黃花白及多倍體種質創制研究

摘""要：本研究以黃花白及（Bletilla"ochracea"Schltr.）種子為誘變材料，采用不同濃度秋水仙素溶液和不同處理時間進行多倍體誘導處理，以期找到誘導黃花白及多倍體植株的試驗條件。結果表明：以0.25%秋水仙素溶液浸泡黃花白及種子6"d為誘導黃花白及四倍體的最佳方式，可獲得較高的種子存活率和誘導率，其中種子存活率為35.66%，誘導率為45%。從形態學方面觀察，四倍體植株平均高度、葉數、葉寬、莖粗、塊莖、根長和根粗均大于二倍體植株，并且四倍體植株氣孔明顯變大，氣孔密度降低。本研究創制的黃花白及四倍體新種質將為黃花白及等藥用蘭科植物的遺傳性狀的改良提供技術參考和研究材料。

關鍵詞：黃花白及；多倍體；秋水仙素；流式細胞術；染色體計數中圖分類號：S326""""""文獻標志碼：A

Polyploid"Germplasm"Induction"of"Bletilla"ochracea"Schltr.

HE"Jiamin1，2，"ZHENG"Sujin2，3，"ZENG"Xinhua2，3，"LUO"Shaofan2，"LAN"Siren1，"HUANG"Weichang1，2，3*

1."College"of"Landscape"Architecture，"Fujian"Agriculture"and"Forestry"University，"Fuzhou，"Fujian"350002，"China;"2.nbsp;Shanghai"Chenshan"Botanical"Garden"/"Eastern"China"Conservation"Centre"for"Wild"Endangered"Plant"Resources，"Shanghai"201602，"China;"3."Shanghai"Chenshan"Botanical"Garden"/"Shanghai"Key"Laboratory"of"Plant"Functional"Genomics"and"Resources，"Shanghai"201602，"China

Abstract："To"generate"polyploid"B."ochracea"Schltr"and"find"out"the"optimal"induction"condition，"the"seeds"of"diploid"B."ochracea"were"treated"with"different"concentration"of"colchicine"solution"under"a"range"of"treatment"time."The"results"of"the"study"suggested"that"the"seeds"treated"with"0.25%"colchicine"solution"for"six"days"was"effective"in"polyploid"induction"for"B."ochracea，"with"a"35.66%"survival"rate"of"treated"seeds"and"a"45%"induction"rate."The"tetraploid"gave"a"significant"enhancement"on"various"agronomic"traits，"including"plant"height，"leaf"number，"leaf"width，"stem"diameter，"bulb"length"and"root"diameter."In"addition，"tetraploid"B."ochracea"showed"increased"stomatal"aperture"and"decreased"stomatal"density."The"tetraploid"B."ochracea"was"generated"in"this"study，"which"would"provide"technical"support"and"basic"material"for"improving"the"genetic"traits"of"medicinal"orchids.

Keywords："Bletilla"ochracea"Schltr.;"polyploidy;"colchicine;"flow"cytometer;"chromosome"counting

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.011

黃花白及（Bletilla"ochracea"Schltr.）是蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）多年生草本植物，在陜西、重慶、湖北、湖南、江西、廣西等地區分布。黃花白及花序具3～8朵，花朵常黃色，葉片為長形披針狀，花朵淡雅，葉片秀麗，具有較高的園藝觀賞價值。此外，黃花白及和小白及[B."formosana"（Hayata）"Schltr.]與白及[B."striata"（Thunb.）"Reichb."f.]為同屬植物，均為我國傳統中草藥[1]，其塊莖具備藥用價值，在我國常被用作白及的替代品。前人研究發現白及與黃花白及、小白及之間HPLC指紋圖譜相似度較高，這表明白及與黃花白及所含化學成分類似[2]。近期研究表明黃花白及多糖與白及多糖具有相似的結構，具有抗腫瘤療效[3]。此外，相關研究發現黃花白及還具有促凝血[4]和抗胃潰瘍[5]等作用。然而，近年由于對植物源性藥物市場需求的不斷增加，黃花白及也面臨野生資源被過度采集和生境退化或喪失而導致數量銳減等問題[6]。黃花白及已被列入《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）和國際貿易公約（CITES）附錄Ⅱ，在我國屬于瀕危（EN）保護植物。

