冬蟲(chóng)夏草通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR通路保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷

摘要：目的 探討冬蟲(chóng)夏草通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響。方法 體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，分為正常葡萄糖濃度（NG）組、高糖（HG）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草（HG+CS）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草+自噬抑制劑（HG+CS+3MA）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草+AMPK抑制劑（HG+CS+Compound C）組。CCK-8法檢測(cè)足細(xì)胞活力；蛋白免疫印跡法檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocin、nephrin，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、P62以及通路相關(guān)蛋白磷酸化AMPK（p-AMPK）、磷酸化mTOR（p-mTOR）的表達(dá)。結(jié)果 與NG組比較，HG組足細(xì)胞活力降低，podocin、nephrin、Beclin-1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，P62、p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與HG組相比，HG+CS組足細(xì)胞活力升高，podocin、nephrin、Beclin-1、p-AMPK蛋白表達(dá)水平升高，P62、p-mTOR蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組和HG+CS+Compound C組足細(xì)胞活力均降低，podocin、nephrin、Beclin-1蛋白表達(dá)水平均降低，P62蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；HG+CS+Compound C組p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。結(jié)論 冬蟲(chóng)夏草可能通過(guò)上調(diào)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)激活自噬、改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮糖尿病腎病足細(xì)胞保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：冬蟲(chóng)夏草；糖尿病腎病；自噬；足細(xì)胞；AMPK/mTOR信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240816

Effect of Cordyceps sinensis on podocyte damage induced by high glucose by regulating the AMPK/mTOR pathway

LI Bingxin1， XU Junying1， ZHANG Yaru1， ZHOU Xiaobing2△

1 Department of Nephrology， 2 Department of Minimally Invasive Center for General Surgery， the Second People’s Hospital of Hunan Province （Brain Hospital of Hunan Province）， Changsha 410021， China

△Corresponding Author E-mail： 150634509@qq.com

Abstract： Objective To investigate effects of Cordyceps sinensis （CS） on high glucose （HG） induced podocyte injury by regulating the adenylate activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway. Methods Mouse podocytes were cultured in vitro and divided into the normal glucose （NG） group， the HG group， the HG+CS group， the HG+CS+autophagy inhibitor （HG+CS+3MA） group" and the HG+CS+AMPK inhibitor （HG+CS+Compound C） group. Podocyte viability was detected by CCK-8 method. Western blot assay was used to detect the expression levels of podocyte marker proteins podocin and nephrin， autophagy-related proteins Beclin-1 and P62， and pathway related proteins p-AMPK and p-mTOR. Results Compared with the NG group， the cell viability of podocytes decreased， the expression levels of podocin， nephrin，Beclin-1 and p-AMPK protein were decreased， and the expression levels of P62 and p-mTOR protein were increased in the HG group （P＜0.05）. Compared with the HG group， the cell viability of podocytes was increased， the expression levels of podocin， nephrin， Beclin-1 and p-AMPK protein were significantly increased （P＜0.05）， and the expression levels of P62 and p-mTOR protein were decreased in the HG+CS group （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the cell viability decreased in the HG+CS+3MA group and the HG+CS+Compound C group （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the HG+CS+3MA group and the HG+CS+Compound C group showed decreased expression levels of podocin， nephrin and Beclin-1 protein， and increased expression of P62 protein （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the expression of p-AMPK protein decreased and the expression of p-mTOR protein increased in the HG+CS+Compound C group （P＜0.05）. Conclusion Cordyceps sinensis may play a protective role in diabetic nephropathy by up-regulating AMPK/mTOR signaling pathway to induce podocyte autophagy， alleviate high glucose induced podocyte injury and apoptosis.

Key words： cordyceps; diabetic nephropathies; autophagy; podocytes; AMPK/mTOR signaling pathway

