秋石斛DenTFL1基因的克隆與表達分析

摘""要：TFL1基因屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding"protein，"PEBP）家族成員，與植物開花調控密切相關。為探究秋石斛中TFL1基因的功能，本研究基于花序發育轉錄組數據庫克隆了1個秋石斛TFL1同源基因DenTFL1，并對其進行生物信息分析、蛋白結構和亞細胞定位預測以及表達模式的分析。結果表明：秋石斛DenTFL1基因cDNA全長522"bp，編碼173個氨基酸；DenTFL1蛋白分子式為C870H1354N246O249S6，分子量為19.43"kDa，理論等電點（pI）為7.82，蛋白具有親水性，結構穩定；DenTFL1蛋白不含有信號肽和跨膜結構域，預測該蛋白定位于細胞質，其二級結構以無規則卷曲為主，占比61.85%，還含有23.70%的延伸鏈，14.45%的α-螺旋，三維結構模型與二級結構基本一致。蛋白保守結構域分析結果顯示，DenTFL1含有PEBP保守結構域。根據氨基酸序列比對和系統進化樹分析發現，DenTFL1基因與金釵石斛、球花石斛中的同源基因親緣關系較近且蛋白序列的一致性較高，進化較為保守。蛋白質互作網絡預測結果顯示，秋石斛DenTFL1蛋白主要與AT5G63440、LFY、SOC1、AGL24、AGL8等蛋白發生互作。實時定量PCR結果表明，DenTFL1基因在秋石斛不同生長發育階段的各個組織部位均有表達，其中在幼苗和成熟株的莖以及花柄中的表達量最高，在幼苗的根以及中苗的葉片和根中的表達量則相對較低；在花序發育的不同階段均有較高的表達量（除了長度為3.0"cm的花序之外），在發育后期的花苞和成熟花各輪花器官中高表達，而在發育早期的各輪花器官中的表達量相對較低。本研究為進一步揭示TFL1基因在秋石斛中花期調控提供一定的理論依據。

關鍵詞：秋石斛；DenTFL1；基因克隆；表達分析中圖分類號：S682.31""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"DenTFL1"Gene"in"Dendrobium"Hybrid

MO"Shunjin1，2，"LI"Zhengqi3，"YU"Xiaoyun1，2，"LU"Shunjiao1，2，"LIAO"Yi1，2，"YI"Shuangshuang1，2*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Crop"Gene"Resources"and"Germplasm"Enhancement"in"Southern"China，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Crops"Germplasm"Resources"Genetic"Improvement"and"Innovation"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Hainan"Engineering"Technology"Research"Center"of"Tropical"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Gene"TFL1"belongs"to"the"phosphatidylethanolamine"binding"protein"（PEBP）"family"and"is"closely"related"to"plant"flowering"regulation."To"explore"the"functions"of"TFL1"gene"in"Dendrobium"hybrid，"based"on"the"transcriptome"data"of"floral"in"Dendrobium"hybrid，"a"TFL1"gene"was"cloned"and"named"DenTFL1."And"the"bioinformatic"analysis"protein"structure"and"subcellular"localization"prediction，"expression"patterns"analysis"were"done"to"explored"the"functional"of"DenTFL1."The"results"showed"that"the"full"length"of"DenTFL1"cDNA"sequence"was"522"bp，"encoding"173"amino"acids."Bioinformatics"analysis"showed"that"the"molecular"formula"of"DenTFL1"was"C870H1354N246O249S6，"the"theoretical"relative"molecular"mass"of"the"protein"was"19.43"kDa，"and"the"theoretical"isoelectric"point"was"7.82，"and"the"protein"was"hydrophilic"and"structurally"stable."Subcellular"prediction"showed"that"it"was"located"in"the"cytoplasm，"without"signal"peptide"and"transmembrane"domain."The"secondary"structure"was"dominated"by"61.85%"of"random"curl，"also"contained"23.70%"of"the"extended"chain，"14.45%"of"α-helix."The"three-dimensional"structural"model"was"basically"consistent"with"the"secondary"structure."The"conserved"domain"analysis"showed"that"DenTFL1"had"a"conserved"PEBP"domain"and"amino"acid"sequence"alignment"and"phylogenetic"tree"analysis"showed"that"DenTFL1"was"closely"related"to"D."nobile"and"D."thyrsiflorum."The"constructed"protein"network"showed"that"DenTFL1"mainly"interacted"with"AT5G63440，"LFY，"SOC1，"AGL24，"AGL8."Expression"analysis"showed"that"DenTFL1"was"expressed"in"all"tissues"of"different"development"stages"of"Dendrobium"hybrid，"and"had"the"highest"expression"level"in"the"stems"of"young"and"mature"plantlet"and"the"flower"stalks，"and"had"a"lower"expression"level"in"the"roots"of"young"plantlet"and"the"leaves"and"roots"of"medium"plantlets."Moreover，"it"had"a"high"expression"in"different"development"stage"of"inflorescence"except"3.0"cm"long"inflorescence."It"also"showed"high"expression"in"7.0"mm"and"9.0"mm"width"floral"bud"and"the"tissues"of"fully"open"flower，"but"expressed"lower"in"the"tissues"of"early"development"stages"of"floral"bud."The"research"could"provide"a"reference"for"the"flowering"regulation"of"Dendrobium"hybrid，"and"add"relevant"information"for"the"study"of"TFL1.

