石莼多糖通過(guò)抑制黑色素合成降低蘋果炭疽葉枯菌分生孢子的侵染

摘要：炭疽葉枯病是蘋果生產(chǎn)上主要的早期落葉病，石莼多糖能提升蘋果對(duì)炭疽葉枯病的抗性。本研究通過(guò)室內(nèi)接種、孢子萌發(fā)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法探究石莼多糖對(duì)炭疽葉枯菌侵染的抑制作用及機(jī)制。結(jié)果表明，石莼多糖處理后接種和先接種后石莼多糖處理的蘋果葉片和果實(shí)的平均發(fā)病率分別為19.35%和18.50%，而對(duì)照和接種后24 h后再用石莼多糖處理的葉片和果實(shí)的平均發(fā)病率分別為36. 50%和46. 83%，病原菌侵入早期石莼多糖處理可降低炭疽葉枯病的發(fā)生率：石莼多糖促進(jìn)分生孢子芽管持續(xù)伸長(zhǎng)，不能形成黑化的附著胞，也不能形成有效的侵染釘；組織學(xué)觀察表明石莼多糖處理后的附著胞在葉片上僅部分形成侵染釘，但沒有進(jìn)一步發(fā)育和刺破寄主表皮細(xì)胞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明石莼多糖處理6、12、24 h時(shí)黑色素合成相關(guān)基因CfSCD相對(duì)表達(dá)量分別降至對(duì)照的18.2%、31.3%、47.6%。綜上，石莼多糖通過(guò)促進(jìn)炭疽葉枯菌分生孢子芽管生長(zhǎng)，減少附著胞的形成，抑制黑色素合成，從而降低分生孢子對(duì)寄主的侵染。本研究結(jié)果為石莼多糖在炭疽葉枯病防治中的應(yīng)用探明了方向，可為炭疽葉枯病的綠色防治提供技術(shù)途徑。

關(guān)鍵詞：石莼多糖：蘋果炭疽葉枯病；分生孢子；侵染；附著胞

中圖分類號(hào)：S436.611.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025） 03-0152-06

炭疽葉枯病是目前蘋果生產(chǎn)上主要的早期落葉病之一，造成‘嘎啦’、‘金冠’等感病蘋果品種的大量落葉，影響蘋果的品質(zhì)，降低產(chǎn)量。炭疽葉枯病的流行性極強(qiáng)，自2010年首次在江蘇、山東報(bào)道以來(lái)，呈逐年擴(kuò)散態(tài)勢(shì)，目前已擴(kuò)散到我國(guó)除云貴川外的蘋果產(chǎn)區(qū)，對(duì)蘋果生產(chǎn)影響巨大，導(dǎo)致感病品種的大面積減少。蘋果炭疽葉枯病由炭疽菌屬（Colletotrichum）的多種病原菌造成，病原菌寄主范圍廣，遺傳多樣性豐富，變異速度快。目前，炭疽葉枯病的防治主要靠化學(xué)藥劑，吡唑醚菌酯是生產(chǎn)上最有效的藥劑。但病原菌的抗藥性發(fā)展迅速，生產(chǎn)上已進(jìn)化出抗藥性菌株且所占比率急速上升，亟需替代藥來(lái)防治炭疽葉枯病。

石莼多糖是石莼屬綠藻的細(xì)胞壁多糖，約占綠藻干重的9%～36%，是一類含有硫酸根的酸性多糖，主要有鼠李糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和木糖。石莼多糖對(duì)生物體有豐富的生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血脂和調(diào)節(jié)免疫等。研究發(fā)現(xiàn)，石莼多糖能夠提升蘋果對(duì)炭疽葉枯病的抗性，還能促進(jìn)炭疽葉枯菌分生孢子萌發(fā)，抑制附著胞形成，降低炭疽葉枯病發(fā)生，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)室內(nèi)接種、孢子萌發(fā)和實(shí)時(shí)定量PCR方法探究石莼多糖提升蘋果對(duì)炭疽葉枯病抗性的組織學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制，以期為病害的綠色防控提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蘋果炭疽葉枯菌菌株GC20190701于2019年7月分離自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園，經(jīng)多基因聯(lián)合鑒定為Colletotrichum aenig-mo，-80℃保存。利用察氏培養(yǎng)基誘導(dǎo)炭疽葉枯菌分生孢子，接種菌絲塊后搖培3d，用4層滅菌紗布過(guò)濾，將濾液5 000 r/min離心5 min，用純水懸浮沉淀的孢子配制孢子懸浮液。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×105個(gè)/mL。孢子懸浮液隨配隨用。供試蘋果樹品種為‘嘎啦’，樹齡5年，栽植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)用果園，正常肥水管理，果園內(nèi)不噴施化學(xué)藥劑。供試石莼多糖純度為50%，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為C17J12Y138029。

