六堡茶群體種葉綠體基因組捕獲歷史與遺傳多樣性研究

摘 要：" 六堡茶群體種（Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’）是制作六堡茶的主要原材料植物。為探索六堡茶群體種的遺傳背景，特別是其系統發育和演化歷史，該文對27份六堡茶群體種和5份突肋茶開展了淺層基因組和轉錄組測序，并進行了六堡茶群體種的系統發育關系、分歧進化時間及遺傳多樣性分析。結果表明：（1）在葉綠體樹上，六堡茶群體種樣品被分為距離較遠的兩組。一組與茶親緣關系最近，嵌入了主要由茶組成的分支內部，分別與不同栽培茶聚在一起；另一組則形成單系分支，與突肋茶親緣關系最近且嵌入其內部。然而，在核基因樹上，六堡茶群體種樣品與栽培茶及山茶屬其他幾個物種聚為一支，但與突肋茶關系較遠。核質基因組系統發育矛盾表明，部分六堡茶群體種的祖先曾與突肋茶發生過雜交事件，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。（2）分子鐘分析進一步表明，該雜交事件發生在1.55百萬年前的第四紀時期，遠早于人類栽培和制作茶的歷史。（3）基于葉綠體基因組和核基因的遺傳多樣性分析均發現，六堡茶群體種具有較高的單倍型多樣性，有較大的演化潛力。該研究為六堡茶群體種種質資源保護、品種選育及開發利用提供了科學依據和指導。

關鍵詞： 六堡茶群體種， 葉綠體基因組， 轉錄組， 葉綠體基因組捕獲， 雜交， 遺傳多樣性

中圖分類號：" Q943

文獻標識碼：" A

Chloroplast genome capture history and genetic diversity of Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’

YAO Shuting1，2， ZHANG Qiang1， SU Min3， WU Yuting3， PANG Yuelan3，LIANG Yanni4， CAI Aihua1， QIN Xinmei1*

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China;

2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004， Guangxi， China;

3. Tea Science and Research Institute， Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541004， Guangxi， China;

4. Wuzhou University， Wuzhou 543002， Guangxi， China ）

Abstract：

Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ is the main raw material for making Liupao tea. To explore the genetic background of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’， especially its phylogenetic position and evolutionary history， 27 individuals of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ and five individuals of C. costata were sampled for genome skimming and transcriptomic sequencing. The phylogenetic relationship， the divergence evolution time， and the genetic diversity of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ were analyzed. The results were as follows： （1） On the chloroplast tree， samples of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ were divided into two distantly-related groups， one was nested within a clade mainly consisting of C. sinensis， being interspersed among other cultivated C. sinensis， while the other group formed as a well supported lineage that was most closely-related to and nested within C. costata; on the nuclear gene tree， however， all the 27 samples of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ formed a clade with other C. sinensis as well as some other Camellia species with generally unresolved relationships among them. Despite the lack of resolution in this clade， it was definitely far separated from C. costata; the cytonuclear phylogenetic conflict suggested once ancient introgression hybridization of C. costata with the ancestor of some C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ individuals so that the latter captured the chloroplast genome of the former. （2） The time estimate further indicated that the introgression hybridization event occurred in the Quaternary period， ca. 1.55 million years ago， long before the history of tea cultivation and production by humans. （3） In addition， both the chloroplast genomes and nuclear genes revealed that the C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ had high haplotype diversity， possessing high evolutionary potential. This study" provides the references for the germplasm protection， variety breeding， development and" utilization of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’.

Key words： Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’， chloroplast genomes， transcriptomes， chloroplast genome capture， hybridization， genetic diversity

廣義的茶樹指山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）茶組（Sect. Thea）植物，而狹義的茶樹則指茶（Camellia sinensis）這一種（含變種、變型等種下等級）植物（楊世雄，2021a）。茶包含了眾多品種或地方種，具有不同的風味品質。茶的不同品種以及山茶屬其他種類被認為存在頻繁的雜交和多倍化，具有復雜的演化歷史（Huang et al.， 2013；Wang et al.， 2020；Zan et al.， 2023）。例如，山茶（C. japonica）和短柄山茶（C. rusticana）之間能發生自然雜交（Ueno amp; Tsumura， 2009）。Meegahakumbura等（2016）對392份茶樣品的遺傳分析發現30%的樣品具有不同類型茶樹的遺傳混合，表明它們為雜交起源，其中柬埔寨茶（Cambod tea）就被認為是阿薩姆茶（Assam tea）和中國茶（China tea）的雜交品種。李苗苗等（2015）利用核基因微衛星標記對普洱茶（C. sinensis var. assamica）和大理茶（C. taliensis）進行STRUCTURE聚類分析，發現在混栽的大理茶和普洱茶居群間，存在由大理茶向普洱茶的基因漸滲。Li等（2021）研究發現武夷菜茶水仙茶樹品種（三倍體）和山茶屬其他4個物種在trnE-trnT間隔區具有同樣335 bp的序列缺失，但292份栽培茶都沒有缺失這段。由此推測，該茶樹在三倍化過程中發生了葉綠體轉移，即通過漸滲雜交捕獲了其他物種的葉綠體。雖然葉綠體基因已廣泛應用于山茶屬植物系統發育和遺傳多樣性研究（葉曉倩等， 2014；Li et al.， 2021；閆明慧等，2021），但是葉綠體基因組通常為母系遺傳，單獨使用無法準確解析雜交或基因漸滲等網狀演化，而利用核低拷貝直系同源基因序列則已成功解決了許多疑難的系統發育尤其復雜的網狀演化問題（Yang et al.， 2015；Wu et al.， 2022；Zan et al.， 2023）。