Keywords："Dendrobium"hybrid;"DenTFL1;"gene"cloning;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.003

秋石斛，也被稱為蝴蝶石斛，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生草本植物，具有重要觀賞價值。海南處于熱帶地區，憑借其優越的氣候及地理優勢，是熱帶花卉的主產區，也是我國秋石斛的主要產地[1]。近年來，秋石斛的栽種面積逐年擴大，每年的秋石斛出貨量也不斷增多[2]。我國引入秋石斛栽植時間較晚，但是近年來秋石斛盆花生產發展速度快，具有很高的研究價值和商業前景。秋石斛花期集中在秋季，國內花卉消費呈現節日消費的特點，如在春節、情人節等節日前后市場需求較大，秋石斛自然花期和市場需求旺季不遇，導致花卉的商品價值大大降低，嚴重影響了秋石斛產業發展。使用植物生長調節劑可以誘導秋石斛提前開花[3]，但是會造成花朵數量減少甚至畸形等不利影響[4]。作為觀花植物，秋石斛的成花狀況是影響產業發展中的關鍵因素，成花質量直接關系到秋石斛的觀賞價值。隨著分子生物學的發展，蘭花在分子育種方面也進行了深入的研究[5]，有效調控秋石斛花期使之能按需開花是目前秋石斛生產急需解決的關鍵問題之一。目前關于秋石斛開花相關基因研究較少，本研究對調控秋石斛花期相關的DenTFL1基因進行克隆和表達分析，以期為秋石斛花期調控提供有效的理論依據。

前人研究發現植物的開花途徑主要有6種，即光周期途徑（photoperiod"pathway）、春化途徑（vernalization"pathway）、自主途徑（autonomous"pathway）、赤霉素途徑（gibberellin"pathway）、環境溫度途徑（ambient"temperature"pathway）和年齡途徑（age"pathway）[6]。各調控途徑的不同通路在植物體內交匯后，共同作用將開花信號傳遞給一系列成花/抑花因子，如FLOWERING"LOCUS"T（FT）和TERMINAL"FLOWER"1（TFL1）[7]，開花調節因子被激活后共同調控植物的花期[8]。這2個調節因子均屬于PEBP（phosphatidylethanolamine-"binding"protein）家族成員[9]。盡管FT-like基因與TFL1-like基因在序列上展現出高度同源性，但二者卻具有拮抗功能[10]。具體而言，FT-like基因對開花過程具有促進作用，而TFL1-like基因則起到抑制開花的作用[11]。在擬南芥中，FT蛋白與bZIP轉錄因子FD蛋白結合形成FT/FD蛋白復合物，誘導開花基因表達，促進擬南芥開花，而TFL1基因表達時，TFL1蛋白也可以與FD蛋白結合，但是TFL1/FD復合物產生開花抑制基因，從而抑制擬南芥的開花[12]。迄今為止，開花抑制因子TFL1同源基因被發現存在于番茄[13]、玉米[14]、龍膽[15]、菊花[16]、水仙[17]以及藏紅花[18]等植物中。TFL1基因在秋石斛中的作用機理并不明確，本研究基于花序發育轉錄組數據庫，克隆秋石斛開花關鍵基因DenTFL1，分析預測其蛋白結構和系統進化關系等，并通過實時定量PCR分析基因表達特性，為秋石斛開花調控提供有效的理論依據。

