SETD7對三陰性乳腺癌阿霉素化療耐藥的作用機制

關鍵詞：SETD7；三陰性乳腺癌；阿霉素；化療耐藥

三陰性乳腺癌（triple-negativebreastcancer，TNBC）是一種以缺乏雌激素、孕激素受體，以及人表皮生長因子受體2表達和/或基因擴增缺失為特征的乳腺癌亞型。它占所有浸潤性乳腺癌的15%～20%，與其他乳腺癌亞型相比，預后較差[1]。因缺乏靶向藥物，化療是TNBC全身治療的主要方法[2]。大約30%接受術前新輔助化療（neoadjuvantchemotherapy，NAC）的TNBC女性可以達到病理完全緩解（pathologicalcompleteresponse，pCR）。在臨床試驗中，手術時實現pCR與良好的預后相關[3-4]。然而，化療耐藥導致大多數患者的高復發率和不良預后。因此，亟需確定新的分子靶點來克服TNBC化療耐藥。

甲基化作為表觀遺傳學中一種重要的修飾行為，對靶蛋白的生物學功能有重要影響[5]。SETD7（su（var）3–9，enhancerofzeste，trithoraxdomain-containingprotein7）是蛋白質賴氨酸甲基轉移酶（proteinlysinemethyltransferases，PLMTs）家族的一員，不僅使組蛋白甲基化，也能使非組蛋白底物甲基化[6-9]。SETD7的失調在多種腫瘤中均有發現，然而，其在癌變中的作用和功能卻存在較大差異[10]。一方面，它可作為腫瘤抑制因子對結腸癌和非小細胞肺癌起到抑制作用[11-12]；另一方面，SETD7的上調也與包括卵巢癌和膠質瘤在內的幾種惡性腫瘤的侵襲性行為相關[13-14]。

前期研究發現，與癌旁組織相比，TNBC組織中SETD7的表達水平更高。SETD7的缺失阻止了TNBC細胞的遷移。此外，還發現SETD7激活ERK/MAPK通路誘導TNBC細胞的上皮–間充質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），并以YY1依賴的方式促進這些細胞的遷移[15]。但是SETD7在TNBC阿霉素耐藥中的作用機制尚未知曉，因此，本研究通過SETD7基因敲除或者添加選擇性抑制劑（R）-PFI-2，探討SETD7對TNBC細胞增殖、凋亡以及阿霉素化療敏感性的影響。

1材料與方法

1.1細胞培養

本研究采用3種三陰性乳腺癌細胞系。Hs578T、MDA-MB-231和MFM223細胞系由中國科學院細胞庫提供。采用高糖DMEM培養基，添加10%胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（penicillinandstreptomycin，P/S）培養Hs578T和MDA-MB-231細胞系。MFM223細胞系采用RPMI1640培養基，混合體積分數10%的FBS和P/S。細胞培養于37℃、5%二氧化碳的培養箱中。

1.2細胞增殖實驗

將TNBC細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，標準環境下常規培養。分別在第1、2、3、4、5d，每孔加入10μLCCK8溶液，孵育2h。酶標儀測定450nm的吸光度。

采用集落形成法檢測細胞克隆生成能力。接種TNBC細胞（500個/孔）至6孔板，細胞培養箱培養12d，然后對細胞進行甲醛固定和結晶紫染色，人工計數可見菌落。

1.3耐藥實驗

將TNBC細胞接種于96孔板，以不同濃度的阿霉素處理48h，并采用CCK8法測定細胞活力。繪制劑量反應曲線，利用GraphPadPrism軟件測定阿霉素的半最大抑制濃度（thehalf-maximalinhibitoryconcentration，IC50）值，IC50值用于評估TNBC細胞對阿霉素的耐藥性。

1.4細胞凋亡檢測

不同處理組的TNBC細胞使用AnnexinVFITC/DRAQ7細胞凋亡檢測試劑盒進行流式細胞分析，測定細胞凋亡率。用FlowJov10軟件分析，繪制散點圖，異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為橫坐標，遠紅外DNA染料（deepredanthraquinone7，DRAQ7）為縱坐標。

1.5蛋白免疫印跡（Westernblotting）實驗

用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白裂解物，與100μmol/L苯基甲基磺酰氟和體積分數1%的磷酸酶抑制劑混合。二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量試劑盒測定細胞提取物濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDSPAGE）分離等體積樣品，然后將樣品轉移到聚偏二氟乙烯膜上，100V，轉膜100min。將膜浸入無血清印跡阻斷緩沖液中15min，然后用一抗標記，4℃孵育過夜。3次洗滌后，用山羊抗小鼠/抗兔第二抗體室溫孵育1h，檢測膜的化學發光信號，以內參蛋白GAPDH作為樣品加載的內對照。一抗的詳細信息如表1所示。

