基于代謝組學和葉片結構分析不同煙草品種的差異特征

摘""要：為了篩選出工農業性狀兼優的烤煙新品種，本研究以烤煙品種云煙87為對照，對4個新引進煙草品種云煙121、云煙116、云煙301、云煙119的農藝性狀、超微結構、代謝物質、烤后煙質量評價4個方面進行比較分析，結果表明：云煙121品種大田長勢相對較好，葉綠體結構完整，葉綠體被膜上的嗜鋨顆粒體積較大，數量較多。通過代謝通路富集分析發現，云煙121含有琥珀酸、苯乙酸等有機酸類物質較多，而降煙堿、新煙草堿等煙堿類物質較少，有利于提高煙葉的香氣質量和安全性。此外，云煙121品種相較于其他新引進品種，外觀質量較好，化學成分較協調，感官質量打分更高且與云煙87風格較為接近。研究結果為品種的更新換代提供可靠的技術支撐，有利于優質原料生產的持續、穩定發展。

關鍵詞：煙草；農藝性狀；超微結構；代謝組學；質量評價中圖分類號：S572""""""文獻標志碼：A

Differential"Characteristics"of"Different"Tobacco"Varieties"Based"on"Metabolomics"and"Leaf"Structure"Analysis

LIU"Jiahao2，"LI"Qiujian1，"GONG"Zhixiang1，"WANG"Cong1，"ZHANG"Li1，"XI"Qiliang1，"XU"Zicheng2，"SHI"Jiuchang1*，"JIA"Wei2*

1."Zhejiang"Tobacco"Industry"Co.，"Ltd.，"Hangzhou，"Zhejiang"310002，"China;"2."College"of"Tobacco，"Henan"Agricultural"University，"Zhengzhou，"Henan"450046，"China

Abstract："In"order"to"select"a"new"tobacco"variety"with"excellent"industrial"and"agricultural"characteristics"was"selected，"the"tobacco"variety"Y87"was"used"as"the"control"to"compare"and"analyze"the"agronomic"traits，"ultrastructure，"metabolites"and"post"baking"tobacco"quality"evaluation"of"four"newly"introduced"tobacco"varieties"Y121，"Y116，"Y301"and"Y119."The"results"showed"that"Y121"had"relatively"good"field"growth，"complete"chloroplast"structure，"and"a"large"volume"and"quantity"of"osmium"loving"particles"on"the"chloroplast"membrane."Through"metabolic"pathway"enrichment"analysis，"it"was"found"that"Y121"contained"more"organic"acids"such"as"succinic"acidnbsp;and"phenylacetic"acid，"as"well"as"fewer"nicotine"such"as"nicotine"reducing"and"new"tobacco"alkaloids，"which"are"beneficial"for"improving"the"aroma"quality"and"safety"of"tobacco"leaves."In"addition，"compared"to"other"newly"introduced"varieties，"the"Y121"had"better"appearance"quality，"more"coordinated"chemical"composition，"higher"sensory"quality"score，"and"is"closer"to"Y87."The"results"would"provide"reliable"technical"support"for"the"upgrading"of"varieties，"which"is"conducive"to"the"sustained"and"stable"development"of"high-quality"raw"material"production.

Keywords："tobacco;"agronomic"traits;"ultrastructure;"metabolomics;"quality"evaluation

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.007

煙草作為我國重要的經濟作物之一，具有巨大的社會和經濟價值。隨著烤煙生產和卷煙工業的發展，優良品種的選育越來越迫切。而良種的選育，關鍵來自種質資源[1]。有關烤煙品種資源[2-4]和不同品種與煙葉品質關系[5-6]的研究在我國已經有不少報道。云南省是我國重要的煙葉產區，其中紅河煙區光溫條件充足，植煙土壤質地疏松、養分協調、通透性好，具有適合生產“清甜香”優質煙葉的良好生態條件，是云南省黃金走廊特色優質煙葉重要的主產區之一。近年來，云南省紅河煙區出現了品種單一、品質退化等問題。為了應對該問題，本研究開展了烤煙新品種的篩選工作，以烤煙品種云煙87為對照，對4個新引進煙草品種云煙121、云煙116、云煙301、云煙119開展了農藝性狀、超微結構、代謝特征、烤后煙質量評價4個方面的比較試驗，明確不同品種煙葉之間的差異性，進而篩選出工業、農業性狀兼優的烤煙新品種。