廣西茶樹種質資源極為豐富，根據閔天祿的茶組分類系統，茶組共包含12種6變種，而廣西有8種，是中國茶組植物資源最豐富的地區（Ming amp; Bartholomew， 2007；楊世雄，2021b）。廣西也擁有很多歷史悠久的地方品種及名茶（陳宗懋，1992），其中廣西梧州的六堡茶，為中國二十四大名茶之一，以其“紅、濃、陳、醇”及獨特的檳榔香特點聞名于世（陳佳等，2020）。六堡茶群體種是制作六堡茶的主要原材料。根據《中國茶樹品種志》中的相關記載，六堡茶群體種為廣西地方有性系茶樹品種，為中葉種，主要分布在廣西蒼梧、賀縣、蒙山和昭平等地（中國茶樹品種志編寫委員會，2001）。對六堡茶群體種開展的研究主要為形態特征、資源調查和開發利用（陳佳等，2010；邱瑞瑾等，2020；滕翠琴等，2020）以及基于EST-SSR和SSR分子標記進行的親緣關系與遺傳多樣性分析（周炎花等，2011；黃厚宸等，2021；王留彬等，2022），而基于序列分析的遺傳背景及遺傳多樣性研究還未見報道，其起源和演化歷史仍不清楚。值得注意的是，茶組植物中突肋茶（C. costata）的模式產地為廣西昭平縣，與六堡茶群體種分布區重疊。目前，對突肋茶的研究只限于對廣西昭平縣突肋茶的資源調查和開發利用（李朝昌等，2019；龔明壽等，2021），以及貴州地方茶組植物（包含突肋茶）的親緣關系研究（郭燦等，2021）。六堡茶群體種與突肋茶地理分布重疊，它們之間及其與同組或同屬其他種類間是否存在雜交或基因漸滲尚無研究。

本研究以27份六堡茶群體種和5份突肋茶為實驗材料，通過淺層基因組和轉錄組測序，拼接組裝葉綠體基因組并篩選單拷貝核基因，結合公共數據庫中已公布的山茶科相應的核苷酸序列，重建六堡茶群體種與其他山茶屬物種間的系統發育關系，估算六堡茶群體種樣品的葉綠體基因組分歧進化時間，并計算遺傳多樣性指數，擬探討以下問題：（1）六堡茶群體種的系統發育位置；（2）六堡茶群體種與其他山茶屬物種是否存在雜交或基因漸滲；（3）六堡茶群體種的遺傳多樣性。六堡茶群體種種質資源對促進當地經濟發展及鄉村振興具有重要意義，本研究可為六堡茶群體種資源保護、品種選育及開發利用提供科學依據和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究使用的27份六堡茶群體種均來源于梧州市，其中12份采自梧州市蒼梧縣六堡鎮石牛村，編號為H1-H12；10份采自梧州市蒼梧縣六堡鎮四柳村，編號為Q13-Q22；5份采自梧州市藤縣大益村馬歐嶺，編號為D1-D5。27份六堡茶群體種葉片多樣性較高，小、中、大葉類均有，綠芽、紫芽、黃白芽均有。另外，還有5份突肋茶采自廣西賀州昭平縣農業科學研究所資源圃，編號為T1-T5。選擇無病蟲害、生長狀況良好的新鮮幼嫩葉片用于后續實驗。

1.2 DNA、RNA提取和測序

基因組淺層測序和轉錄組測序主要委托青島百邁克生物科技有限公司進行。32份樣品的總DNA和RNA分別采用CTAB法和天根DP411試劑盒進行提取，并檢測其濃度和完整性。使用檢驗合格的DNA和RNA構建測序文庫，并用Illumina NovaSeq 6000測序儀進行雙端測序（PE150 bp）。最終獲得淺層基因組和轉錄組原始數據，每個樣分別約為3 Gb和6 Gb。

1.3 數據處理

1.3.1 葉綠體基因組的組裝和注釋 對獲得的淺層基因組原始數據用Fastp 0.20.1軟件（Chen et al.， 2018）進行質量控制，去掉接頭和低質量的片段（reads）后得到凈化數據（clean data），使用GetOrganelle 1.7.5軟件（Jin et al.， 2020）在默認參數設置下進行拼接組裝。以茶（C. sinensis var. sinensis）為參考序列（GenBank登錄號為NC_020019），利用PGA軟件（Qu et al.， 2019）進行葉綠體基因組注釋，并使用OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw）繪制葉綠體基因組圖譜。

1.3.2 轉錄組拼接和篩選單拷貝核基因 除本研究新獲得的轉錄組測序數據以外，我們還從NCBI數據庫下載了山茶科26個物種（38份樣品）的轉錄組測序數據（表1），包括1個大頭茶屬（Polyspora）物種，25個山茶屬物種。用上述1.3.1中的質控方式獲得凈化數據，使用Trinity 2.11.0軟件（Haas et al.， 2013）在默認參數設置下把凈化數據從頭組裝成轉錄本。使用TransDecoder 5.5.0軟件（Haas et al.， 2013）識別轉錄本序列中的候選編碼區。使用CD-HIT 4.8.1軟件（Fu et al.， 2012）根據序列的相似度對序列進行聚類以去除冗余的序列，序列相似性閾值設置為0.98。因為一些樣品測序質量不高會影響篩選直系同源基因數量，所以選擇11個測序質量較高且具有系統發育代表性的樣品，使用OrthoFinder 2.5.2軟件（Emms amp; Kelly， 2019）搜索出11個樣品之間的798個單拷貝核基因（一對一核直系同源基因）。在其余樣品中，使用BLAST++軟件（Wang et al.， 2003）搜索并提取798個單拷貝核基因對應的得分最高的同源序列。

