具脅迫“記憶”特征的白木香離體根的miRNA分析

摘""要：本研究以白木香離體根為材料，在經過連續三代鹽脅迫處理后，使用EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒提取樣品的總RNA，利用HiSeq"2500高通量測序平臺進行測序，旨在探討miRNA在白木香三代離體根鹽脅迫中發揮的作用及可能參與調控的代謝途徑，為揭示白木香抵御鹽脅迫機制的研究提供參考。取白木香三代鹽脅迫的離體根為材料，通過使用高通量測序平臺及生物信息學技術，獲得第一代、第二代、第三代的miRNA表達譜，篩選三代離體根中的差異miRNA，對差異miRNA進行靶基因預測，之后進行靶基因分析，從而獲得可能參與白木香次生代謝產物及響應鹽脅迫相關的miRNA。結果顯示：第一代樣品中共檢測出508個已知miRNA和764個新預測miRNA，第二代樣品中共檢測出444個已知miRNA和673個新預測miRNA，第三代樣品中共檢測出904個已知miRNA和1100個新預測miRNA。三代樣品中共獲得59個差異表達miRNA及275個靶基因，上調的miRNA靶基因主要參與類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝等信號通路，下調的miRNA靶基因則主要涉及苯丙烷類生物合成、植物激素信號傳導、植物病原相互作用等信號通路。選取關鍵miRNA進行NR注釋，結果發現，miR8020-x和novel-m0628-5p可能參與白木香離體根次生代謝產物合成；miR7494-y、miR477-y、miR5185-y、miR7757-y、miR408-z和novel-m0628-5p可能響應白木香離體根鹽脅迫。本研究利用高通量測序得到白木香離體根鹽脅迫的miRNA表達譜，并利用生物信息學分析得到可能參與白木香次生代謝產物及響應鹽脅迫相關的miRNA，研究結果將有助于增強對白木香在鹽脅迫條件下miRNA調控機制的認識，并為白木香次生代謝產物合成提供新的途徑。

關鍵詞：白木香；脅迫記憶；miRNA；HiSeq"2500高通量測序中圖分類號：S567.19""""""文獻標志碼：A

MiRNAs"Analysis"of"Aquilaria"sinensis"Vitro"Roots"with"Stress"Memory"Characteristic

ZHUANG"Tingting，"LI"Jiaxin，"ZHAN"Ruoting，"MA"Xinye*

School"of"Chinese"Materia"Medica，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"Ministry"of"Education"Key"Laboratory"of"Chinese"Medicinal"Resource"from"Lingnan，"Ministry"of"Education"/"National"Engineering"Research"Center"for"Proprietary"Chinese"Medicines"Ramp;D"Laboratory"of"Southern"Medicines，"Guangzhou，"Guangdong"510006，"China