1""材料與方法

1.1""材料

以5個烤煙品種云煙121（Y121）、云煙116（Y116）、云煙301（Y301）、云煙119（Y119）、云煙87（Y87）為試驗材料，煙草種子由云南省煙草農業科學研究院提供。

1.2""方法

1.2.1""試驗設計""大田試驗于云南省紅河市建水縣官廳試驗基地（23°16′N，102°37′E）進行，選擇地勢平坦，灌排方便，土質良好，有代表性的煙田進行試驗。試驗田土壤質地為紅土，土壤pH"6.28，有機質含量為32.45"g/kg，堿解氮含量為146.86"mg/kg，速效磷含量為38.92"mg/kg，速效鉀含量為158.51"mg/kg。根據當地土壤肥力和常規施氮水平種植5個烤煙品種，采用隨機區組設計，每個品種種植1300"m2，按適合該品種的配套設施進行管理。

1.2.2""項目測定""（1）農藝性狀分析。依據品種掛牌標記，每個品種選6株長勢相近的煙株，參照標準《煙草農藝性狀調查測量方法》YC/T"142—2010中所列方法測定其葉長、葉寬、葉夾角、葉面積、株高、莖圍、節距。

（2）超微結構觀察。依據品種掛牌標記，采取5個品種（云煙121、云煙116、云煙301、云煙119、云煙87）同一葉位的鮮煙葉（中脈右側相同部位），并剪成1"cm×1"cm的若干小塊，完全浸沒于2.5%戊二醛固定液中，并置于4"℃冰箱中過夜。之后用磷酸緩沖液洗滌后轉移至1%四氧化鋨中固定。然后按照常規超薄切片法進行脫水、滲透、包埋、修塊、切片和電子染色，在JEM-1011型透射電鏡下進行超微結構組織觀察并拍照，分析不同烤煙品種葉片超微結構的變化。

（3）代謝組學檢測。依據品種掛牌標記，選取生長發育良好且長勢一致的不同肥力煙株的5片中部煙葉（10～12葉位），迅速置于液氮中冷凍，于?80"℃超低溫冰箱保存。后準確稱取適量樣品于2"mL離心管中，加入600"μL甲醇[含2-氯-L-苯丙氨酸（4"mg/L）]，?20"℃保存，渦旋振蕩30"s；再加入100"mg玻璃珠，60"hz研磨90"s后室溫超聲15"min，12"000"r/min離心10"min，使用0.22"μm膜過濾后，轉移到LC進樣小瓶，利用Thermo"Vanquish"UHPLC液相色譜儀和Thermo"QE質譜平臺分析不同烤煙品種煙葉代謝物質積累模式差異，篩選不同品種之間的關鍵差異代謝物。

（4）外觀質量分析。煙葉外觀質量指標包括葉片結構、身份、油分、色度、青雜和成熟度。依據國家標準GB"2635—1992對其進行定性描述。

（5）化學成分分析。煙葉化學成分是煙葉內在品質的基礎物質，用于評價煙葉品質的常規化學成分有總糖、還原糖、煙堿、總氮、淀粉、鉀、氯等。分別參照YC/T"161—2002、YC/T"217—"2007、YC/T"468—2013、YC/T"159—2002、YC/T"216-2014、YC/T"162—20011、YC/T216—2013標準進行測定。

（6）感官質量評。感官評吸采用曾淑華等[7]的方法進行測定。將回潮后的煙樣進行切絲，卷制成單料煙（不加香加料），在溫度（22±2）℃、相對濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱中平衡水分48"h。依據YC/T"138—1998標準對單料煙進行感官質量評吸，包括香氣量、香氣質、透發性、余味、雜氣、刺激性、柔和度、細膩度、圓潤感、干燥感10項指標。

1.3""數據處理

采用Excel"2016軟件處理試驗數據，采用SPSS"26軟件進行數據統計分析，以最小顯著性差異（LSD）檢驗表示在5%水平差異顯著，采用Origin"2021軟件繪圖。