目前黃花白及的研究多集中在其藥用化學成分的分析和菌根共生等方面，對于黃花白及新種質創新研究鮮有報道。因此，加快培育出性狀更優良的黃花白及新品種對于滿足不斷增長的藥材市場需求和保護黃花白及野生資源顯得更加迫切。多倍體誘導作為育種工具中的有效技術之一，對于優良物種培育、品種雜交、性狀改良、生產和商業化等具有重要作用[7-8]。為創制表型和栽培性狀更優良黃花白及新種質，本研究采用秋水仙素溶液浸種法對黃花白及進行倍性誘導，通過流式細胞術、染色體計數、氣孔觀察等方法鑒定黃花白及表型變異植株。黃花白及倍性新種質的培育可為藥用蘭科植物育種提供技術參考。

1""材料與方法

1.1""材料

選取上海辰山植物園科研中心蘭科植物資源圃的黃花白及自交蒴果為試驗材料。

1.2""方法

1.2.1""種子活力檢測""采用TTC改良染色法[9]對黃花白及種子活力進行檢測（適用于新鮮采摘的種子），根據TTC染色結果計算種子活力率，選取活力良好的種子進行后續試驗。將種子混樣后加入1.0%TTC染液沒過種子并搖勻，將其置于40"℃環境下避光染色12"h后吸取種子置于載玻片上，在體視顯微鏡下觀察染色情況。種子種胚顏色越紅，說明種子活力越高；若種胚不變色，說明種子無活力。隨機取3個視野，進行統計并計算種子活力率，活力率=胚染上紅色種子數/有胚種子總數×100%，本試驗所選取種子活力率為89.29%。

1.2.2""倍性誘導""以黃花白及種子為誘變材料，采用秋水仙素浸泡法進行倍性誘導。在超凈工作臺對種子進行無菌處理，先用75%酒精浸泡3"min，再用3%次氯酸鈉浸泡殺菌5"min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分。接著將種子分別轉移至0.25%、0.50%、1.00%秋水仙素溶液（誘導液添加不超過2.0%"DMSO）中避光誘導，對照組則用無菌水浸泡處理，各處理組均置于120"r/min轉速搖床暗處理3、6、9"d。每個處理種子數量約為100粒，每個處理重復5次。誘導處理結束后，用無菌水沖洗3次，利用無菌濾紙吸干水分后置于播種培養基使其恢復正常生長。30"d后統計種子存活率，并繼代1次，90"d后再轉至壯苗培養基，待植株生長到210"d后，篩選形態變異植株并對其進行倍性鑒定。

1.2.3""流式細胞檢測""每個處理選取20株誘變株進行流式細胞檢測，取0.50～1.00"cm2的樣本葉片，置于冰上的培養皿中，加入預冷的細胞核提取緩沖液，用鋒利的雙面刀片快速垂直切碎葉片30～60"s，此過程盡量將材料浸沒于裂解液中。吸取混合溶液經濾膜過濾，轉移至測定管內，得到細胞核懸浮液，加入染色液（染色緩沖液+碘化丙啶+RNAseA儲備液），混勻后置于4"℃避光染色15～"30"min，隨后使用PARTEC"CyFlow流式細胞儀進行檢測。具體試驗操作參照GALBRAITH等[10]的方法。

1.2.4""根尖染色體計數""參考王樂樂等[11]和MORAES等[12]的方法。從植株上切取3～4"mm長勢旺盛根尖，將根尖置于對二氯苯飽和溶液中，并在4"℃條件下浸泡處理5"h，然后用Carnoy溶液[乙醇∶乙酸，3∶1（v/v）]在4"℃條件下固定12"h。再將固定的根尖用無菌水沖洗3～5次，將水吸干后，置于2.0%纖維素酶和果膠酶溶液，并在37"℃水中解離約15～20"min。根尖分生區細胞核用卡寶品紅染液染色3～5"min，壓片，最后置于顯微鏡下觀察根尖細胞染色體。

1.2.5""形態學觀察""參考前人研究方法[13-14]，對植株株高、葉片大小、數量、莖稈、塊莖大小、分蘗數等形態特征進行統計、測量，對比加倍植株與對照植株的形態變化。此外，氣孔特征通常是檢測倍性水平的重要指標。采用OMIDBAIGI等[15]的方法，取對照和誘變植株葉片，用速干透明指甲油進行處理之后，在光學顯微鏡觀察氣孔大小，并計算氣孔密度。