1.6統計學分析

采用GraphPadPrism軟件進行統計分析，計算數據的均值和標準差（SD）。各實驗組間的統計學差異采用t檢驗，所有數據以（均數±標準差）表示，plt;0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1SETD7在TNBC細胞中的表達

本研究采用Westernblotting法檢測3種TNBC細胞系（MDA-MB-231、Hs578T、MFM223）中SETD7的表達水平。MDA-MB-231細胞中SETD7表達較高，而Hs578T細胞中蛋白的表達較低（圖1（a））。采用CRISPR/Cas9基因編輯系統分別在MDA-MB-231和Hs578T中建立SETD7過表達和敲除（knock-out，KO）細胞系，并分別將其與對照組（Ctrl）相比較（圖1（b）），方法參見前期研究[15]。通過CCK8和集落形成實驗來確定SETD7對細胞增殖的影響。SETD7過表達或敲除對TNBC細胞生長（圖1（c）、（d））和集落形成能力均無顯著影響（圖1（e）～（h））。

2.2SETD7在MDA-MB-231細胞阿霉素敏感性中的作用

為了評估SETD7基因敲除對MDA-MB-231細胞藥物敏感性的影響。首先，采用CCK8法檢測MDA-MB-231對照組和SETD7-KO組細胞對阿霉素（doxorubicin，Dox）敏感性的差異。與對照組細胞相比，SETD7-KO細胞對阿霉素治療更敏感（圖2（a））。通過對SETD7敲除細胞系和對照組細胞經阿霉素處理后的集落形成能力進行分析發現，MDA-MB-231SETD7-KO細胞在經阿霉素處理后開始死亡，而對照組細胞仍能存活（圖2（b）、（c））。與此一致的是，通過AnnexinV染色細胞的流式細胞法分析發現，與對照組細胞相比，阿霉素處理后SETD7-KO組細胞的凋亡水平增加（圖2（d）～（f））。

2.3SETD7甲基轉移酶活性選擇性抑制劑（R）-PFI-2使MDA-MB-231細胞對阿霉素敏感

通過以上研究發現，MDA-MB-231細胞的基因毒性耐藥作用依賴于SETD7，推測SETD7的選擇性抑制劑（R）-PFI-2同樣可以增加TNBC細胞對阿霉素的敏感性。

不同濃度的（R）-PFI-2對細胞沒有毒性作用，也不影響細胞對阿霉素的敏感性，因此，（R）-PFI-2本身不會引起遺傳毒性作用[11]。然而，在MDAMB-231細胞中敲除SETD7后，（R）-PFI-2使細胞對阿霉素更敏感（圖3（a））。集落形成實驗發現，（R）-PFI-2增加了MDA-MB-231對阿霉素的敏感性（圖3（b）、（c）），流式細胞法分析結果得出了同樣的結論（圖3（d）～（f））。

2.4SETD7對MDA-MB-231細胞Bax和Bcl-2蛋白表達水平的調控作用

為了研究SETD7在三陰性乳腺癌阿霉素化療耐藥作用中的機制，采用Westernblotting實驗檢測Bax和Bcl-2蛋白表達水平。結果顯示：SETD7-KO阿霉素處理組較其他3組Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低（圖3（g））；（R）-PFI-2加阿霉素組同樣提高了MDA-MB-231細胞中Bax蛋白的表達水平，降低了Bcl-2蛋白的表達（圖3（h））。

3結果與討論

由于TNBC化療耐藥性和預后不良，治療該疾病仍然是一個重大挑戰。最近發現，SETD7在TNBC臨床樣本中高表達[15]。同時也證明了這種蛋白賴氨酸甲基化轉移酶促進三陰性乳腺癌細胞的遷移潛能[15]。然而，SETD7在三陰性乳腺癌阿霉素化療耐藥中的作用此前尚未有研究涉及。本文研究結果表明，SETD7與TNBC臨床常用化療藥物的耐藥性密切相關，同時，證實了SETD7缺失能夠增強阿霉素在體外誘導TNBC細胞系凋亡的作用。

Bcl-2家族成員對細胞凋亡的調控作用顯著[16-17]。Bcl-2家族成員有抗凋亡和促凋亡兩種作用。其中，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax被認為是決定細胞是否發生凋亡過程的關鍵[18]。本研究發現，阿霉素處理后的MDA-MB-231SETD7-KO細胞在蛋白水平上顯著上調Bax、下調Bcl-2。Bcl-2家族蛋白可能在調控SETD7增加三陰性乳腺癌阿霉素化療敏感性中起重要作用。SETD7-KO細胞中細胞周期蛋白水平升高可能促進未修復雙鏈斷裂的出現，并提高對阿霉素的敏感性。綜上所述，這些結果提示SETD7參與了細胞周期蛋白的調控，但其調控機制有待進一步研究。

許多前期研究都證實了SETD7參與了腫瘤的形成和進展[15，19-20]，本文為使用SETD7選擇性抑制劑作為抗癌治療的新策略提供了進一步的證據。