2""結果與分析

2.1""不同品種煙株農藝性狀分析

由表1可知，在葉長、葉寬和葉面積方面，云煙121、云煙301、云煙87均顯著高于云煙116和云煙119；在葉夾角方面，不同品種之間不存在顯著性差異；在株高方面，云煙121、云煙87顯著高于云煙116、云煙301、云煙119；在莖圍方面，不同品種煙株差異較大，其中云煙87徑圍顯著高于其他品種；在節距方面，云煙121、云煙301、云煙87顯著高于云煙116和云煙119。云煙121花葉病發病率明顯低于其他品種。通過分析發現，云煙121品種煙株煙葉葉片較大，株高較高、莖圍粗、節距較大，長勢較好且發病率較低。

2.2""不同品種煙葉超微結構分析

電鏡觀察柵欄細胞超微結構（圖1）顯示，云煙121和云煙116淀粉、脂質小球積累量較多，嗜鋨顆粒體積較大，絕大部分呈不規則形位于貼壁的解體葉綠體中，云煙119和云煙301其次，云煙87淀粉、脂質小球體積最小，數量較少，存在少部分脫離細胞壁散亂排列在葉綠體中的情況。云煙121和云煙116相較云煙87，類囊體片層數量增加，堆垛程度較高，葉綠體成熟度高，葉綠體結構更完整。云煙121和云煙116葉綠體被膜上的嗜鋨顆粒體積較大，數量較多。整體而言，云煙121葉片細胞較為飽滿，內含物質豐富，葉綠體成熟度高，具有優質鮮煙葉的結構特征。

2.3""不同品種煙葉的代謝組學分析

2.3.1""質控樣本分析""在基于質譜技術的代謝組學研究中，為了獲得可靠且高質量的代謝組學數據，需進行質量控制（quality"control，"QC）。本研究在LC-MS檢測時利用QC樣本進行質控。理論上，QC樣本均相同，但是在樣本提取、檢測分析過程中會有系統誤差，導致QC樣本間會有差異，差異越小說明方法穩定性越高數據質量越好，體現在PCA分析圖上就是QC樣本密集分布。5個品種煙葉樣品QC樣本在正離子和負離子模式下PCA得分圖如圖2所示，處理樣本被分為5組，每組6個樣本，與所檢測樣本分組情況一致。由PCA得分圖可以看出，各組樣本較為集中，說明儀器穩定，數據可靠。各組內部樣本點分布較集中，說明組內樣本重復性較好，代謝物一致性好。各處理樣本點分離明顯，表明各處理間存在顯著性差異。

為了發現生物標記物，潛在的特征峰在QC樣本中的相對標準偏差（relative"standard"deviation，RSD），即變異系數不能超過30%，對不符合要求的特征峰應予以刪除。所以，在質量控制的基礎上，通常會進行質量保證（quality"assurance，QA）來刪除QC樣本中重復性差的特征峰（feature），以便獲得更高質量的數據集，更有利于生物標記物的檢測。如圖2所示，在正離子模式和負離子模式下QC樣本中RSDlt;30%的特征峰比例均超過80.0%，說明所得數據完好。

2.3.2""差異代謝物篩選""云煙116與云煙87樣品共鑒定差異代謝物為411個，其中上調表達代謝物為127個，下調表達代謝物為284個；云煙119與云煙87樣品共鑒定差異代謝物為344個，其中上調表達代謝物為68個，下調表達代謝物為276個；云煙121與云煙87樣品共鑒定差異代謝物為376個，其中上調表達代謝物為88個，下調表達代謝物為288個；云煙301與云煙87樣品共鑒定差異代謝物為367個，其中上調表達代謝物為133個，下調表達代謝物為234個（圖3）。

2.3.3""代謝物差異分析""在有機酸類差異代謝物中，云煙121的琥珀酸和苯乙酸含量較高，纈草酸、磷酸和油酸含量較低，檸檬酸含量居中（圖4）。在氨基酸類差異代謝物中，云煙121的酪胺、異亮氨酸、馬來酸和甘油酸含量顯著低于其他品種（圖5）。在酚類差異代謝物中，云煙121的百里香酚和甲基丁酚含量較低，胡椒酚含量較高（圖6）。在煙堿類差異代謝物中，云煙121的降煙堿、新煙草堿、（R）-6-羥基尼古丁和假氧尼古丁含量較低（圖7）。

2.3.4""差異代謝物富集""KEGG數據庫提供的整合代謝途徑，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應的酶進行了全面的注解，包括圖解的細胞生化過程如代謝、膜轉運、信號傳遞、細胞周期，還包括同系保守的子通路等信息。以Plt;0.05，VIPgt;1為條件篩選出酪氨酸代謝（ath00350）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（ath00250）以及煙酸和煙酰胺代謝（ath00760）3條代謝通路（表2）。