1.3""數據處理

采用Image"J軟件和IBM"SPSS"Statistics"27軟件進行試驗數據處理。樣本間差異的顯著性采用獨立樣本T檢驗。使用Microsoft"Excel"2021軟件和Adobe"Photoshop"2024軟件繪制圖表。

2""結果與分析

2.1""秋水仙素誘導黃花白及

通過不同濃度的秋水仙素對黃花白及進行處理，結果如表1所示，處理濃度越高且處理時間越長，植株存活率越低。在處理時間均為6"d的情況下，秋水仙素濃度為0.50%和1.00%的處理植株死亡率達到100%。黃花白及在0.25%秋水仙素條件下處理6"d的誘導率達到45%，其次是1.00%秋水仙素處理種子3"d，誘導率為40%，但該處理條件下存活率只有8.69%。結合誘導率和存活率結果得出，黃花白及種子經0.25%秋水仙素處理6"d是誘導出四倍體植株的最佳處理方式。

2.2""流式細胞術檢測

誘導處理210"d后，采用流式細胞術對誘變植株進行DNA含量檢測和分析，以未經處理的二倍體黃花白及為對照，根據二倍體黃花白及和誘變株黃花白及熒光強度比值進行快速鑒定，如圖1可見，二倍體黃花白及熒光強度大概在200處達到峰值，誘變株黃花白及熒光強度大概在400處達到峰值，約為對照組的2倍。由此可見該誘變株為四倍體黃花白及。

2.3""根尖染色體計數

對經過流式基因組檢測的加倍植株的根尖進行染色體壓片處理，結果表明，未處理對照黃花白及根尖染色體數目為2n=2x=34，經流式鑒定的基因組加倍黃花白及根尖染色體數目為2n=4x=68（圖2）。

2.4""表型性狀分析

在相同的培養條件下，對黃花白及四倍體和二倍體植株進行形態比較分析。如圖3和表2所示，黃花白及四倍體植株表型發生顯著性變化，其植株株高、葉片數量、葉寬、莖粗、塊莖直徑、根長和根粗平均數值均高于二倍體植株。其中四倍體黃花白及的葉寬、塊莖直徑和根粗數值分別比二倍體黃花白及增加75.0%、52.4%和45.5%，具有顯著性差異（Plt;0.05）。此外，四倍體植株表型同時具有矮化（最矮株高為對照最矮的0.325倍）和變大（最高株高為對照最高的1.44倍）趨勢，并均與二倍體黃花白及表型差異明顯。與二倍體黃花白及對照相比較，四倍體植株葉片更寬更厚，根增長加粗，這些都可作為四倍體黃花白及輔助鑒定的特征。

2.5""氣孔觀察

通過光學顯微鏡對二倍體黃花白及和四倍體黃花白及葉表皮氣孔進行觀察和拍照，使用ImageJ軟件測量氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積大小。結果顯示（表3、圖4A、圖4B），四倍體黃花白及葉表皮氣孔顯著大于二倍體黃花白及，同時氣孔密度變小。此外，葉片解剖結構也受到多倍體化的影響，與二倍體植株相比，四倍體植株葉片整體比二倍體葉片厚46.31%（圖4C、圖4D）。

3""討論

黃花白及兼具觀賞與藥用價值，隨著藥用植物市場對植物源性藥物的需求增長，黃花白及面臨過度采集和生境退化或喪失等挑戰。并且黃花白及在我國屬于瀕危（EN）植物，已被列入《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）。多倍體誘導能使植物獲得改良性狀，如更大的器官（葉、花等）[16]，更高的生物量，耐旱性和抗病性增強[17-18]，這些特性的改變甚至可以使多倍體植物占據新的生態位[19-20]。并且這些多倍性狀的變化提高了它們在農藝用途的可能性[16]。因此，培育出產量更高，抗性更強等優良性狀的黃花白及品種將成為黃花白及可持續健康發展的關鍵途徑。

多倍體誘導成功的因素涉及物種、抗有絲分裂劑、外植體材料類型、處理濃度和時間等。種子、不定芽、從生芽、原球莖、類原球莖、莖尖、帶節莖段等分裂旺盛組織常作為蘭科植物多倍體誘導的材料[21]。同其他植物一樣，秋水仙素也是蘭科植物倍性育種最常用的抗有絲分裂劑[21-22]。例如，LI等[23]使用秋水仙素對白及種子進行多倍體誘導，得出經0.1%秋水仙素處理7"d后，四倍體誘導率高達（40.67±0.89）%。崔廣榮等[24]利用0.2%～0.4%秋水仙素處理文心蘭（Oncidium）類原球莖薄切片10～20"d，四倍體誘導率可達26.70%。由于植物具有表皮蠟、種皮，或較厚的角質層細胞等諸多物理屏障，因此抗有絲分裂劑的有效性會受到溶劑影響。DMSO可通過增加細胞滲透性從而提升化學試劑的吸收率，根據HAMILL等[25]研究，與溶于水的秋水仙素對照相比，用溶于2%或4%"DMSO的秋水仙素處理降低了香蕉外植體的存活率，但誘導獲得的四倍體植株數目增加。