1.2 石莼多糖對(duì)蘋果炭疽葉枯病發(fā)病的影響

采用分生孢子懸浮液人工接種離體組織的方法測(cè)定。設(shè)3個(gè)處理，T1：先接種孢子懸浮液，1h后噴施10 mg/mL石莼多糖溶液；T2：先噴施10mg/mL石莼多糖溶液，1h后接種孢子懸浮液；T3：先接種孢子懸浮液，保濕24 h后再噴施10mg/mL石莼多糖溶液。以僅接種孢子懸浮液為對(duì)照。分別接種于葉片、幼果和成熟果實(shí)，每處理3個(gè)重復(fù)。各處理樣品密封于保濕盒中并保持相對(duì)濕度100%，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種3d觀察葉片發(fā)病癥狀，接種Sd觀察果實(shí)發(fā)病癥狀，統(tǒng)計(jì)病斑數(shù)，測(cè)量病斑面積。

1.3 石莼多糖對(duì)蘋果炭疽葉枯菌分生孢子萌發(fā)及附著胞發(fā)育的影響

在分生孢子懸浮液中加入石莼多糖，使其最終濃度分別為5 mg/mL和10 mg/mL；以加入純水的分生孢子懸浮液為對(duì)照（CK）。將50μL配制好的分生孢子懸浮液滴在載玻片兩端，每端1個(gè)接種點(diǎn)，培養(yǎng)條件同1.2。每處理9個(gè)載玻片，分別于接種后6、12、24 h各取出3張載玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)及附著胞的形成，并計(jì)算孢子萌發(fā)率及附著胞黑化率。重復(fù)3次。

1.4 炭疽葉枯菌分生孢子侵染蘋果葉片的組織學(xué)觀察

設(shè)置先接種孢子懸浮液、th后噴施5 mg/mL石莼多糖溶液和先噴施5 mg/mL石莼多糖溶液、th后接種孢子懸浮液2個(gè)處理，以只接種分生孢子懸浮液的葉片為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件同1.2。培養(yǎng)24 h后取出葉片，用打孔器從每張葉片上隨機(jī)打取4個(gè)直徑10 mm的葉盤，浸入冰醋酸、酒精混合液（體積比3：1）中透明24 h。將透明葉盤取出，用蒸餾水沖洗后置于5% KOH溶液，水浴鍋中煮沸10～20 min使葉盤完全透明。用蒸餾水浸泡20 min，取出葉盤置于載玻片上，用兩張載玻片將上下表皮搓開，取有上表皮的玻片，滴加0.1%的甲基藍(lán)溶液染色10 min，經(jīng)蒸餾水漂洗脫色后以甘油作浮載劑在光學(xué)顯微鏡下觀察。重復(fù)3次。

1.5 炭疽葉枯菌黑色素合成相關(guān)基因表達(dá)分析

配制含10 mg/mL石莼多糖的分生孢子懸浮液，以純水的分生孢子懸浮液為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。將處理好的分生孢子懸浮液在25℃搖床180 r/min搖培，分別在培養(yǎng)0、6、12、24 h后取出，用滅菌紗布過(guò)濾后離心富集。利用柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒提取真菌總RNA;使用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）合成cDNA；在Light Cycler 96 System RealtimePCR儀（羅氏公司）上用Tap Pro Universal SYBRQpcr Master Mix系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，上述試劑均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。以alpha-tubulin基因作為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2019軟件和SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 石莼多糖對(duì)蘋果炭疽葉枯病發(fā)病的影響