2.3.5""不同品種煙草代謝網絡結構分析""參照KEGG通路繪制了煙草代謝網絡結構，并以云煙87為對照，標記了差異代謝物含量變化，紅色表示上調，藍色表示下調（圖8）。在該通路中，通過天冬氨酸代謝途徑，L-天冬氨酸分裂成檸檬酸和L-天冬酰胺，檸檬酸通過谷氨酸代謝途徑最終形成氨基丁酸。在煙酸和煙酰胺代謝途徑中，煙酸分裂成尼古丁、假氧尼古丁和馬來酸，（R）-6-羥基尼古丁進入琥珀酸代謝途徑中形成琥珀酸。在酪氨酸代謝途徑中，L-酪氨酸分裂成酪胺和4-羥基肉桂酸，最終形成馬來酸。通過觀察物質含量熱圖可知，云煙121煙酸和假氧尼古丁含量較低，酪氨酸和馬來酸含量較低，琥珀酸和L-天門冬酰胺含量較高。

2.4""不同品種煙株烤后煙質量分析

2.4.1""外觀質量評價""由表3可知，5個品種烤后煙外觀質量無明顯差異，外觀質量表現均較好。相同品種煙葉不同部位之間結構和身份存在差異。上部煙葉烤后煙結構尚疏松，身份中等-稍后，油分有，色度強，成熟度為成熟。中部煙葉烤后煙結構疏松，身份中等，油分有，色度強，成熟度為成熟。整體而言，同一品種烤后煙中部葉外觀質量略高于上部葉。

2.4.2""常規化學分析""由表4可見，各品種煙葉總糖、還原糖含量均處于較高水平，相較其他品種，云煙121煙堿含量較低。云煙301和云煙119氯含量較高，鉀含量處于較低水平，鉀氯比較低。總氮含量方面，云煙121、云煙87含量較低，較為適宜?？傮w來看，云煙121的總糖、還原糖含量較高，總氮、總植物堿含量適中，化學成分相較于其他新引進品種較為協調。

2.4.3""感官質量分析""由表5可知，C2F等級的評分中，云煙87gt;云煙121=云煙116gt;云煙301gt;云煙119，C3F等級的評分中，云煙87=云煙121gt;云煙116=云煙301gt;云煙119，B2F等級的評分中，云煙121gt;云煙116gt;云煙87gt;云煙119gt;云煙301。云煙116質感較為細膩，在煙香清晰度略顯不足；云煙301主要存在喉部沖擊力偏大，余味干凈程度不足的問題；云煙119香氣略渾濁，雜氣量稍多，整體柔和細膩程度較好。云煙121和云煙87整體表現較好，二者在“香氣量、煙氣狀態、雜氣、刺激性、口感”方面表現接近，各等級感官質量打分均較高。

3""討論

3.1""不同品種對煙株農藝性狀的影響

田間品種對比試驗是引種的重要環節，可以檢驗引入品種對引入地的適應性，在加以選擇后，能篩選出適應當地的優良品種，對提高當地烤煙品質具有重要意義[8]。云煙121和云煙87品種煙株煙葉葉片較大，株高較高、徑圍粗、節距較大，長勢相對較好。從病害調查結果來看，該地區煙草普通花葉病發病率相對較高，這可能是當地前期日照時數較多、降雨較少，而在后期出現暴雨天氣、雨水過多等因素，導致花葉病發生較為嚴重，而云煙121的普通花葉病發病率較低，抗病性最強。從大田生長情況來看，云煙121更適合在該地區推廣種植。

3.2""不同品種對煙葉超微結構的影響

葉綠體作為植物特有的細胞器，在植物生長發育過程中起到重要的作用。就烤煙而言，淀粉、蛋白質、脂肪等主要品質成分的形成與葉綠體都有直接或間接的聯系[9-10]，進而影響烤煙的品質。成熟的烤煙葉片中，淀粉顆粒和脂質小球占據著葉綠體的絕大部分體積，此時的葉綠體由于大量的光合作用產物堆積，葉綠體膨大，沿細胞壁排列。淀粉是新鮮烤煙光合作用的主要產物，是煙葉物質和能量的一種儲藏形式[11]，在后期的烘烤加工過程中決定著煙葉的內在品質和外觀質量[12]，影響著烤后煙葉的香氣和吃味[13]。UZELAC等[14]研究認為煙草葉片衰老葉綠體超微結構與細胞核染色質凝聚、葉綠素含量變化等有關。葉綠體類囊體膜的解體，尤其是基粒片層的垛疊狀況影響著葉綠素含量的變化，從而影響葉片光能的利用[15-16]。研究發現云煙121和云煙116的淀粉及脂質小球積累量最多、體積最大，葉綠體成熟度較高且葉綠體被膜上的嗜鋨顆粒體積較大，數量較多。說明云煙121和云煙116葉片健康程度較好，且烤后煙能夠得到更好的香氣質量和吃味。