Abstract："The"total"RNA"of"Aquilaria"sinensis"vitro"roots"was"extracted"using"the"EASYspin"Plus"Plant"Rapid"Extraction"Kit"after"three"consecutive"generations"of"salt"stress"treatment，"and"sequenced"using"the"HiSeq"2500"high-"throughput"sequencing"platform，"aiming"at"exploring"the"roles"of"miRNAs"in"the"three"generations"of"A."sinensis"vitro"roots"under"salt"stress"and"the"metabolic"pathways"that"may"be"involved"in"the"regulation，"and"providing"references"to"reveal"the"mechanisms"of"A."sinensis."The"miRNA"expression"profiles"of"the"first，"second"and"third"generations"were"obtained"by"using"the"high-throughput"sequencing"platform"and"bioinformatics"technology，"and"the"differential"miRNAs"in"the"three"generations"of"vitro"roots"were"screened，"and"the"target"genes"of"the"differential"miRNAs"were"predicted，"and"then"the"target"gene"analysis"was"performed"to"obtain"the"miRNAs"that"might"be"involved"in"the"secondary"metabolites"of"A."sinensis"and"those"that"were"related"to"the"response"to"salt"stress."The"results"showed"that"508"known"miRNAs"and"764"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"first-generation"samples;"444"known"miRNAs"and"673"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"second-generation"samples;"904"known"miRNAs"and"1100"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"third-generation"samples."A"total"of"59"differentially"expressed"miRNAs"and"275"target"genes"were"obtained"from"the"three"samples."The"up-regulated"miRNA"target"genes"were"mainly"involved"in"flavonoid"biosynthesis"and"glutathione"metabolism，"while"the"down-regulated"miRNA"target"genes"were"mainly"involved"in"phenylpropanoid"biosynthesis，"Plant"hormone"signal"transduction，"plant-pathogen"interactions"and"other"signaling"pathways."The"key"miRNAs"were"selected"for"NR"annotation，"and"it"was"found"that"miR8020-x"and"novel-m0628-5p"might"be"involved"in"the"synthesis"of"secondary"metabolites"in"A."sinensis"vitro"roots，"and"miR7494-y，"miR477-y，"miR5185-y，"miR7757-y，"miR408-z，"and"novel-m0628-5p"might"be"responded"to"A."sinensis"vitro"roots"salt"stress."In"this"study，"we"used"high-throughput"sequencing"to"obtain"miRNA"expression"profiles"of"A."sinensis"vitro"roots"under"salt"stress，"and"bioinformatics"analysis"to"obtain"miRNAs"that"may"be"involved"in"secondary"metabolites"of"A."sinensis"and"those"related"to"the"response"to"salt"stress.The"results"of"the"present"study"will"help"to"enhance"the"understanding"of"the"miRNA"regulatory"mechanisms"of"A."sinensis"under"salt"stress"conditions"and"provide"a"new"pathway"for"the"synthesis"of"secondary"metabolites"of"A."sinensis.

Keywords："Aquilaria"sinensis;"stress"memory;"miRNAs;"HiSeq"2500"high-throughput"sequencing

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.005

鹽脅迫作為一種嚴重影響植物生長發育的環境脅迫，可引發植物體內產生離子和滲透脅迫，進而影響植物體內次生代謝產物的積累或減少[1-2]。多項研究表明，不同植物在應對鹽脅迫時展現出獨特的生理適應機制，如胡椒（Piper"Nigrum）[3]、連錢草（Glechoma"longtituba）[4]和杠柳（Periploca"sepium"Bunge）[5]在鹽脅迫下某些次生代謝產物增加，而藏紅花（Crocus"sativus）[6]和荊芥（Schizonepeta"tenuifolia）[7]中次生代謝產物則呈現出不同程度的減少。近年來的研究表明，MicroRNA（miRNA）在植物鹽脅迫響應中起著關鍵作用，并通過轉錄后調控靶基因表達影響植物耐鹽性及次生代謝物合成[8-9]。在擬南芥（Arabidopsis"thaliana）中，MA等[10]發現miR171在鹽脅迫下調控靶基因GRAS，通過改變植株根系miRNA的表達來提高植物的耐鹽性。水稻（Oryza"sativa）中，特定miRNA（miR1841）的過表達顯著減輕了鹽脅迫[11]。這些研究成果為深入理解植物在鹽脅迫下的分子調控機制奠定基礎。

白木香[Aquilaria"sinensis"（Lour.）"Gilg]為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria"L.）常綠喬木，其含樹脂心材沉香，具有極高的藥用價值，同時也是名貴香料，在醫藥、香料等行業有著廣泛應用[12]。然而，自然環境下，野生沉香屬植物受損后通常需要數十年時間才能形成沉香木[13]，這極大地限制了沉香的供應，導致其市場需求與自然產出之間存在巨大差距。沉香木（結香）的形成是樹體在環境脅迫下逐漸積累次生代謝物的過程，因此，許多研究者致力于尋找有效的誘導方法來加速沉香的形成。鹽脅迫作為一種化學誘導手段逐漸受到重視，因其能夠誘導白木香愈傷組織產生2-（2-苯乙基）色酮類化合物[14]，且白木香離體根在多代的鹽脅迫下表現出“脅迫記憶”特征[15]，這表明著鹽脅迫可能在白木香結香過程中扮演著重要角色。目前關于白木香中鹽脅迫與miRNA的關系研究尚處于起步階段。尤其是miRNA在鹽脅迫下如何調控白木香次生代謝產物積累以促進結香的機制仍不清楚。鑒于此，本研究將對白木香三代離體根進行Small"RNA測序，并結合生物信息學分析篩選出差異表達的miRNA及其靶基因。一方面，旨在揭示miRNA在白木香適應鹽脅迫過程中的分子調控網絡，為全面理解白木香抗逆機制提供關鍵依據；另一方面，通過分析與次生代謝產物相關的miRNA，探索其在促進白木香結香相關次生代謝過程中的潛在作用。盡管目前尚未有直接證據表明鹽脅迫下白木香的結香時間、產量或質量會發生改變，但本研究有望為后續研究提供重要線索，從而為推動白木香抗逆性研究及促進沉香產業的可持續發展提供理論支撐和新的研究思路。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""本研究所采用的白木香種子來源于廣東省化州市維國沉香種植開發專業合作社，廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心的詹若挺教授通過參考《中國植物志》[16]《中華人民共和國藥典》[17]鑒定其為白木香[Aquilariasinensis"（Lour.）"Gilg]種子。