糖尿病腎病（diabetic nephropathies，DN）是指糖尿病所導(dǎo)致的腎臟損害，是糖尿病所致全身微血管病變的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，是慢性腎功能不全的重要原因。足細(xì)胞損傷是DN發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，其中足細(xì)胞自噬活性降低是DN足細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素［1］。提高足細(xì)胞自噬活性可抑制細(xì)胞損傷，進(jìn)而減少蛋白尿并延緩DN進(jìn)展［2］。冬蟲(chóng)夏草（cordyceps sinensis，CS）是一種名貴的蟲(chóng)草屬植物類中草藥，為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌，含有多種有效生物活性成分，可通過(guò)多種機(jī)制減少尿蛋白、改善腎臟功能及減輕腎臟病理改變。研究表明冬蟲(chóng)夏草治療DN療效確切［3］，且其可通過(guò)調(diào)控自噬對(duì)急性腎損傷發(fā)揮治療作用［4］。自噬的活性受腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等多種信號(hào)通路的調(diào)控。然而，有關(guān)冬蟲(chóng)夏草能否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬及介導(dǎo)信號(hào)通路來(lái)改善DN的研究尚少見(jiàn)。本研究通過(guò)探討冬蟲(chóng)夏草是否通過(guò)干預(yù)AMPK/mTOR信號(hào)通路來(lái)調(diào)控自噬，從而改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，為冬蟲(chóng)夏草防治DN提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠永生足細(xì)胞系MPC-5購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；人工冬蟲(chóng)夏草菌液購(gòu)自杭州中美華東制藥有限責(zé)任公司，為冬蟲(chóng)夏草原料經(jīng)醇提、水提及酵解制備而成；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；自噬抑制劑3-Methyladenine（3MA）、AMPK抑制劑Compound C均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠podocin、nephrin、Beclin-1、P62、β-actin單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗小鼠AMPK單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體、兔抗小鼠mTOR多克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；酶標(biāo)儀、SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備、GEL Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；BH-2光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將永生系小鼠足細(xì)胞MPC-5復(fù)蘇，置于含有10%胎牛血清、γ干擾素和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于33 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，將足細(xì)胞傳代移入不含γ干擾素的培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 以RPMI1640培養(yǎng)基將冬蟲(chóng)夏草充分溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，用RPMI1640培養(yǎng)基將冬蟲(chóng)夏草稀釋至30 mg/L。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MPC-5細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板，設(shè)正常葡萄糖濃度（含5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，NG）組、高糖（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，HG）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基、30 mg/L冬蟲(chóng)夏草菌液，HG+CS）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草+自噬抑制劑（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基+30 mg/L冬蟲(chóng)夏草菌液+10 mmol/L 3-Methyladenine，HG+CS+3MA）組、高糖+冬蟲(chóng)夏草+AMPK抑制劑（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基+30 mg/L冬蟲(chóng)夏草菌液+" "10 μmol/L Compound C，HG+CS+Compound C）組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組重復(fù)5次。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取MPC-5細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中podocin、nephrin、Beclin-1、P62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá) 細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板，分組干預(yù)后收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液提取處理后的各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量后，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE（100 V恒壓）分離，然后將凝膠上的蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，與兔源一抗podocin（1∶1 000）、nephrin（1∶1 000）、Beclin-1（1∶500）、P62（1∶" " " " 1 000）、AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、mTOR（1∶500）、" " p-mTOR（1∶500）和β-actin（1∶3 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜。TBST漂洗后，再將膜與山羊抗兔二抗（1∶2 000）在室溫條件下孵育2 h，漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光，X線膠片顯影，以β-actin為蛋白內(nèi)參，膠片掃描后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以[x]±s]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組足細(xì)胞活力的比較 與NG組相比，HG組足細(xì)胞活力降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組足細(xì)胞活力升高（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組和HG+CS+Compound C組足細(xì)胞活力降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 冬蟲(chóng)夏草及自噬抑制劑對(duì)高糖干預(yù)下足細(xì)胞損傷和自噬的影響 與NG組相比，HG組podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，P62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組細(xì)胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表1。

2.3 各組足細(xì)胞p-AMPK與p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較 與NG組相比，HG組p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組p-AMPK蛋白表達(dá)水平升高，p-mTOR蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+Compound C組細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表2。

2.4 AMPK抑制劑阻斷冬蟲(chóng)夏草對(duì)高糖干預(yù)下足細(xì)胞損傷及自噬的影響 與NG組相比，HG組podocin、nephrin和Beclin蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組podocin、nephrin和Beclin蛋白表達(dá)水平升高，P62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+Compound C組細(xì)胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表3。

3 討論

DN是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其病理變化包括腎小球足細(xì)胞減少、細(xì)胞外基質(zhì)增多和腎小球硬化等，其中足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Podocin和nephrin蛋白是足細(xì)胞特有的標(biāo)志蛋白，同時(shí)也是重要的功能蛋白，是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，其丟失可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能受損和蛋白尿［5］。本研究結(jié)果顯示，高糖干預(yù)小鼠足細(xì)胞后，足細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞中podocin和nephrin蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示高糖誘導(dǎo)了足細(xì)胞損傷，與以往研究報(bào)道［6］一致。冬蟲(chóng)夏草干預(yù)后，足細(xì)胞活力增加，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞podocin和nephrin蛋白表達(dá)水平升高，提示冬蟲(chóng)夏草可改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