本研究發現，秋水仙素濃度和處理時間與存活率呈負相關趨勢，這與LI等[23]誘導白及種子結果相似，隨著秋水仙素濃度和處理時間延長，存活率逐漸降低，在0.4%濃度處理9"d時死亡率最高。此外，在LIU等[26]誘導鐵皮石斛（Dendrobium"officinale）研究中，也是隨著秋水仙素濃度提高和處理時間延長，各處理組原球莖存活率均降低，以0.4%濃度處理48"h死亡率最高。在本研究中，黃花白及在0.50%和1.00%秋水仙素條件下處理6"d的死亡率最高達到了100%，這可能是由于秋水仙素濃度太高、處理時間太長以及添加了DMSO對種子毒害太強導致。不同物種對抗有絲分裂劑濃度和處理時間所呈現的效果也不同，因此，找到誘導率和存活率都較高的處理條件是倍性育種的關鍵。本研究黃花白及在0.25%秋水仙素條件下處理6"d時誘導率和變異率分別高達45%和55%，存活率為35.66%，其次是1.00%秋水仙素處理種子3"d，誘導率和變異率均為40%，但該處理條件下存活率只有8.69%。對比各處理組的誘導率和存活率數據，0.25%秋水仙素處理時間6"d是創制黃花白及四倍體植株的最佳方式。

本研究通過流式細胞術和染色體計數檢測出23株四倍體，觀察發現大部分四倍體黃花白及呈現葉片變寬變厚、莖稈變粗、塊莖變大、根系變粗、氣孔變大和氣孔密度變小等性狀，與白及[23]、鐵皮石斛[26-27]、熒光蝴蝶蘭（Phalaenopsis"bellina）[14]、紫毛兜蘭（Paphiopedilum"villosum）[28]、紋瓣蘭[Cymbidium"aloifolium"（L.）"Sw.][29]等多倍體植株器官粗大化特征相一致。在大多數情況下，物種基因組加倍后植株器官（葉、花）通常會呈現“巨體效應（gigas"effect）”特征。然而，在本研究中，出現部分四倍體植株較二倍體植株葉片更厚更寬、葉表皮更粗糙、氣孔更大，但整體植株更矮小現象。在前人的研究中也具有類似情況，如PODWYSZYNSKA等[30]誘導的四倍體郁金香（Tulipa"gesneriana）出現了矮化現象，與二倍體郁金香相比，四倍體郁金香的葉、花以及整體植株均顯著變小。除此之外，LI等[31]誘導的三倍體木槿（Hibiscus"moscheutos）的花比二倍體??；REGALADO等[32]誘導的四倍體矮牽牛（Petunia"axillaris）比二倍體矮牽牛矮，但葉片比二倍體矮牽牛緊湊（54%）；FETOUH等[33]誘導的四倍體日本女貞（Ligustrum"japonicum）平均數據比二倍體矮31.0%，冠幅小33.1%；以及PADOAN等[34]誘導的三倍體柑橘（Citrus"clementine）的葉比二倍體親本小。相關學者推測該現象可能是由于在高倍性水平下，細胞周期成本更高，細胞分裂延遲，導致細胞數量更少和器官更小[35-36]。由于培育時間不足，后續的試驗還需進一步探究四倍體黃花白及與二倍體植株開花性狀、塊莖藥用成分等方面的變化。總之，本研究誘導出的黃花白及四倍體植株與原二倍體植株形態變異顯著，為藥用蘭花種質庫增添了“gigas”化和矮化的表型性狀的多倍體植物新材料，可為黃花白及遺傳性狀改良等研究和實踐應用提供幫助。

致謝""本項研究由國家重要野生植物種質資源庫支持。另外，感謝邵文、閆曉芳、劉鳳欒、邵麗和倪子軼老師們給出的寶貴建議和幫助。

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