1.1.2""主要試劑""MS培養基（Murashige"amp;"Skoog"Medium）購自Duchefa公司；蔗糖、瓊脂購自BioFroxx公司；IBA（Indole-3-Butytric"acid）購自Sigma公司；NaCl購自天津市大茂化學試劑廠；EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2""方法

1.2.1""材料的獲取""白木香的離體根獲取過程涉及連續三代繼代培養，每次繼代均分為2個階段：培養階段和鹽脅迫階段。培養階段：首先通過無菌條件培育白木香組培苗，篩選出長勢良好的無菌苗根，剪去根尖，并剪成大約2.0"cm的根段。將根段置于含1.0"mg/L"IBA的1/2MS液體培養基，培養7"d后，將根段轉移至不含IBA的1/2MS培養基中，繼續培養42"d（期間每7"d更換1次培養基），從而獲得初始的離體根材料。接下來，進行第一次繼代。鹽脅迫階段：將離體根材料置于含150"mmol/L"NaCl的1/2MS液體培養基中，在（25±1）℃的溫度下，以110"r/min的速度震蕩培養3"d，之后從數瓶中取出離體根，剪下側根并將其標記為第一代（G1），立即放入液氮速凍，并儲存在–80"℃的冰箱中。剩余的離體根則繼續剪下側根，置于新的培養基中進行下一代的培養階段，即在不含NaCl的1/2MS中繼續培養，為后續鹽脅迫做準備。同樣的過程重復進行2次，分別獲得第二代（G2）和第三代（G3）的鹽脅迫側根材料。每次繼代都遵循先培養后脅迫模式，確保每代側根都經歷相同的處理流程。最后，將G1、G2、G3用于Small"RNA"測序。

1.2.2""Small"RNA文庫構建與HiSeq2500測序""采用EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒提取經過脅迫處理的白木香離體根樣品的總RNA。隨后，將提取的高質量RNA樣本送至廣州基迪奧生物科技有限公司，構建文庫。文庫構建完成后，采用Illumina"HiSeq"2500測序平臺進行測序。

1.2.3""基因表達量分析""對測序得到的raw"data文件進行數據過濾，剔除低質量的reads、不帶有3?接頭的reads及含有5'接頭的reads，最后得到"Small"RNA的tag序列。接著，利用GenBank和Rfam（11.0）數據庫來對這些tag序列進行注釋，盡可能地識別并剔除樣本中可能存在的rRNA，scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA。將最終得到的tag序列同miRBase中已知的植物或動物miRNA進行比對，鑒定到的miRNA即為已知miRNA。去除鑒定為已知的miRNA，挑選出能夠比對上基因組的tag，使用軟件MIREAP"v0.2預測miRNA特殊的二級結構，找出可能存在的新的miRNA。對各個樣品鑒定的miRNA進行匯總，并依據TPM（tags"per"million）公式計算每個miRNA的表達量，TPM=T×106/N[T表示miRNA的tags，N表示總miRNA的tags（已存在+已存在編輯+已知+新預測miRNA"counts數之和）]。通過這一過程，獲得所有樣品的全部miRNA的表達譜。