1.3.3 序列比對與構建系統樹 選取1條組裝好的六堡茶群體種葉綠體基因組序列作為參考序列，

在NBCI上進行相似性搜索，下載山茶科77種（含變種）植物的103條葉綠體基因組序列（表2），包含山茶屬76種（含變種），圓籽荷屬（Apterosperma）1種。除茶這一物種共下載29條序列以外，其余每種下載1條序列。使用MAFFT 7.490軟件（Katoh amp; Standley， 2013）對所有序列進行比對，再用BioEdit 7.2.5軟件（Hall， 1999）手工調整。使用MEGA 7.0軟件（Kumar et al.， 2016）計算葉綠體基因組矩陣的長度、變異位點以及堿基組成頻率。以圓籽荷（A. oblata）為外類群（閆明慧等，2021），基于葉綠體基因組序列，用RAxML 7.2.6軟件（Stamatakis， 2006）中的最大似然法（maximum likelihood， ML）構建系統發育樹，堿基替換模型設定為GTRGAMMA，用隨機起始樹，矩陣重復抽樣100次計算支持率（bootstrap support）。

用MUSCLE 3.8.1軟件（Edgar， 2004）對798個單拷貝核基因序列分別進行比對，之后用自創R包alignmentFilter（Zhang et al.， 2023）過濾比對不可靠區段，刪除缺失（gap）超過90%的位點，并去掉矩陣中序列長度低于100 bp的序列及矩陣長度低于500 bp的基因，最終獲得689個基因用于后續分析。通過PhyloSuite 1.2.2軟件（Zhang et al.， 2020）將689個核基因進行串聯，計算串聯矩陣的長度、變異位點以及堿基組成頻率，并以山茶科四川大頭茶（Polyspora speciosa）為外類群（Wu et al.， 2022）構建系統發育樹，方法和參數設置與上述相同。

1.3.4 基于核基因的基因流分析 為檢驗六堡茶群體種與突肋茶核基因組之間是否存在基因流，分別開展了STRUCTURE分析和D檢驗（ABBA-BABA統計檢驗）。STRUCTURE分析：利用PGDSpider 2.1.1.5軟件（Lischer amp; Excoffier， 2012）將32份六堡茶群體種和突肋茶樣品的核基因串聯矩陣從FASTA格式轉換為VCF格式。通過Admixture 1.3.0軟件（Alexander et al.， 2009）分析32份樣品的種群結構和遺傳混合程度，分別假設樣品的分群數（K值）為1～10進行聚類，根據CV誤差（cross validation error）得到最佳K值（CV誤差最小）。D檢驗：使用Dsuite 0.4 r42軟件進行了ABBA-BABA統計檢驗（Malinsky et al.， 2021）。該檢驗利用四個分類單元P1、P2、P3和O，以O為外群，將P1和P2作為一對姐妹種，將P3作為與P1或P2具有潛在基因流的物種。統計具有ABBA和BABA等位基因模式的位點數量。D統計量來自計算D=（nABBA-nBABA）/（nABBA+nBABA），其中nABBA和nBABA分別為具有ABBA和BABA模式的位點總數。如果D≠0，Z-score gt;3和P值lt; 0.05，則存在基因流。根據葉綠體系統樹結果推測，與突肋茶近緣的六堡茶群體種樣品可能與突肋茶有基因流。鑒于此，我們進一步根據核基因系統發育關系選擇樣品分別作為P1、P2、P3、O進行D檢驗：P1分別用與六堡茶群體種近緣的12份栽培茶樣品（簡稱ZPC）、與六堡茶群體種近緣的其余4個茶組植物（簡稱NO-ZPC），與茶近緣的六堡茶群體種13份樣品（簡稱LP）；P2則分別用與突肋茶近緣的六堡茶群體種14份樣品（簡稱LP-TLC），與茶近緣的六堡茶群體種13份樣品（簡稱LP）；P3分別用突肋茶5份樣品（簡稱TLC）和與突肋茶近緣的2個物種（簡稱NO-TLC）；O為外類群，選擇系統發育關系在茶、突肋茶和茶組物種外且相對近緣的包含3個物種的一分支為外類群。

1.3.5 六堡茶群體種樣品的葉綠體基因組分歧進化時間估算 根據葉綠體基因組構建的六堡茶群體種系統發育關系，選擇具有系統發育代表性的6份樣品，即分散在不同支系、代表不同來源的兩大類葉綠體基因組序列（見結果部分），將6份樣品的葉綠體基因組序列整合到已發表的山茶科分化時間估算所用的葉綠體基因組數據中（Yu et al.， 2017），共77份樣品，比對后矩陣長度為156 954 bp。參照Yu等（2017）的方法，用8個化石標定點，使用BEAST 2.6.6軟件（Bouckaert et al.， 2014）估算六堡茶群體種葉綠體基因組序列分歧進化暨關鍵演化事件發生的時間，具體設置：先驗樹采用birth-death模型提供物種或基因分化的先驗信息，并結合松弛分子鐘模型lognormal（UCLN）relaxed clock處理進化速率的變異，運行5億代，每5萬代取樣一次；使用Tracer 1.7.2軟件（Rambaut et al.， 2018）檢查收斂情況，以確保有效采樣值（ESS）均大于100；使用TreeAnnotator 2.6.6軟件（Bouckaert et al.， 2014）舍棄掉初始的20%樣本，利用剩余80%生成最大可信度時間樹（maximum credibility chronogram， MCC）；用FigTree 1.3.1軟件（Rambaut， 2010）對時間樹進行展示和美化。