3.3""不同品種對煙葉代謝的影響

在酪氨酸代謝中，琥珀酸、苯乙酸等有機酸類物質具有一定的香氣，可賦予煙葉特殊的香氣，對煙葉品質和風味有重要影響，并且在煙草對各類逆境脅迫的適應過程中發揮重要的調節作用[17-18]，這些物質在云煙121中富集較多，表明該煙草品種具有較好的抗逆性，烤后煙葉香氣質、香氣量較好。酪胺和L-酪氨酸對煙草品質的影響與氨類似，能參與棕色化反應，抽吸時揮發進入煙氣，提高煙氣堿性，產生刺激性和辛辣味，且具有臭味[19]，這些物質在云煙121中富集較少，表明云煙121烤煙品種煙葉抽吸質量較好。百里香酚和甲基丁酚等多酚類化合物在多酚氧化酶的催化下可發生氧化反應并生成醌類物質，也可通過多酚及其氧化物發生棕色化反應從而得到類黑素等物質，還可轉化成酪氨酸，產生刺激性和辛辣味，對煙葉香氣質和香氣量產生影響。云煙121的百里香酚和甲基丁酚等多酚類代謝物積累量較少，則產生的刺激性會相對較小。在煙酸和煙酰胺代謝通路中，云煙121的降煙堿、新煙草堿、（R）-6-羥基尼古丁含量較低，產生的尼古丁較少，表明該品種的煙葉安全性較好。

3.4""不同品種對烤后煙質量的影響

優質煙葉的外觀特征通常表現為成熟度好、組織疏松、厚薄適中、無雜色、色度強、油分足[20]。色度與油分影響煙葉質量，色度足、油分多的煙葉韌性強、彈性好，手摸柔潤、滑膩，抽吸時香氣量足、香氣質好、雜氣少、刺激性小、勁頭適中。葉片結構疏松則代表細胞發育好，間隙大，填充性、彈性、燃燒性均好[21]。研究發現云煙121的葉片成熟度較高，色度強，油分表現好，結構較疏松，抽吸時香氣清晰，較綿實，煙氣收斂成團，潤細感較好，更符合優質煙葉的標準。

烤后煙葉的化學成分影響著煙草的香吃味、刺激性、雜氣等品質，同時也是引進烤煙品種需重視的一項關鍵指標，只有各項化學成分含量適當，煙葉才具有優良的內在品質[22]。一般認為優質煙葉合適的還原糖含量為16.0%～18.0%、總糖含量為18.0%～22.0%、煙堿含量為1.5%～3.5%、氯含量為0.2%～0.6%、總氮含量為1.5%～3.5%、鉀含量大于2%[23-28]。云煙121的總體常規化學成分較為適宜，呈現出“兩高兩適中”的特點，即總糖、還原糖含量較高，總氮、總植物堿含量適中，糖堿比較高，鉀氯比較低，更符合優質煙葉化學成分含量標準。

4""結論

農藝性狀方面，5個烤煙品種中云煙121的田間長勢較好，抗病性更強，具有較為適宜的化學成分；葉片結構方面，云煙121的葉綠體結構完整，嗜鋨顆粒積累量較多，具有較好的鮮煙素質結構特征；代謝特征方面，云煙121葉片中富集了琥珀酸、苯乙酸等有機酸類物質，同時含有較少的降煙堿、新煙草堿等煙堿類物質，有利于提高煙葉的香氣質量和安全性；烤后煙質量方面，云煙121的化學成分更為協調，云煙121和云煙87的感官質量表現較好，且二者在香氣量、煙氣狀態、雜氣、刺激性、口感等方面表現接近。因此云煙121具有較大的潛力替代云煙87進行推廣種植。

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