基于VIGS的不同表達載體混合接種對烤煙煙堿代謝的影響

摘要：煙堿的代謝具有復雜的基因調控網絡，其中眾多基因間存在相互影響，為探究不同基因共同沉默后對煙堿代謝通路以及葉片煙堿含量的影響。使用前期構建的煙堿代謝途徑中3個功能基因（NtA622、NtPMT、NtBBL）和1個調控基因（NtMYB305a）病毒載體，利用病毒誘導基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技術依據基因在煙堿代謝中的作用性質和作用階段，設置不同載體組合浸染液接種處理，測定各處理的基因相對表達量、酶活性、煙堿含量，系統分析目的基因沉默效率以及沉默后對其他基因表達的影響，并探究各處理的基因平均沉默效率對煙堿降低率的貢獻度。結果表明，各處理沉默相應目的基因，會在一定程度上影響本研究中其他目的基因的表達，其中NtA622基因受影響較小，而NtPMT、NtBBL基因受影響較大；各處理煙堿含量均得到降低，其中D6處理4個基因共同沉默后煙堿含量降低幅度最大，PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢基本一致，A622活性與煙堿含量趨勢不完全一致；基因平均沉默效率低于煙堿含量降低率越多，說明對煙堿降低的貢獻度越大，基因平均沉默效率高于煙堿含量降低率越多，說明對煙堿降低的貢獻度越小。由此可知，利用VIGS技術可有效沉默目的基因的表達，進而降低葉片中煙堿含量，其中4個基因共同沉默后，煙堿含量降低最多；在煙堿代謝途徑上，NtA622基因相對較穩定，而NtPMT與NtBBL基因相對不穩定；PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢基本一致。本研究為烤煙煙堿的分子調控提供了理論和技術支撐。

關鍵詞：VIGS；混合載體；煙堿；基因表達量；酶活性；基因平均沉默效率

中圖分類號：S572.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0016-07

卜亞艇，李" 偉，許燕彪，等. 基于VIGS的不同表達載體混合接種對烤煙煙堿代謝的影響［J］. 江蘇農業科學，2025，53（3）：16-23.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.003

收稿日期：2024-07-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：32372178）；福建省煙草公司南平市公司科技計劃（編號：2021350700240072、2022350700240103）。

作者簡介：卜亞艇（1998—），女，河南開封人，碩士研究生，從事煙草遺傳育種研究。E-mail：15637855832@163.com。

通信作者：楊再軍，碩士，從事烤煙生產技術研究，E-mail：yangzaijun528@163.com；鄭" 聰，碩士，農藝師，從事烤煙生產技術研究，E-mail：npyczc@163.com；徐世曉，博士，副教授，從事煙草遺傳育種研究，E-mail：xushixiao@henau.edu.cn。

對于煙草而言，煙堿的存在是其具有獨特魅力和商品價值的重要因素，作為煙草特有的活性化學成分，不僅直接影響著葉片的生理活性，還是煙草制品成癮性的主要成分［1-2］。煙堿的合成場所在煙株的根部，其他組織或器官均不具備合成煙堿的能力［3］。煙堿的代謝途徑已基本明確，大致可由3個步驟組成（圖1），包括吡啶環和吡咯環的形成以及2環的結合［4］。

在煙堿代謝途徑里的吡咯環形成中，腐胺-N-甲基轉移酶（PMT）具有催化作用，能夠催化腐胺生成S-腺苷甲硫氨酸和N-甲基腐胺［6］。同時PMT也是煙堿生物合成的關鍵控制酶，控制著初級代謝產物向次級代謝產物的轉化，供應煙堿合成所需的N-甲基吡咯啉陽離子［7］。A622是一個異類黃酮還原酶基因，通過消減雜交技術與PMT一起分離得到［8］；小檗堿橋接酶（BBL）基因家族存在于細菌、真菌和植物里，該基因家族在煙堿合成途徑的下游發揮作用［9］。研究表明，PIP家族異類黃酮還原酶類蛋白A622參與煙堿代謝途徑里的吡啶環形成［9］，同時與小檗堿橋接酶類蛋白BBL共同參與煙堿合成的最后步驟：吡啶環與吡咯環的結合［10-11］。在煙草中，NtMYB305a屬于R2R3-MYB轉錄因子家族，是擬南芥轉錄因子AtMYB21和AtMYB24的同源基因，研究證實NtMYB305a可以顯著調控煙草中煙堿的合成，過表達或者沉默NtMYB305a會顯著提高或降低煙草葉片中的煙堿含量，同時對煙草煙堿合成基因NtPMT、 NtA622以及NtBBL的表達具有調