1""材料與方法

1.1""材料

秋石斛三亞陽光（Dendrobium"hybrid，"Sonia"Hiasakul）采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶蘭花資源圃（儋州）。分別采取幼苗期莖（YS）、幼苗期根（YR）、幼苗期葉（YF）、中苗期莖（MS）、中苗期根（MR）、中苗期葉（MF）、成熟期莖（MaS）、成熟期根（MaR）、成熟期葉（MaF）及成熟的花梗（Ped）、花柄（Sta）等部位，同時采集長度分別為1、3、5、7、9"cm的花序（1FB、3FB、5FB、5FB、9FB），直徑分別為1、3、5、7、9"mm的花苞（1F、3F、5F、7F、9F），以及直徑為3、5、7"mm花苞和完全開放花朵的萼片（3S、5S、7S、FS）、花瓣（3P、5P、7P、FP）、唇瓣（3L、5L、7L、FL）、合蕊柱（3C、5C、7C、FC）等花器官（圖1）。選擇生長狀態一致的中苗，在48"h內每2"h采集中苗葉片。采樣時設置3個重復，取樣后立刻剪碎，用錫紙包裹后放入液氮中，于-80"℃冰箱保存備用。所采樣品用于RNA的提取、基因克隆及表達分析。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取與基因克隆""使用天根RNAprep"Pure"Plant"Plus"Kit試劑盒提取秋石斛RNA，將質量合格的RNA逆轉錄為cDNA，于–20"℃冰箱保存備用。以三亞陽光秋石斛轉錄組中得到的DenTFL1基因序列為依據，使用Primer"Premier"5軟件設計引物（表1），用反轉錄的花苞cDNA作為模板進行PCR擴增。用膠回收試劑盒對目的片段進行回收，利用熱激法將得到的膠回收產物與大腸桿菌感受態細胞DH5α連接，挑選單菌落進行菌液PCR檢測，并挑選陽性菌測序。

1.2.2""生物信息學分析""利用ExPasy-ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在線軟件分析蛋白的理化性質；利用ExPASy-protscale預測分析蛋白的親水性；利用WoLF"PSORT（https：//"wolfpsort.hgc.jp/）和Cell"ploc2.0（http：//www.csbio."sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預測DenTFL1蛋白的亞細胞定位；利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//"swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件預測蛋白的二級結構及三維空間結構；利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/"services/TMHMM-2.0/）在線軟件預測蛋白跨膜區；利用SignalP-6.0（https：//services.healthtech."dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在線軟件預測蛋白信號肽；通過NCBI數據庫的BLAST工具獲得DenTFL1蛋白的同源序列，并用DNAMAN軟件進行比對分析，使用MEGA-11軟件構建系統進化樹。

1.2.3""DenTFL1基因的表達分析""以三亞陽光秋石斛的不同組織為材料分析秋石斛DenTFL1基因的組織表達特性。使用吐露港的2×Q3"SYBR"qPCR"Master"mix試劑盒，CFX96"Touch儀器進行熒光定量PCR檢測。實驗設置3次生物學重復，DenTFL1基因的相對表達量使用2???Ct法計算。DenTFL1基因的熒光定量PCR引物見表1，使用秋石斛β-actin基因作為內參[19]。計算結果使用Origin"2024軟件制圖。

2""結果與分析

2.1""DenTFL1基因克隆

以秋石斛花苞cDNA為模板，設計特異性引物，PCR成功擴增出目的基因DenTFL1（圖2），經測序獲得522"bp的序列。

2.2""DenTFL1蛋白的生物信息學分析

理化性質分析結果顯示，DenTFL1蛋白包含173個氨基酸，分子量為19.43"kDa，分子式簡寫為C870H1354N246O249S6，理論等電點（pI）為7.82；帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）為2個，帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）為20個；纈氨酸在氨基酸序列中占比最高（13.3%），其次為精氨酸（9.2%）；蛋白不穩定系數達39.91，推測其為穩定堿性蛋白。總親水性平均值（GRAVY）為-0.257，推測DenTFL"1蛋白屬于親水蛋白（圖3）。保守結構域數據庫（CDD）預測結果顯示，DenTFL1蛋白屬于PEBP超家族。SignalP"6.0預測結果顯示，Sec/SPI為0.0004，其它類型蛋白占比為0.9996，表示DenTFL1蛋白可能不具有信號肽。TMHMM"2.0軟件分析該蛋白質不含跨膜結構域，推測該蛋白屬于非分泌性蛋白。使用WoLF"PSORT和Cell-PLoc"2.0在線軟件預測結果均表明DenTFL1蛋白可能定位于細胞質。

