的表達上可能具有一定的時效性。ETH和ABA處理顯著抑制了METK3表達，而GA和SA處理則顯著上調METK3表達（圖4-C）。該結果暗示，ETH和ABA可能通過抑制METK3的表達，干擾其相關的代謝途徑，而GA和SA則可能通過激活該基因的表達，促進其代謝產物的合成。由圖4-D分析可知，ETH和SA處理后ZBS2L基因的表達量明顯低于水處理；ABA處理后1 h該基因表達量顯著高于對照，隨后才逐漸降低；GA處理后ZBS2L的表達水平在初期顯著低于水處理，隨后逐漸上升，與ABA作用效果正好相反。ETH、GA和SA處理后SAM5基因表達量均顯著低于水處理。與水處理相比，在ABA處理后1 h時SAM5表達量較低，而在3 h后顯著高于水處理（圖4-E）。這表明ABA可顯著促進SAM5的表達，但響應速度較慢。綜上所述，不同外源激素（ETH、GA、SA、ABA）對水稻SAMS基因的表達均具有顯著的調控作用。

3 討論與結論

SAM在植物中參與多種重要生物途徑，包括ET和多胺等的生物合成、甲硫氨酸代謝、轉甲基化和轉硫化等［21，32］。作為植物體內合成SAM的關鍵酶，SAMS由一個多基因家族編碼，不同植物中的SAMS基因具有不同的表達模式，且其生理功能也存在差異。氨基酸多序列比對和系統進化樹分析（圖1）表明，水稻的ZBS2、SAM1、METK3、ZBS2L、SAM5蛋白具有高度的同源性，可能具有相似的生理生化功能。此外，這5種蛋白具有相似的理化性質，包括酸性、親水性強，以及較寬的適用溫度范圍等（表2）。ZBS2、SAM1、METK3、ZBS2L和SAM5在水稻細胞中并未表現出特異性定位，均存在于細胞質、細胞膜和細胞核中（圖2），這表明SAMS可能在細胞內的多個部位發揮著功能。

有研究表明，植物SAMS受外界脅迫因子調控，并在植物免疫反應中發揮作用。水稻矮縮病（rice dwarf virus，RDV） 侵染可誘導水稻SAM1基因的表達，增加SAM1蛋白含量，從而誘導誘導ET的合成，增強水稻感病性［33］。因此，ET通常被認為是促進植物感病性或加劇病害的信號分子。但是，針對不同病原物，同一個基因在免疫應答中的功能可能不同。例如，SAM1基因缺失同樣會削弱水稻對稻瘟病的抗性，但能增強水稻對矮縮病的抗性［25，33］。本試驗發現，接種Xoo后水稻ZBS2和SAM5基因的表達量明顯下調，METK3和ZBS2L的表達量明顯上調，SAM1表達量則先下調后上調（圖3）。這與RDV處理的結果較為一致，這表明ZBS2和SAM5可能通過激活與免疫反應相關的基因，增強水稻的免疫能力，而SAM1、METK3和ZBS2L則可能通過抑制免疫相關通路，削弱水稻的免疫能力，從而增加Xoo的侵染率。

作為植物免疫的重要調節因子，植物激素水平變化能夠調節免疫系統，保護植物免受病原菌侵害。病原菌與植物互作方式不同，導致不同激素對植物抗病性的影響也存在差異。在小麥中，ET的生物合成能夠增強其對小麥白粉病菌（Blumeria graminis）的抗性［34］。然而，OsEDR1基因的過表達雖然正調控ET合成，但會降低水稻對Xoo的防御能力［35］。此外，GA失活酶EUI負調控GA水平和水稻抗病性，說明GA可能抑制水稻抗病力［36］。SA通過上調煙草PR1a、PAL等抗病相關基因表達，從而增強煙草對煙草花葉病毒的抗性［37］。同時，SA激活的WRKY轉錄因子正調控植物對丁香假單胞桿菌的抗性，但負調控植物對灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性［38］。在擬南芥中，VQ1過表達提高植物ABA水平，增強植物抗病性［39］。然而，ABA的信號傳導也可負調控擬南芥的防御基因表達，削弱植物對黃瓜萎蔫菌的抗性，其中許多防御基因也受ET調控［40］。不同植物激素信號之間相互作用，介導植物脅迫反應。例如，GA通過降解DELLA蛋白來影響ET信號通路，SA可通過降低ACC和ACC合成

酶活性來減少植物ET的合成，ABA則可以抑制擬南芥ACS4和ACS8的轉錄來抑制ET的合成［41-45］。本研究發現，外源激素ET、SA和ABA能夠下調ZBS2的表達（圖4-A），表明這3種激素可能通過抑制ZBS2的表達，影響ET的合成。作為ET合成的正調控因子，SAM1的表達受到ET、GA和SA的負調控（圖4-B），這暗示ET、GA和SA可能通過抑制ET的合成，進而影響植物的抗病性［25］。此外，ET和ABA可負調控METK3的轉錄水平，而GA和SA則表現出相反的調控作用（圖4-C），這表明ET、ABA與GA、SA之間可能存在拮抗作用。同時，ET和SA通過抑制ZBS2L和SAM5的表達，從而影響植物的抗病性。

總之，外源激素能夠調控水稻SAMS基因的表達，影響植物ET的合成和抗病性。盡管這些結果為理解SAMS在水稻中的作用提供了重要的研究依據，但外源激素是否通過調控SAMS基因的表達來影響植物的免疫反應，仍需進一步的研究。

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