1.2.4""miRNA的靶基因預測及靶基因富集分析""使用patmatch"v1.2軟件對樣本中的miRNA和靶基因進行互補配對分析，并設定嚴格的篩選標準預測最終結果。篩選標準包括：整個互補關系中最多允許4個錯配（其中G-U配對視為0.5個錯配），且不允許連續錯配；miRNA的5'端第2～12位及miRNA與靶基因的第10～11位必須完全匹配，不允許錯配；miRNA與靶基因的5'端1～12位置內，最多允許2.5個錯配；同時，miRNA與靶基因的最小自由能（MFE）需達到或超過完美匹配時MFE的60%。完成預測后，將所得的靶基因與GO、KEGG數據庫進行比對，以進行功能上的注釋及分類處理，從而獲取有關這些靶基因的詳細注釋信息。

2""結果與分析

2.1""所有樣本中miRNA圖譜概述

高通量測序結果顯示，白木香離體根鹽脅迫樣品（G1-1、G1-2、G1-3、G2-1、G2-2、G2-3、G3-1、G3-2和G3-3）miRNA文庫中，所有樣品的clean"tags均大于85%（表1），表明所得miRNA數據可靠，可用于后續分析。miRNA測序得到的tag序列長度主要分布在21"nt和24"nt（圖1），與植物中miRNA的分布相符合?；趍iRBase和參考基因組對miRNA進行鑒定，在白木香樣品G1-1、G1-2、G1-3、G2-1、G2-2、G2-3、G3-1、G3-2、G3-3中分別發現了282、119、107、94、230、120、365、278、261個已知miRNA，421、149、194、106、424、143、435、284、381個新miRNA，"共鑒定出1476個miRNA（圖2）。G3代樣品中已知miRNA和新miRNA的數量明顯多于G1和G2代，表明隨著鹽脅迫代數的增加，白木香離體根的miRNA表達調控更加復雜，可能涉及更多的基因表達調控過程。

2.2""鹽脅迫下miRNA的表達量分析

所有樣品中共鑒定出1476個miRNA，包括794個已知miRNA和682個新預測miRNA。在已知miRNA中，miR166-y的表達量最高，在G3樣本中其表達量達到6"264"167.887，其次是miR396-x和miR156-x；在新預測miRNA中，novel-m0109-3p的表達量最高，在G3樣本中其表達量為30"391.845，其次是novel-m0497-3p和novel-m0108-3p（表2）。進一步分析3個樣品中miRNA的差異表達，發現miR166-y、miR396-x和novel-m0109-3p在G3中的表達占優勢，novel-m0224-3p和novel-m0213-5p在G2中的表達量較高，novel-m0497-3p在G1中表達量較高。

2.3""鹽脅迫下miRNA差異表達分析

使用edgeR軟件（默認參數）對miRNA進行差異分析（圖3A）。差異miRNA是以表達量變化2倍以上，并且P值小于0.05作為篩選標準。在鑒定出的1465個miRNA中有59個miRNA差異表達（21個上調，38個下調）。在G1"vs"G2檢測出3個差異表達miRNA（1個上調和2個下調）；在G1"vs"G3中檢測出26個差異表達miRNA（7個上調和19個下調）；在G2"vs"G3中檢測出30個差異表達miRNA（13個上調和17個下調）。為了更清晰地揭示3組中差異基因的表達趨勢，篩選并整理每組中排名前10的上調/下調miRNA（表3）。在G1"vs"G3中，novel-m0141-5p和novel-"m0098-3p是顯著上調的差異miRNA，而novel-"m0561-3p和miR7757-y則顯著下調；G2"vs"G3中，novel-m0098-3p和miR7494-y呈顯著性上調，而novel-m0628-5p和miR5185-y則顯著下調。結合韋恩圖分析（圖3B），得出G1"vs"G2和G1"vs"G3兩組間共有1個差異miRNA，G1"vs"G2和G2"vs"G3兩組間共有1個差異miRNA，G1"vs"G3和G2"vs"G3兩組間共有10個差異miRNA。在G1"vs"G2、G1"vs"G3和G2"vs"G3三組中分別有1、15、19個差異miRNA特異性表達。3個比較組中沒有共同的差異表達miRNA。