1.3.6 遺傳多樣性分析 利用DnaSP 5.10軟件（Librado amp; Rozas， 2009）對六堡茶群體種的葉綠體基因組序列矩陣和串聯核基因序列矩陣進行遺傳多樣性分析：分別計算單倍型數目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異、單倍型多樣性標準差以及單倍型多樣性方差。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組的基本結構

27份六堡茶群體種的葉綠體基因組總長度范圍為156 430～157 131 bp，序列平均長度為156 928 bp，GC含量均為37.3%。六堡茶群體種的葉綠體基因組結構為典型的環狀四分體，由一個大單拷貝區（large single copy， LSC），2個反向的重復區（inverted repeat， IR）以及一個小單拷貝區（small single copy， SSC）組成（圖1）。LSC的長度為85 531～86 669 bp，平均長度為86 513 bp；IR的長度為26 018～26 090 bp，平均長度為26 051 bp；SSC的長度為18 258～18 294 bp，平均長度為18 276 bp。27份六堡茶群體種樣品均包含132個基因，其中87個蛋白質編碼基因，37個tRNA基因，8個rRNA基因（表3）。

2.2 矩陣基本信息

葉綠體基因組構成的矩陣比對后序列全長為162 774 bp，包含152 625個保守位點和5 457個變異位點；變異位點中包含1 578個簡約信息位點。135條序列的堿基含量平均值分別為A = 31.1%，T=31.6%，C=19.0%，G=18.3%，其中A+T（62.7%）的含量較高。

689個單拷貝核基因串聯矩陣全長為843 771 bp，包含772 399個保守位點和71 345個變異位點；變異位點中包含31 251個簡約信息位點；70條序列的堿基含量平均值分別為A=27.1%，T=26.5%，C=21.5%，G=24.9%，其中A+T（53.6%）的含量略高。

2.3 系統發育關系和種間雜交

葉綠體基因組最大似然樹（圖2）顯示，27份六堡茶群體種可分為系統發育關系較遠的2大組。其中，一組包含13份六堡茶群體種樣品，它們分散嵌入到主要由茶（C. sinensis）組成的一支內部（BS=100%），該分支還嵌入幾個山茶屬其他物種；另一組包括了剩余的14份六堡茶群體種樣品，它們自成單系（BS=95%），與突肋茶（C. costata）最近緣（BS=98%），并且嵌入突肋茶內部與其中一支突肋茶互為姐妹（BS=51%）。葉綠體基因組系統樹表明，27份六堡茶群體種的母本至少包括兩種來源，其中一組來自茶，另一組來自突肋茶。

基于核基因串聯矩陣構建的最大似然樹（圖3）顯示，27份六堡茶群體種與栽培茶及其他幾個山茶屬物種構成一個多歧（polytomy）分支（BS=68%），該分支與突肋茶系統發育關系較遠。由此表明，部分六堡茶群體種樣品在葉綠體基因組樹上與突肋茶最近緣最可能是因為雜交，部分六堡茶群體種的祖先捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。

2.4 基于核基因的六堡茶群體種和突肋茶基因流分析

基于核基因，對32份六堡茶群體種和突肋茶進行遺傳混合程度分析結果表明，當K=2時，CV誤差最小，即為最佳K值（圖4：A）。32份樣品可分為2個類群即六堡茶群體種和突肋茶，2個類群之間沒有遺傳物質混合，即未檢測到基因流（圖4：B）。D檢驗同樣檢測不到六堡茶群體種和突肋茶之間有基因流（表4）。上述核質基因組系統發育矛盾已表明，部分六堡茶群體種的祖先曾與突肋茶發生過雜交事件，但可能因為雜交后代作為母本又反復與父本六堡茶群體種發生了回交，經過多代回交后，這些捕獲了突肋茶葉綠體基因組的雜交后代核基因組中的突肋茶基因已被充分稀釋，所以根據核基因序列已檢測不到基因流。

2.5 六堡茶群體種與突肋茶雜交的時間

基于葉綠體基因組數據估算的分子鐘結果（圖5）表明，部分六堡茶群體種的祖先大約于1.55百萬年前 （95% HPD：0.80～2.47 Ma）的第四紀時期與部分突肋茶的祖先發生了雜交，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。雜交事件遠早于人類栽培和制作茶的歷史。

2.6 遺傳多樣性

六堡茶群體種的遺傳多樣性分析結果（表5）顯示，27份葉綠體基因組序列共定義了16個單倍型，單倍型多樣性為0.949，核苷酸多樣性為0.000 9，平均核苷酸差異為140.057，單倍型多樣性方差為0.000 62，單倍型多樣性標準差為0.025。而27份六堡茶群體種單拷貝核基因串聯序列共定義了27個單倍型，單倍型多樣性為1，核苷酸多樣性為0.004 72，平均核苷酸差異為2 598.37，單倍型多樣性方差為0.000 1，單倍型多樣性標準差為0.01。