DenTFL1蛋白由3種構象組成，其中無規則卷曲（random"coil）占比最高，為61.85%；其次是延伸鏈（extended"strand），占比23.7%；α-螺旋（alpha"helix）占比僅有14.45%（圖4A）。使用SWISS-MODEL軟件以匹配度最高的水稻PEBP家族Os02g0531600蛋白為模板建模，得到TFL1蛋白三級結構模型（圖4B），與二級結構基本一致，DenTF1L蛋白三級結構中同樣含有較多的無規則卷曲。

2.3""DenTFL1蛋白同源序列比對和系統發育分析

通過NCBI數據庫查找其它植物中與DenTFL1蛋白同源的序列，并用DNAMAN軟件對其進行同源性比對，發現DenTFL1序列與金釵石斛（KAI0496869.1）、球花石斛（KAL0910461.1）、Masdevallia"wendlandiana（QLM02222.1）、文心蘭（AIU44253.1）、香莢蘭（KAG0489005.1）等物種同源基因的氨基酸序列高度相似，同源性分別為96.53%、94.80%、85.55%、87.86%、85.38%（圖5），說明可能具有相似功能。系統進化樹顯示，秋石斛DenTFL1與金釵石斛的親緣關系最近，其次是球花石斛，與高粱，油棕親緣關系較遠（圖6）。

2.4""DenTFL蛋白互作網絡的預測與分析

利用STRING軟件對秋石斛DenTFL1進行蛋白質互作（protein-protein"interaction，PPI）網絡構建。DenTFL1氨基酸序列與擬南芥AtTFL1相似性較高，同源性為69.1%。借助AtTFL1已知的蛋白互作網絡對DenTFL1的蛋白互作調控機制進行預測發現（圖7），聚類系數為0.891，PPI富集P值為5.57e-05，可能與DenTFL1存在互相作用的蛋白有10個，分別是AT5G63440（0.963）、LFY（0.938）、SOC1（0.931）、AGL24（0.924）、AGL8（0.907）、CAL（0.905）、F6I1.13（0.888）、DECOY（0.875）、AT1G64880（0.866）、VIN3（0.852）。GO富集分析表明，DenTFL1的互作蛋白主要參與花序分生組織特性的維持，胚胎后發育的正向調控、花朵發育的正向調控等生物過程。

2.5""DenTFL1基因的表達特性分析

為探究DenTFL1基因在秋石斛中的表達特性，本研究對秋石斛不同發育階段的不同組織、不同發育階段的花序、花苞以及不同發育階段花器官中的基因表達情況進行分析。不同發育階段的不同組織表達特性分析結果表明，DenTFL1基因在秋石斛各發育階段不同組織中均有表達，在幼苗和成熟苗的莖、花柄中高表達，其次是成熟株的根和幼苗的葉片，中苗的莖、根和葉中的表達量均較低（圖8）。

花序和花苞的表達特性分析（圖9）發現，DenTFL1在花序發育的各個階段均有表達，在長度1"cm的花序中的表達量最高，之后表達量迅速下降，在長度3"cm的花序中的表達量最低，之后表達量又迅速上升，在長度5、7、9"cm的花序中均有較高的表達量。在各個發育階段的花苞中，DenTFL1主要在花苞發育后期高表達，其中在7"mm直徑的花苞中的表達量最高，其次是9"mm直徑的花苞。

在花器官中，完全開放花朵的各個部位DenTFL1基因表達量明顯高于3、5、7"mm花苞的花器官。在未成熟時，幾個階段花苞中萼片的基因表達量均較高，當花苞開放時，各個花器官中基因表達量上升，明顯高于3、5、7"mm花苞，其中唇瓣的表達量最高（圖10）。

為分析DenTFL1在48"h周期內表達變化，選取秋石斛中苗葉片部位進行表達分析。DenTFL1在葉片中的晝夜表達結果顯示，DenTFL1在凌晨6：00—8：00時，中午12：00—16：00時，晚上18：00—22：00時的表達量呈先上調后下調的趨勢（圖11），具有明顯的節律性。