控作用［12-13］。煙堿的生物合成和累積受到遺傳基礎、生態環境、栽培措施、外源物質、采收與調制等因素的影響，然而經濟效益差和工序繁瑣是導致眾多調節煙堿含量的措施沒有得到廣泛推廣的主要原因［14］。

基因沉默的本質是降低或者停止基因在植株體內的表達。病毒誘導的基因沉默（VIGS）屬于轉錄后水平基因沉默，無需依靠轉基因植株就可以在植物體內短時間且精確地完成對內源目的基因完成沉默［15］。VIGS技術具有高效性，通過農桿菌侵染法將含目的基因片段的病毒載體導入植株中，在植株中能進行遠距離傳導，進而完成系統沉默，從很大程度上節約了人力物力。目前VIGS技術已在植物功能基因的鑒定和植物抗病抗蟲基因研究中被廣泛使用［16-17］。近年來，在煙草中也有大量應用，姚怡帆等利用VIGS技術沉默NtPPO8基因，有效降低其基因表達量，進而降低PPO（多酚氧化酶）活性，提高煙葉耐烤性［18］；崔露瑩等構建NtHDZIV8基因的沉默載體，初步驗證了該基因對煙草腺毛發育的調控作用［19］；郭玉鴿等利用VIGS技術將混合載體菌液接種到普通煙草中，目的基因得到不同的沉默效率［20］。盡管有研究表明利用VIGS技術在本氏煙草中沉默腐胺N-甲基轉移酶基因，能夠降低本氏煙草中煙堿含量，但并沒有在普通栽培煙草中進行驗證［21］。在降低煙草中煙堿含量方面，國內外研究人員在多個途徑上進行了大量研究，但利用VIGS技術通過對煙堿代謝通路上不同基因進行組合式沉默還鮮有報道。

煙堿生物合成是受眾多基因共同作用的結果，然而在煙堿代謝途徑中基因發揮功能的位置不一致，并且調控基因與功能基因之間存在相互作用。因此，本研究使用筆者所在實驗室已構建的4個VIGS病毒載體，依據基因性質（功能基因：NtA622、NtPMT、NtBBL；調控基因：NtMYB305a）和作用階段（NtPMT作用于上游，NtA622、NtBBL共同作用于下游）進行不同載體混合，探究各混合載體處理接種后基因相對表達量之間的差異，以及酶活性和煙堿含量的變化，從而篩選出煙堿含量降低率較高的混合接種處理，以期為生物技術手段降低烤煙煙堿含量提供理論基礎，提高煙葉在工業企業中的適配性。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

供試品種為云煙87，含沉默目的基因片段（保守區段）的病毒載體pTRV2-NtA622、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtBBL、pTRV2-NtMYB305a以及pTRV1、pTRV2的原始菌液（活性良好）均由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。試驗于2023年4月在河南農業大學科教園區煙草基地大棚內進行，材料采用盆栽種植，除試驗因素外，其余盆栽管理措施保持一致。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 試驗設計

共設置8個處理（表1）。混合載體組合依據為：3個功能基因分別與調控基因的組合沉默（D1、D2、D3），煙堿代謝途徑中下游2個功能基因的組合沉默以及2個功能基因與調控基因的組合沉默（D4、D5），3個功能基因共同與調控基因的組合沉默（D6）。每個處理選取10株6葉1心時期煙苗，要求煙苗長勢均勻一致無病蟲害，各處理每株煙苗接種對應的4 mL混合浸染液。

1.2.2" 接種體系的構建

制備LB培養基（50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL利福平），高溫高壓滅菌后分別接種含沉默目的基因片段的病毒載體 pTRV2-NtA622、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtBBL、pTRV2-NtMYB305a以及pTRV1、pTRV2的原始菌液，轉入搖床（28 ℃，200 r/min）避光恒溫培養 24 h，調整培養菌液濃度D600 nm為0.8～1.0；按照各處理所需對應的混合病毒載體菌液分別與pTRV1等體積混合，取混合菌液50 mL高速離心 2 min，棄上清液，加入50 mL農桿菌浸染緩沖液（50 mmol/L 氯化鈉、50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、0.1 mmol/L乙酰丁香酮），充分搖勻后避光2 h備用；采用注射接種法對各個處理煙苗的嫩葉背面進行接種，避開支脈，每株煙苗注射左右對稱的2張葉，每張葉注射面積的直徑約1 cm。