3 討論與結論

3.1 六堡茶群體種雜交捕獲突肋茶葉綠體基因組的歷史過程

部分六堡茶群體種樣品在基于葉綠體基因組和核基因重建的系統樹上的位置顯著不同（核質結果不一致）。在葉綠體樹上，部分六堡茶群體種樣品與突肋茶最近且嵌入其內部，而在核基因樹上，這些樣品與突肋茶親緣關系較遠。除上述部分六堡茶群體種樣品以外，其余茶樣品在葉綠體和核基因樹上都與突肋茶親緣關系較遠。已有研究表明，葉綠體捕獲事件是核質系統發育關系不一致的重要原因之一（Fehrer et al.， 2007；Yi et al.， 2015；Liu et al.， 2017），葉綠體捕獲在同域分布（或分布區重疊）和生殖相容的物種間可能頻繁發生（Acosta amp; Premoli， 2010）。根據記載，野生突肋茶在廣東、廣西和貴州均有分布，尤其是廣西賀州昭平縣有豐富的野生突肋茶資源（李朝昌等，2019）。這表明六堡茶群體種與突肋茶的分布區有重疊，為雜交提供了可能性。因此，造成六堡茶群體種部分樣品在葉綠體樹上與突肋茶最近緣的最可能原因是它們的祖先與部分突肋茶的祖先發生了雜交，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。在串聯核基因樹上，含有突肋茶類型葉綠體基因組的六堡茶群體種樣品與其他六堡茶群體種樣品均不與突肋茶最近，表明這些樣品雖然為雜交后代，但可能因為雜交后代作為母本又反復與父本六堡茶群體種發生了回交，經過多代回交后，這些雜交后代核基因組中的突肋茶基因已被充分稀釋，所以沒有雜交后代個體在核基因樹上與突肋茶最近緣。基于核基因串聯矩陣的基因流分析也未檢測到六堡茶群體種樣品與突肋茶之間的基因流，這進一步支持了雜交后代個體核基因組中突肋茶基因已被充分稀釋的推測。這一推測也與先前的研究相符，即當不同物種發生雜交后，雜交后代與親本反復回交會導致葉綠體基因組從一個物種滲入到另一個物種，最終導致回交后代的細胞核與細胞質遺傳信息來自不同的物種（Rieseberg amp; Soltis， 1991；Acosta amp; Premoli， 2010；Kleinkopf et al.， 2019）。此外，雜交后代個體中，葉綠體基因組序列和核基因序列都有相當程度的分化，這有兩種可能的解釋：一種是一次古老雜交產生的雜交后代發生了分化；另一種是含有不同單倍型的六堡茶群體種與突肋茶發生多次近期獨立雜交。鑒于雜交后代核基因與純系六堡茶群體種及其他茶品種最近而與突肋茶較遠，并且雜交后代樣品在葉綠體樹上為單系并嵌入突肋茶內部，以及雜交后代樣品與突肋茶在核基因組中未檢測到基因流，因此我們推測所取樣的六堡茶群體種雜交樣品更可能是其祖先與部分突肋茶祖先發生一次古老雜交的后代。分子鐘結果進一步表明，六堡茶群體種父本祖先與突肋茶母本祖先在1.55百萬年前的第四紀時期發生了雜交和葉綠體基因組捕獲，該事件的發生遠遠早于人類栽培和制作茶的歷史。因此，現有六堡茶群體種多樣性應是選育了具有不同母系來源的野生六堡茶，而非在栽培過程中人為介導了雜交。

3.2 六堡茶群體種遺傳多樣性

無論在葉綠體基因組上還是核基因上，六堡茶群體種的單倍型多樣性與核苷酸多樣性相比，單倍型多樣性都較高，這可能是因為少量堿基突變能迅速增加單倍型多樣性，但核苷酸多樣性卻難以在短期內迅速增加。六堡茶群體種葉綠體基因組的單倍型多樣性（0.949）遠高于Petit等計算的170種植物的葉綠體DNA多樣性的平均值0.67（Petit et al.， 2005），這在一定程度上表明六堡茶群體種的遺傳多樣性較高，與王留彬等（2022）基于SSR對六堡茶群體種進行的遺傳多樣性分析得出六堡茶群體種遺傳多樣性高的結論一致。Zhang等（2021）研究發現，雜交或基因漸滲會提高茶樹的遺傳多樣性。六堡茶群體種通過雜交捕獲了突肋茶的葉綠體基因組，從而使得六堡茶群體種遺傳多樣性較高。六堡茶群體種具有豐富的遺傳多樣性和較高的演化潛力，應充分保護具有不同遺傳背景的個體， 這有利于六堡茶產業的可持續發展，并為進一步的遺傳改良和品質提升提供更多的選擇性和可能性。

3.3 六堡茶品種選育和資源開發利用

優質的茶樹品種是茶葉優異品質形成的重要因素（劉佳等，2013）。茶樹品種影響茶葉化學成分組成與含量，從而影響茶葉的品質（郭桂義等，2010）。隨著六堡茶市場不斷擴大，為滿足日益增長的需求，六堡茶的制作除了使用傳統的六堡茶群體種外，還引進了其他外地的適制品種，如凌云白毫茶、臨桂白毫茶、資源大桂茶等，加之六堡茶茶園里茶樹品種來源不一，導致市場上部分六堡茶產品失去了其原來的品質特點（劉曉東等，2013）。本研究顯示，六堡茶群體種具有不同的遺傳背景和演化歷史，具有較高遺傳多樣性。這為進一步探索不同遺傳背景與農藝性狀和茶品質之間的關聯提供了契機。未來研究可通過遺傳的深入分析和農藝性狀的評估，探索不同品種間的遺傳差異與茶葉品質之間的關系，為高品質的六堡茶株系或品種的選育、鑒定和開發利用提供新的思路和方案。此外，借鑒六堡茶與突肋茶間的自然雜交，可以開展種間或品種間人工雜交。通過定向雜交引入其他品種或種類的優質基因，可以進一步改良六堡茶的品質特點，獲得高品質的新品種。

參考文獻：

ACOSTA MC， PREMOLI AC， 2010. Evidence of chloroplast capture in South American Nothofagus （subgenus Nothofagus， Nothofagaceae） ［J］. Molecular Phylogenetics amp; Evolution， 54： 235-242.