由圖1可知，接種1h后石莼多糖處理（T1）和石莼多糖處理th后接種（T2）的葉片和果實(shí)平均發(fā)病率分別為18.50%和19.35%，而CK和接種24 h后再用石莼多糖處理（T3）的葉片和果實(shí)平均發(fā)病率分別為36.50%和46. 83%，后兩組的發(fā)病率顯著高于前兩組（P＜0.05），表明石莼多糖在病原菌侵入早期對(duì)蘋果炭疽葉枯菌分生孢子有明顯的抑制作用。但T3處理葉片和果實(shí)的發(fā)病率與CK沒有顯著差異，對(duì)分生孢子的侵入沒有明顯的抑制作用。以上結(jié)果表明，石莼多糖能在蘋果炭疽葉枯菌分生孢子侵入早期起到抑制作用，而當(dāng)分生孢子完成侵入后，石莼多糖對(duì)病原菌侵入后病害潛育和顯癥無(wú)明顯作用。

2.2 石莼多糖對(duì)蘋果炭疽葉枯菌分生孢子萌發(fā)及附著胞發(fā)育的影響

由圖2可見，分生孢子在濃度為5 mg/mL和10 mg/mL石莼多糖溶液中均能正常萌發(fā)，并且石莼多糖促進(jìn)了分生孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)，但抑制了附著胞內(nèi)黑色素的積累。接種6h后，CK及各處理?xiàng)l件下分生孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生芽管和附著胞，石莼多糖溶液處理下芽管的平均長(zhǎng)度大于對(duì)照組，對(duì)照組的分生孢子附著胞內(nèi)黑色素積累并開始黑化，但石莼多糖處理中附著胞內(nèi)未見明顯的黑色素積累；接種12 h和24 h后，對(duì)照組的分生孢子產(chǎn)生的附著胞內(nèi)黑色素持續(xù)積累，附著胞高度黑化，變成完全不透光的黑點(diǎn)：接種24 h時(shí)，對(duì)照組的附著胞中心出現(xiàn)一個(gè)氣泡狀亮點(diǎn)，為產(chǎn)生的侵染釘；但在5 mg/mL和10 mg/mL石莼多糖處理中，分生孢子在接種12 h和24 h后芽管持續(xù)伸長(zhǎng)，附著胞內(nèi)僅有少量黑色素積累，不能形成黑化的附著胞，也不能形成侵染釘。

2.3 炭疽葉枯菌分生孢子侵染蘋果葉片的組織學(xué)觀察

為了進(jìn)一步明確石莼多糖對(duì)病原菌分生孢子侵染的影響機(jī)制，采用組織學(xué)技術(shù)觀察分生孢子在蘋果葉片上的侵入。設(shè)置先接種后噴石莼多糖溶液和先噴石莼多糖溶液后接種兩個(gè)處理，培養(yǎng)24 h后觀察（圖3）發(fā)現(xiàn)，石莼多糖處理和對(duì)照的分生孢子都能萌發(fā)產(chǎn)生芽管和附著胞，并且附著胞內(nèi)都有黑色素積累，但對(duì)照組的分生孢子附著胞黑化程度較石莼多糖處理高：處理組附著胞形狀變化較大、不規(guī)則；對(duì)照組附著胞上有清晰的侵染釘，呈現(xiàn)氣泡狀，而石莼多糖處理組的分生孢子僅部分附著胞上有侵染釘，呈現(xiàn)黑點(diǎn)狀，沒有觀察到進(jìn)一步的發(fā)育和侵入到寄主表皮細(xì)胞的組織：先接種后噴石莼多糖和先噴石莼多糖后接種兩種處理間分生孢子附著胞形成和黑化沒有顯著差異。