3""討論

成花轉變是有花植物重要的生長階段，最佳的開花時期對于植物在適宜環境條件下完成生命周期具有重要意義[20]。花是絕大多數觀賞植物最重要的觀賞部位，開花的早晚、開花的應節性等都極大地影響觀花花卉的價值，而通過花期調控使觀花花卉早開花、應節性開花是提高其價值的有效手段之一，對開花調控的分子機制解析是開展花期調控研究的基礎。TFL1基因已被證實在調控植物的開花時間及植株結構中扮演重要角色[21]。TFL1是花序分生組織發育的主要負調控因子，可顯著延遲開花時間[22]。蘋果中的MdTFL1-1和MdTFL1-2在花誘導過程中表達迅速降低，在擬南芥中異位表達會延遲開花時間[23]，矮牽牛中的PhTFL1a/c都導致擬南芥明顯晚花[24]；龍眼中的DlTFL1-1和DlTFL1-2導致煙草和擬南芥開花延遲[25]；在玫瑰中，開花抑制因子TFL1同源物的缺失會改變開花季節性，引起持續開花[26]。由此推測，本研究克隆的秋石斛DenTFL1基因在調控花期方面也有一定的作用。本研究從秋石斛三亞陽光品種中成功分離出DenTFL1基因，其全長為522"bp，編碼173個氨基酸。通過蛋白序列對比研究發現，DenTFL1基因與金釵石斛（KAI049 6869.1）、球花石斛（KAL0910461.1）中的同源基因親緣關系較近且蛋白序列的一致性較高，推測DenTFL1基因在這幾個物種中的功能具有相似性。利用生物信息學技術分析DenTFL1蛋白的基本理化性質和二級結構等，推測其為穩定堿性親水蛋白，且不具有信號肽和跨膜結構域，屬于非分泌性蛋白。DenTFL1蛋白可能定位于細胞質，二級結構和三級結構預測結果顯示DenTFL1蛋白有較多的無規則卷曲結構。

植物的開花受多種途徑調控，最終整合成一個復雜的調控網絡，其中包括許多開花抑制因子和開花促進因子。在植物幼苗時期，開花抑制因子高表達，抑制植物開花，到了中苗期，開花促進因子開始高表達，抑制開花抑制因子的表達，使開花抑制因子表達量降低，從而完成成花轉換，最終開花[27]。而TFL1是一個開花抑制因子，秋石斛DenTFL1的時空發育表達特性分析表明，其在幼苗期的莖中具有很高的表達量，而到了中苗之后，表達量明顯下降，與開花抑制因子在植物生長發育過程中的表達特性相一致。類似的表達特性在二球懸鈴木（Platanus"acerifolia）[28]、巴西橡膠樹（Hevea"brasiliensis）[29]、三花龍膽（Gentiana"triflora）[15]等植物中同樣存在。表明秋石斛TFL1的同源基因DenTFL1同樣具有抑制秋石斛開花的功能。

龍眼DlTFL1-1、DlTFL1-2在擬南芥過表達中出現了花序分支增多的表型，并且轉基因擬南芥中的AtAP1、AtFT、AtLFY基因表達量顯著下調[25]。TFL1及其同源基因除了具有調控開花的功能之外，在很多物種中也報道了其參與調控植物形態建成及花器官發育的功能，如與AGAMOUS基因功能互作調控紫花苜蓿的花器官分化和花序發育[30]；與AGAMOUS、LEAFY共同互作調控擬南芥花分生組織的分化[31]，通過轉錄抑制調控擬南芥的開花時間和花序發育[12]；與FT互作調控森林草莓（Fragaria"vesca）花序形態建成[32]。蛋白互作網絡的預測結果顯示，DenTFL1蛋白與LFY、AGL24、AGL8等存在相互作用，并且GO富集分析表明這些互作蛋白主要參與花序分生組織特性的維持，花朵發育的正向調控等生物過程。本研究發現DenTFL1在花序、花苞發育的各個階段以及花器官發育的各個階段均有很高的表達量，表明DenTFL1極有可能也參與了秋石斛花序和花器官分化和發育的調控，但仍需通過進一步的研究驗證。

研究表明，TFL1除了能感受年齡途徑、自主途徑以及春化途徑的開花信號調控植物開花進程之外，也能感受光周期途徑的開花信號調控開花進程[27]，如森林草莓的FvTFL1突變將導致原本長日照抑制開花，短日照促進開花的植株在長日照條件下出現早花的表型[33]，通過整合溫度信號和光周期信號來抑制森林草莓的開花[34]，通過感受溫度和光周期信號調控黃瓜的有限生長發育[35]等。本研究中，DenTFL1晝夜節律表達特性分析發現，其具有很明顯的晝夜表達規律，表明DenTFL1可以感受晝夜的光周期信號，從而誘導其表達量的變化，說明DenTFL1可以通過感受光周期的信號調控秋石斛的開花進程。

本研究克隆了秋石斛DenTFL1基因，對其進行生物信息學和表達特性分析，為全面深入解析DenTFL1生物學功能及作用機制提供參考，為后續深入解析其在秋石斛花期調控機制提供理論基礎。

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