ALEXANDER DH， NOVEMBRE J， LANGE K， 2009. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals ［J］. Genome Research， 19（9）： 1655-1664.

BOUCKAERT R， HELED J， KHNERT D， et al.， 2014. BEAST 2： a software platform for bayesian evolutionary analysis ［J］. PLOS Computational Biology， 10（4）： e1003537.

CHEN J， LIAO CS， LIU CM， et al.， 2020. Introduction to clonal tea cultivars suitable for ‘Liubao’ tea production in Guangxi" ［J］. Southern Agriculture， 14（19）： 53-56." ［陳佳， 廖傳盛， 劉春梅， 等， 2020. 適制六堡茶的廣西無性系茶樹良種介紹 ［J］. 南方農業， 14（19）： 53-56.］

CHEN J， QIN XJ， LAI ZR， et al.， 2010. Study on improved technologies of ‘Liubao’ tea native species ［J］. Chinese Horticulture Abstracts， 26（9）： 183-184. ［陳佳， 覃秀菊， 賴兆榮， 等， 2010. 六堡茶原生種的改良技術探討 ［J］. 中國園藝文摘， 26（9）： 183-184.］

CHEN SF， ZHOU YQ， CHEN YR， et al.， 2018. Fastp： an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor ［J］. Bioinformatics，34（17）： i884-i890.

CHEN ZM， 1992. The tea classics of China" ［M］. Shanghai： Shanghai Culture Publishing House： 130." ［陳宗懋， 1992. 中國茶經 ［M］. 上海： 上海文化出版社： 130.］

COHEN KM， FINNRY SC， GIBBARD PL， et al.， 2013. The ICS international chronostratigraphic chart ［J］. Episodes， 36： 199-204.

Compilation Committee of Records of Tea Plant Cultivars in China， 2001. Records of tea plant cultivars in China" ［M］. Shanghai： Shanghai Scientific and Technical Publishers： 187." ［中國茶樹品種志編寫委員會， 2001. 中國茶樹品種志 ［M］. 上海： 上海科學技術出版社： 187.］

EDGAR RC， 2004. MUSCLE： Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput ［J］. Nucleic Acids Research， 32（5）： 1792-1797.

EMMS DM， KELLY S， 2019. OrthoFinder： Phylogenetic orthology inference for comparative genomics ［J］. Genome Biology， 20（1）： 238.

FEHRER J， GEMEINHOLZER B， CHRTEK J， et al.， 2007. Incongruent plastid and nuclear DNA phylogenies reveal ancient intergeneric hybridization in Pilosella hawkweeds （Hieracium， Cichorieae， Asteraceae） ［J］. Molecular Phylogenetics amp;" Evolution， 42（2）： 347-361.

FU LM， NIU BF， ZHU ZW， et al.， 2012. CD-HIT： accelerated for clustering the next-generation sequencing data ［J］. Bioinformatics， 28（23）： 3150-3152.

GONG MS， LU CL， LU YK， et al.， 2021. Exploitation and utilization of wild tea germplasm resources in Zhaoping County ［J］. Agricultural Research and Application， 34（4）： 68-72." ［龔明壽， 陸超麗， 盧一科， 等， 2021. 昭平縣野生茶樹種質資源開發利用初探 ［J］. 農業研究與應用， 34（4）： 68-72.］

GUO C， PI FJ， WU CM， et al.， 2021. Genome-wide SNP developed by genotyping-by-sequencing revealed the phylogenetic relationship of Sect. Thea （L.） Dyer resources in Guizhou ［J］. Journal of" Southern Agriculture， 52（3）： 660-670." ［郭燦， 皮發娟， 吳昌敏， 等， 2021. 基于GBS測序的全基因組SNP揭示貴州地方茶組植物資源的親緣關系 ［J］. 南方農業學報， 52（3）： 660-670.］

GUO GY， YAN PF， WEN H， et al.， 2010. Comparison of chemical components and organoleptic quality of Xinyang maojian tea made by Anjibaicha and the Xinyang community variety ［J］. Food Science and Technology， 35（6）： 118-121. ［郭桂義， 嚴佩峰， 文宏， 等， 2010. 安吉白茶與信陽群體種信陽毛尖茶化學成分和品質的比較 ［J］. 食品科技， 35（6）： 118-121.］

HAAS BJ， PAPANICOLAOU A， YASSOUR M， et al.， 2013. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the trinity platform for reference generation and analysis ［J］. Nature Protocols， 8（8）： 1494-1512.

HALL TA， 1999. BioEdit： a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Window 95/98/NT ［J］. Nucleic Acids Symposium Series， 41： 95-98.

HUANG H， TONG Y， ZHANG QJ， et al.， 2013. Genome size variation among and within Camellia species by using flow cytometric analysis ［J］. PLoS ONE， 8（5）： e64981.

HUANG HC， JIANG WX， LIANG CX， et al.， 2021. EST-SSR-based analysis on genetic diversity of ancient Liupao tea trees and their progeny in Guangxi ［J］. Molecular Plant Breeding， 19（7）： 2410-2418. ［黃厚宸， 蔣維昕， 梁彩霞， 等， 2021. 廣西六堡茶古茶樹及其子代遺傳多樣性的EST-SSR標記分析 ［J］. 分子植物育種， 19（7）： 2410-2418.］

JIN JJ， YU WB， YANG JB， et al.， 2020. GetOrganelle： A fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes ［J］. Genome Biology， 21（1）： 241.

KATOH K， STANDLEY DM， 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7： Improvements in performance and usability ［J］. Molecular Biology amp; Evolution， 30（4）： 772-780.