2.4 石莼多糖處理對(duì)黑色素合成相關(guān)基因CfSCD表達(dá)的影響

為驗(yàn)證石莼多糖對(duì)黑色素合成的調(diào)控作用，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了CfSCD基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果（圖4）表明，對(duì)照處理中，CfSCD相對(duì)表達(dá)量在處理6h內(nèi)迅速升高，至12 h顯著下降，之后又緩慢上升；石莼多糖處理中，CjSCD的表達(dá)較對(duì)照受到較大程度的抑制，6h時(shí)降至對(duì)照的18.2%，12 h時(shí)降至對(duì)照的31.3%，24 h時(shí)降至對(duì)照的47.6%。在石莼多糖處理樣品中，CfSCD表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)增加緩慢，在6h至12 h之間增加不顯著。

3 討論與結(jié)論

蘋果炭疽葉枯病是由炭疽菌屬（ColLetotri-chum spp.）病原菌引起的流行性非常強(qiáng)的早期落葉病，生產(chǎn)上以化學(xué)防治為主，但由于病害潛育期短，防治窗口期較短。吡唑醚菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對(duì)炭疽葉枯病防治效果較好，但炭疽葉枯菌容易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，目前生產(chǎn)上已經(jīng)出現(xiàn)了高比例的抗藥性菌株。因此，亟需尋找吡唑醚菌酯的替代藥劑以制定更合理的炭疽葉枯病防控方案。

綠藻含有豐富的多糖物質(zhì)，是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)海藻之一。石莼多糖是綠藻水溶性硫酸多糖，在生物材料學(xué)、抗病毒、抗氧化、抗高血脂、免疫刺激和功能性食品等方面有廣闊的應(yīng)用前景。有報(bào)道表明，石莼多糖能提高寄主對(duì)炭疽葉枯病的抗性，影響炭疽葉枯菌分生孢子的早期侵染結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，在分生孢子侵入早期，石莼多糖能顯著降低炭疽葉枯菌分生孢子對(duì)嘎啦蘋果葉片的侵染，葉片和果實(shí)上葉枯病的抑制率平均達(dá)50%以上，但石莼多糖并不影響分生孢子的萌發(fā)，反而刺激芽管的伸長(zhǎng)，減少附著胞形成，抑制黑色素積累，可能是因?yàn)槭欢嗵钦T導(dǎo)病原菌將能量主要應(yīng)用于促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)的生理活動(dòng)，降低了黑色素合成過(guò)程能量分配，進(jìn)而影響了黑色素的合成。

侵染葉片是炭疽葉枯菌等真菌典型的直接侵入方式。分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，在芽管頂端形成附著胞，隨著黑色素積累，附著胞黑化。在與寄主的接觸點(diǎn)，黑化附著胞產(chǎn)生侵染釘，作為侵入結(jié)構(gòu)穿透寄主表皮細(xì)胞，隨后病原菌產(chǎn)生染囊泡和初級(jí)菌絲，與寄主建立寄生關(guān)系。附著胞內(nèi)黑色素積累對(duì)病原菌完成侵染至關(guān)重要，侵染釘侵入寄主細(xì)胞需要極大的壓力，附著胞黑化后才能承受侵入過(guò)程的膨壓。本研究組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，石莼多糖處理后附著胞不能形成有效的侵染釘，未能穿透寄主表皮細(xì)胞。因此，石莼多糖抑制了黑色素的積累，導(dǎo)致病原菌不能成功侵入寄主。

CfSCD基因是黑色素合成相關(guān)基因之一，該基因缺失后黑色素不能合成。本研究對(duì)CfSCD的表達(dá)進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明石莼多糖處理后CfSCD基因的表達(dá)量較對(duì)照明顯降低，暗示石莼多糖通過(guò)抑制黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)抑制黑色素的合成。本研究還發(fā)現(xiàn)在接種24 h后，分生孢子完成侵染，再用石莼多糖處理，并不能抑制炭疽葉枯病的發(fā)生，間接表明病原菌侵染成功后石莼多糖不能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生顯著的抗病性。

綜上，石莼多糖通過(guò)促進(jìn)分生孢子芽管生長(zhǎng)減少附著胞的形成、抑制黑色素合成，降低分生孢子對(duì)寄主的侵染。本研究結(jié)果為石莼多糖在炭疽葉枯病防治中的應(yīng)用探明了方向，可為炭疽葉枯病的綠色防治提供技術(shù)途徑。

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023YFD1401404）；國(guó)家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS - 27）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2020MC114）