2.4""差異靶基因GO功能注釋

為了篩選出白木香三代離體根中與鹽脅迫應答及次生代謝物產生相關的miRNA，使用PatMatch軟件對白木香一代、二代和三代鹽脅迫下離體根的全部miRNA基因進行預測，共得到靶基因13"617個，靶基因位點23"504個。其中，已知miRNA預測到的靶基因有13"276個，靶基因位點22"285個；而預測到的新miRNA靶基因有935個，靶基因位點1"219個。差異表達miRNA通過改變其靶基因的表達模式參與植物脅迫應答[18]。因此，對篩選得到的275個差異miRNA靶基因進行GO功能注釋，其按照生物學過程、分子功能和細胞組分分為3類（圖4），其中生物學過程涉及的GO條目最多，有19個；分子功能和細胞組分涉及的條目分別為8個和9個。在生物學過程中主要富集在細胞過程（cellular"process）、代謝過程（metabolic"process）和單一有機體過程（single"organism"process），相關的靶基因數目分別為91、88和64；在分子功能方面主要富集在催化活性（catalytic"activity）和結合（binding），相關的靶基因數目分別為81和56；在細胞組成部分主要富集在細胞部分（cell"part）、細胞（cell）和細胞器（organelle），相關的靶基因數目分別為44、44和40。

2.5""差異靶基因KEGG富集分析

為了進一步了解差異靶基因的生物學功能，本研究對各組間差異表達的miRNA的靶基因進行富集分析（圖5）。結果表明，顯著富集的通路有40條，涉及57條差異表達的miRNA靶基因。其中，涉及代謝通路、植物次生代謝和植物激素信號傳導途徑的靶基因較多，分別是16、11和5個。將參與關鍵代謝途徑中富集的靶基因與對應的miRNA進行聯合分析及NR注釋（表4），發現富集到的代謝通路共涉及了6個下調和4個上調的差異miRNA。其中下調的miRNA包括miR477-y、miR5185-y、novel-m0161-3p、novel-"m0628-5p、miR408-z和miR7757-y，而上調的miRNA包括miR7494-y、novel-m0098-3p、novel-"m0320-3p和miR8020-x。這些miRNA在特定的比較組中具有特異性表達：miR477-y、miR408-z、miR7757-y、novel-m0161-3p在G1"vs"G3中特異性表達，而miR5185-y、miR7494-y、novel-m0628-5p、novel-m0320-3p和miR8020-x則在G2"vs"G3中特異性表達。進一步分析發現，下調的miRNA靶基因主要涉及糖酵解/糖異生成、苯丙烷類生物合成、植物激素信號傳導、植物病原相互作用等信號通路。而上調的miRNA靶基因則主要參與類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝等信號通路。

NR注釋結果顯示，miR8020-x的靶基因與查爾酮黃酮異構酶有關；miR7494-y的2個靶基因分別可能與谷胱甘肽過氧化物酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶有關；miR5185-y的靶基因與含F-box/WD重復蛋白相關；miR477-y的靶基因與lysM"結構域受體樣激酶3相關；miR7757-y的靶基因與生長因子B3家族蛋白/輔助因子AUX/IAA相關同工酶1相關；miR408-z與類生長素反應蛋白IAA6相關；novel-m0628-5p與有絲分裂原活化蛋白激酶2同工酶X1有關。

3""討論

3.1""可能參與白木香離體根次生代謝產物有關的miRNA

結合GO功能注釋、KEGG富集分析及差異miRNA的NR注釋，發現靶基因主要在細胞過程、代謝過程和催化活化等功能和植物激素信號傳導代謝途徑富集。部分miRNA靶基因可能與白木香次生代謝產物有關，而另一些miRNA靶基因則可能與白木香離體根響應鹽脅迫相關。在三代鹽脅迫處理的離體根中共獲得59個差異miRNA，其中，在G1"vs"G2、G1"vs"G3、G2"vs"G3三個比較組中分別有1、7、13個上調的差異miRNA，有2、19、17個下調的差異miRNA。上調差異miRNA隨著脅迫代數的增加逐漸增加，在G1"vs"G3和G2"vs"G3兩個比較組過渡中下調差異miRNA反而減少了，這暗示了白木香在連續多代鹽脅迫下，其基因表達調控發生了復雜的變化。