KLEINKOPF JA， ROBERTS WR， WAGNER WL， et al.， 2019. Diversification of Hawaiian Cyrtandra （Gesneriaceae） under the influence of incomplete lineage sorting and hybridization ［J］. Journal of" Systematics and" Evolution， 57（6）： 561-578.

KUMAR S， STECHER G， TAMURA K， 2016. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets ［J］. Molecular Biology Evolution， 33（7）： 1870-1874.

LI CC， DENG HQ， OU SJ， et al.， 2019. A preliminary report on investigating wild Camellia costata in Zhaoping County， Guangxi ［J］. Journal of" Guangxi Agriculture， 34（5）： 34-36. ［李朝昌， 鄧慧群， 區勝基， 等， 2019. 廣西昭平縣野生突肋茶調查初報 ［J］. 廣西農學報， 34（5）： 34-36.］

LI L， HU YF， HE M， et al.， 2021. Comparative chloroplast genomes： Insights into the evolution of the chloroplast genome of Camellia sinensis and the phylogeny of Camellia ［J］. BMC Genomics， 22（1）： 138.

LI MM， MEEGAHAKUMBURA MK， YAN LJ， et al.， 2015. Genetic involvement of Camellia taliensis in the domestication of C. sinensis var. assamica （Assimica tea） revealed by nuclear microsatellite markers ［J］. Plant Diversity and Resources， 37（1）： 29-37. ［李苗苗， MEEGAHAKUMBURA MK， 嚴麗君， 等， 2015. 核基因組微衛星標記揭示大理茶參與了普洱茶的馴化過程 ［J］. 植物分類與資源學報， 37（1）： 29-37.］

LIBRADO P， ROZAS J， 2009. DnaSP v5： A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data ［J］. Bioinformatics， 25（11）： 1451-1452.

LISCHER HE， EXCOFFIER L， 2012. PGDSpider： An automated data conversion tool for connecting population genetics and genomics programs ［J］. Bioinformatics， 28（2）： 298-299.

LIU J， LIANG LY， FENG JC， et al.， 2013. Research progress of factors influencing the quality of Xinyang maojian ［J］. Journal of" Henan Agricultural Sciences， 42（7）： 1-5. ［劉佳， 梁麗云， 馮建燦， 等， 2013. 信陽毛尖品質影響因素研究進展 ［J］. 河南農業科學， 42（7）： 1-5.］

LIU X， WANG Z， SHAO W， et al.， 2017. Phylogenetic and taxonomic status analyses of the Abaso section from multiple nuclear genes and plastid fragments reveal new insights into the North America origin of Populus （Salicaceae） ［J］. Frontiers in Plant Science， 7： 2022.

LIU XD， YANG C， TANG ZB， et al.， 2013. Research on the genetic marks of tea plants that suitable to make Liubao tea and their roles in the breeding of Liubao tea ［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin， 29（4）： 136-140. ［劉曉東， 楊春， 湯周斌， 等， 2013. 適制六堡茶茶樹品種部分遺傳標記特征及其在六堡茶選育種中的作用 ［J］. 中國農學通報， 29（4）： 136-140.］

MALINSKY M， MATSCHINER M， SVARDAL H， 2021. Dsuite-fast D-statistics and related admixture evidence from VCF files ［J］. Molecular Ecology Resources， 21（2）： 584-595.

MEEGAHAKUMBURA MK， WAMBULWA MC， THAPA KK， et al.， 2016. Indications for three independent domestication events for the tea plant （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） and new insights into the origin of tea germplasm in China and India revealed by nuclear microsatellites ［J］. PLoS ONE， 11（5）： e0155369.

MING TL， BARTHOLOMEW B. Theaceae ［M］//WU ZY， RAVEN PH， HONG DY， 2007. Flora of China： Vol. 12. Beijing： Science Press; St. Louis： Missouri Botanical Garden Press.

PETIT RJ， DUMINIL J， FINESCHI S， et al.， 2005." INVITED REVIEW： Comparative organization of chloroplast， mitochondrial and nuclear diversity in plant populations ［J］. Molecular Ecology， 14（3）： 689-701.

QIU RJ， LONG ZR， YU CP， et al.， 2020. Investigation， development and protection of the population resources of the Liupao tea ［J］. China Tea Processing （3）： 15-19. ［邱瑞瑾， 龍志榮， 于翠平， 等， 2020. 六堡茶群體種資源的調查、開發和保護 ［J］. 中國茶葉加工 （3）： 15-19.］

QU XJ， MOORE MJ， LI DZ， et al.， 2019. PGA： A software package for rapid， accurate， and flexible batch annotation of plastomes ［J］. Plant Methods， 15： 50.

RAMBAUT A， 2010. FigTree v1.3.1 ［CP］. Edinburgh， UK： Institute of Evolutionary Biology， University of Edinburgh. http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/.

RAMBAUT A， DRUMMOND AJ， XIE D， et al.， 2018. Posterior summarization in Bayesian phylogenetics using Tracer 1.7 ［J］. Systematic Biology， 67（5）： 901-904.

RIESEBERG LH， SOLTIS DE， 1991. Phylogenetic consequences of cytoplasmic gene flow in plants ［J］. American Journal of" Botany， 5（1）： 65-84.

STAMATAKIS A， 2006. RAxML-VI-HPC： maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models ［J］. Bioinformatics， 22（21）： 2688-2690.