自噬是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)溶酶體降解、清除和循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)部受損的大分子物質(zhì)和細(xì)胞器，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和完整性［7］。自噬在維持足細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)和功能完整性中發(fā)揮重要作用［8］。Yamahara等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，腎小管上皮細(xì)胞自噬的缺乏可加重蛋白尿誘導(dǎo)的腎間質(zhì)損傷。高糖及其所致炎癥反應(yīng)可能抑制自噬，從而導(dǎo)致DN的發(fā)生發(fā)展［10］。Xu等［6］體外研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷與自噬水平下降有關(guān)，熊膽酸可通過(guò)抑制miR-21表達(dá)上調(diào)自噬水平，從而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病患者和小鼠動(dòng)物模型中，足細(xì)胞自噬不足在DN進(jìn)展至大量蛋白尿階段的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。Beclin-1是自噬的關(guān)鍵分子，其通過(guò)與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，從而參與自噬過(guò)程［11］。P62是反映自噬水平的標(biāo)志物之一，其能夠與自噬相關(guān)蛋白LC3相互作用，隨后與其結(jié)合的泛素化蛋白或細(xì)胞器被包裹入自噬體后降解；當(dāng)自噬受損時(shí)，P62降解被抑制，造成在細(xì)胞內(nèi)積累，其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，冬蟲(chóng)夏草干預(yù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞后，Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，而P62蛋白表達(dá)水平降低，提示冬蟲(chóng)夏草可通過(guò)提高足細(xì)胞的自噬水平來(lái)減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。另外，使用自噬抑制劑3MA進(jìn)行干預(yù)后，冬蟲(chóng)夏草對(duì)足細(xì)胞活力的保護(hù)作用被阻斷，足細(xì)胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低、P62蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)一步證實(shí)冬蟲(chóng)夏草通過(guò)上調(diào)足細(xì)胞自噬水平對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

自噬的活性受多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬主要受AMPK/mTOR通路的調(diào)控［13-14］。AMPK被激活后，可抑制其下游mTOR蛋白的表達(dá)，而mTOR作為自噬的負(fù)調(diào)控因子，其活性降低則能促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生［15-16］。有研究顯示，在腎缺血再灌注損傷中，AMPK可通過(guò)抑制mTOR激酶活性正向調(diào)節(jié)自噬［17］。李燕等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在DN小鼠中，高糖環(huán)境下細(xì)胞凋亡增加的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平下降；通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬，可改善DN小鼠的腎損傷。本研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，足細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低、p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高；給予冬蟲(chóng)夏草干預(yù)后，可提高高糖誘導(dǎo)下p-AMPK蛋白表達(dá)水平、降低p-mTOR蛋白表達(dá)水平，提示高糖環(huán)境下AMPK/mTOR信號(hào)通路的下調(diào)介導(dǎo)了足細(xì)胞損傷，而冬蟲(chóng)夏草可通過(guò)上調(diào)該信號(hào)通路減輕足細(xì)胞損傷，從而減緩DN的進(jìn)展。另外，在冬蟲(chóng)夏草干預(yù)的基礎(chǔ)上加用AMPK抑制劑Compound C后，足細(xì)胞活力降低，足細(xì)胞損傷標(biāo)志物podocin和nephrin蛋白表達(dá)水平降低，足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)水平降低、P62蛋白表達(dá)水平升高，提示Compound C阻斷AMPK/mTOR信號(hào)通路可減弱冬蟲(chóng)夏草在高糖環(huán)境下對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用以及上調(diào)自噬的作用。

綜上所述，高糖可通過(guò)下調(diào)AMPK/mTOR信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，而冬蟲(chóng)夏草可能通過(guò)上調(diào)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)激活自噬、改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮DN足細(xì)胞保護(hù)作用。但該作用機(jī)制較為復(fù)雜，其通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路下游的何種蛋白發(fā)揮作用還有待探討。

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（2024-06-24收稿 2024-08-22修回）

（本文編輯 陳麗潔）

基金項(xiàng)目：湖南省衛(wèi)生健康委科研計(jì)劃項(xiàng)目（D202303057259）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2025JJ90079）

作者單位：1湖南省第二人民醫(yī)院（湖南省腦科醫(yī)院）腎內(nèi)科（郵編410021），2微創(chuàng)外科

作者簡(jiǎn)介：李冰心（1982），女，副主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病方面研究。E-mail：libignxin_9@163.com

△通信作者 E-mail：150634509@qq.com

引用本文：李冰心，許軍英，張雅茹，等. 冬蟲(chóng)夏草通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR通路保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷［J］. 天津醫(yī)藥，2025，53（3）：225-229. LI B X， XU J J， ZHANG Y R，et al. Effect of Cordyceps sinensis on podocyte damage induced by high glucose by regulating the AMPK/mTOR pathway［J］. Tianjin Med J，2025，53（3）：225-229. doi：10.11958/20240816.