查爾酮異構酶基因（CHI）的表達可以促進植物體內黃酮類次生代謝物的合成[19]。本研究中miR8020-x預測的靶基因evm.model.Scaffold446."31與查爾酮異構酶相關。因此，推測miR8020-x可能通過影響靶基因表達水平來調節次生代謝途徑中查爾酮異構酶的活性，從而影響類黃酮次生代謝物的合成，但這還需要進一步的實驗驗證。此外，差異基因novel-m0628-5p的靶基因evm."model.Scaffold139.25和evm.model.Scaffold43.133分別與CBSX3和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）相關，而CBSXs參與擬南芥的組織發育和脅迫響應過程[20]，MAPKK可能參與沉香中2-苯乙基色酮的生物合成[21]。因此，本研究推測差異基因novel-m0628-5p不僅響應白木香離體根鹽脅迫，還可能參與白木香中2-（2-苯乙基）色酮類物質的合成。

3.2""可能參與白木香離體根抵御鹽脅迫有關的miRNA

在鹽脅迫環境下，胡楊（Populus"euphratica）能夠上調谷胱甘肽過氧化物酶的表達，維持總體抗氧化活性[22]。本研究發現，特定miRNA如miR7494-y的靶基因evm.model.Scaffold195.28與谷胱甘肽過氧化物酶2相關，并參與過氧化物酶活性（GO：0004601）、毒素代謝過程（GO：0009404）、激素介導的信號通路（GO：0009755）等過程；其靶基因evm.model.scaffold7.53調節絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，參與植物信號傳導通路。因此，推測miR7494-y通過調控靶基因evm.model."Scaffold195.28和靶基因evm.model.scaffold7.53的表達，增強白木香離體根在鹽脅迫下的抗氧化能力和信號傳導，從而提高其耐鹽性。本研究中，差異miR5185-y預測的靶基因evm.model."Scaffold140.3與F-box相關，而F-box蛋白家族成員也廣泛參與植物逆境響應[23]。因此，本研究推測miR5185-y參與離體根響應鹽脅迫。

miR477在茶樹（Camellia"sinensis）中對逆境（如干旱、鹽等）的響應起著重要的調控作用[24]。miR7757參與小麥（Triticum"aestivum）種子萌發過程[25]。在擬南芥中的研究表明，miR408的過表達能增強其對鹽度、寒冷及氧化應激耐受，但提高了對干旱和滲透脅迫敏感性[26]。在本研究中，miR477-y，miR7757-y和miR408-z呈現出差異表達，說明這些miRNA可能與白木香響應鹽脅迫有著重要的相關作用。已知LysM類受體激酶在植物抗逆及防御機制中起關鍵作用，并且，在戰明慧[27]的研究中，發現蘋果（Malus"pumila）中的LysM類受體激酶MdLYK15負調控蘋果對腐皮鐮孢菌的抗性。而本研究發現，miR477-y的靶基因evm.model.Scaffold8.140與含有lysM結構域的受體樣激酶相關，該基因參與植物病原體相互作用，并可能通過調控離體根來增強對鹽脅迫的抵御能力。此外，CBSXs蛋白和AUX/IAA蛋白等也被證實參與植物的脅迫響應過程[20，"28]。本研究發現，差異表達基因miR7757-y的靶基因evm."model.Scaffold24.124調控植物激素信號傳導中的AUX/IAA蛋白，而miR408-z的靶基因evm.model."Scaffold403.11則調控生長素反應蛋白IAA6，這些調控作用共同影響了白木香離體根的生長和對鹽脅迫的適應能力。綜上所述，本研究推測miR"8020-x和novel-m0628-5p可能參與白木香離體根次生代謝產物的合成，而miR7494-y、miR477-y、miR5185-y、miR7757-y、miR408-z和novel-m0628-"5p則可能參與白木香離體根對鹽脅迫的響應。然而，本研究尚未對這些miRNA進行功能驗證及開展深入的作用機制研究。特別是在分析過程中，尚未獲得直接證據來證實分析中的差異miRNA與“記憶”相關。因此，后續將聚焦于對這些差異miRNA的功能驗證，旨在明確它們在鹽脅迫過程中的具體作用機制，并進一步探索它們與脅迫“記憶”特征之間的潛在聯系。

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