TENG CQ， QIU RJ， YU CP， et al.， 2020. Investigation on the characteristics and utilization status of wild ancient tea tree resources in Cenxi City" ［J］. Southern Agriculture， 14（4）： 45-48." ［滕翠琴， 邱瑞瑾， 于翠平， 等， 2020. 岑溪市野生古茶樹資源特征與開發利用現狀調查 ［J］. 南方農業， 14（4）： 45-48.］

UENO S， TSUMURA Y， 2009. Development of microsatellite and amplicon length polymorphism markers for Camellia japonica L. from tea plant （Camellia sinensis） expressed sequence tags ［J］. Molecular Ecology Resources， 9（3）： 814-816.

WANG H， OOI BC， TAN KL， et al.， 2003. BLAST++： BLASTing queries in batches ［J］. Bioinformatics，19（17）： 2323-2324.

WANG LB， HUANG LY， TENG CQ， et al.， 2022. Genetic and phylogenetic analysis for germplasm resources of Camellia sinensis from Wuzhou City ［J］. Journal of" Tea Science， 42（5）： 601-609. ［王留彬， 黃麗蘊， 滕翠琴， 等， 2022. 梧州茶樹種質資源的遺傳多樣性及親緣關系分析 ［J］. 茶葉科學， 42（5）： 601-609.］

WANG XC， FENG H， CHANG YX， et al.， 2020. Population sequencing enhances understanding of tea plant evolution ［J］. Nature Communications，11（1）： 4447.

WU Q， TONG W， ZHAO HJ， et al.， 2022. Comparative transcriptomic analysis unveils the deep phylogeny and secondary metabolite evolution of 116 Camellia plants ［J］. The Plant Journal， 111（2）： 406-421.

YAN MH， LIU K， WANG M， et al.， 2021. Complete chloroplast genome of Camellia sinensis cv. Xinyang 10 and its phylogenetic evolution ［J］. Journal of Tea Science， 41（6）： 777-788. ［閆明慧， 劉柯， 王滿， 等， 2021. 信陽10號葉綠體基因組及其系統進化 ［J］. 茶葉科學， 41（6）： 777-788.］

YANG SX， 2021a. Thinking on the taxonomy of Camellia sect. Thea ［J］. Journal of Tea Science， 41（4）： 439-453. ［楊世雄， 2021a. 茶組植物的分類歷史與思考 ［J］. 茶葉科學， 41（4）： 439-453.］

YANG SX， 2021b. Tea-plant （Camellia sect. Thea） in Guangxi， China ［J］. Guangxi Forestry Science， 50（4）： 414-416. ［楊世雄， 2021b. 廣西的茶樹資源 ［J］. 廣西林業科學， 50（4）： 414-416.］

YANG Y， MOORE MJ， BROCKINGTON SF， et al.， 2015. Dissecting molecular evolution in the highly diverse plant clade Caryophyllales using transcriptome sequencing ［J］. Molecular Biology Evolution， 32（8）： 2001-2014.

YE XQ， ZHAO ZH， ZHU QW， et al.， 2014. Entire chloroplast genome sequence of tea （Camellia sinensis cv. Longjing 43）： A molecular phylogenetic analysis ［J］. Journal of Zhejiang University （Agriculture and Life Sciences）， 40（4）： 404-412. ［葉曉倩， 趙忠輝， 朱全武， 等， 2014. 茶樹‘龍井43’葉綠體基因組測序及其系統進化（英文） ［J］. 浙江大學學報（農業與生命科學版）， 40（4）： 404-412.］

YI TS， JIN GH， WEN J， 2015. Chloroplast capture and intra- and inter-continental biogeographic diversification in the Asian-New World disjunct plant genus Osmorhiza （Apiaceae） ［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution， 85： 10-21.

YU XQ， GAO LM， SOLTIS DE， et al.， 2017. Insights into the historical assembly of East Asian subtropical evergreen broadleaved forests revealed by the temporal history of the tea family ［J］. New Phytologist， 215（3）： 1235-1248.

ZAN T， HE YT， ZHANG M， et al.， 2023. Phylogenomic analyses of Camellia support reticulate evolution among major clades ［J］. Molecular Phylogenetics and" Evolution， 182： 107744.

ZHANG D， GAO FL， JAKOVLIC＇ I， et al.， 2020. PhyloSuite： An integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies ［J］. Molecular Ecology Resources，20（1）： 348-355.

ZHANG Q， QIN XM， LU YB， et al.， 2023. A comprehensive alignment-filtering methodology improves phylogeny particularly by filtering overly divergent segments" ［EB/OL］. https：//doi.org/10.1101/2023.12.26.573321.

ZHANG XT， CHEN S， SHI LQ， et al.， 2021. Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis ［J］. Nature Genetics， 53（8）： 1250-1259.

ZHOU YH， QIAO XY， MA CL， et al.， 2011. Genetic diversity and structure of tea landraces from Guangxi， based on EST-SSR analysis ［J］. Scientia Silvae Sinicae， 47（3）： 59-67. ［周炎花， 喬小燕， 馬春雷， 等， 2011. 廣西茶樹地方品種遺傳多樣性和遺傳結構的EST-SSR分析 ［J］. 林業科學， 47（3）： 59-67.］

（責任編輯 李 莉 王登惠）

基金項目：" 廣西創新驅動發展專項（桂科AA20302018-1）； 廣西自然科學基金（2023GXNSFAA026221）； 廣西喀斯特植物保育與恢復生態學重點實驗室項目（22-035-26）。

第一作者： 姚淑婷（1998—），碩士研究生，主要從事植物系統發育研究，（E-mail）1150487855@qq.com。

*通信作者：" 覃信梅，碩士，助理研究員，主要從事植物系統演化和生物信息學研究，（E-mail）xinmeiqin2018@163.com。