1.3" 測定指標

1.3.1" 基因相對表達量的測定

取各處理接種后15 d的煙株根部2 cm長的不定根，清水洗凈后去除雜質用吸水紙吸干水分，消毒后液氮凍存備用，每個處理取3份樣品作生物學重復；將樣本通過液氮研磨，參照RNA試劑盒說明提取總RNA，參照北京全式金生物公司Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書反轉錄成cDNA；根據目的基因片段序列設計擴增引物（表2），以煙草26S rRNA為內參基因進行各目的基因的qRT-PCR檢測，技術重復3次，分析檢測結果中的CT值，采用2–ΔΔCT法分析各目的基因的相對表達量；以CK、CK1為試驗對照組，CK目的基因相對表達量為1；D1～D6為試驗組。

目的基因沉默效率的計算公式為：沉默效率=（1-試驗組目的基因相對表達量）×100%。

1.3.2" 酶活性的測定

同時對根部所取樣品進行研磨，加入樣品體積9倍的提取液（pH值7.4 PBS緩沖液），于4 ℃、8 000 r/min，高速離心30 min，取上清液待用，參照酶活性測定試劑盒說明，采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別測定腐胺N-甲基轉移酶（PMT）、小檗堿橋接酶類蛋白（BBL）、異類黃酮還原酶（A622）活性。

1.3.2" 煙堿含量的測定

同時取各處理煙株新生頂部葉片3份，作生物學重復，在烘箱105 ℃下殺青30 min，60 ℃下烘干至恒定干重；對各處理殺青樣品去除主脈和支脈，研磨過60目篩，取粉狀樣品0.25 g，加入5%乙酸，振蕩30 min后取過濾液采用連續流動化學分析儀（AA3，德國 Seal 公司）測定煙堿含量。

煙堿含量降低率的計算公式為：煙堿含量降低率=（對照組煙堿含量-試驗組煙堿含量）/對照組煙堿含量×100%。

基因平均沉默效率對煙堿含量降低率的貢獻度公式為：貢獻度=煙堿含量降低率/基因平均沉默效率。

1.3" 測定指標

使用Excel 2010和DPS 7.05軟件進行相關數據統計分析，采用Duncans新復極差法比較不同處理間測定指標的顯著差異分析。

2" 結果與分析

2.1" 各處理沉默后相關基因表達量差異分析

由圖2至圖7可知，各處理接種后15 d，各基因在CK與CK1中均無顯著差異。

由圖2可知，D1處理接種后，目的基因NtA622、NtMYB305a相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為34.55%、45.59%；NtBBL和NtPMT基因均表現下調，其中NtBBL基因下調幅度最小，二者基因相對表達量差異顯著。

由圖3可知，D2處理接種后，目的基因NtPMT、NtMYB305a相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為61.99%、46.59%；NtA622基因相對表達量與CK、CK1無顯著差異，NtBBL基因表現下調，各基因相對表達量之間均存在顯著差異。

由圖4可知，D3處理接種后，目的基因NtBBL、NtMYB305a相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為57.22%、 44.02%； NtA622基因相對

表達量與CK、CK1無顯著差異，NtPMT基因表現下調，各基因相對表達量之間均存在顯著差異。

由圖5可知，D4處理接種后，目的基因NtA622、NtBBL相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為11.30%、48.44%；NtPMT和NtMYB305a基因均表現下調；各基因相對表達量之間均存在顯著差異。

由圖6可知，D5處理接種后，目的基因NtA622、NtBBL、NtMYB305a相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為20.82%、53.68%、41.07%；NtPMT基因表現下調，下調幅度低于目的基因NtBBL、NtMYB305a的降低幅度；各基因相對表達量之間均存在顯著差異。

由圖7可知，D6處理接種后，目的基因NtA622、 NtPMT、 NtBBL、 NtMYB305a相對表達量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為14.75%、61.56%、63.82%、47.02%。其中NtA622基因相對表達量最高，NtBBL基因相對表達量最低，與NtPMT基因差異不顯著。

2.2" 各處理沉默后相關酶活性的差異分析

由圖8可知，CK與CK1中A622活性無顯著差異；試驗組D2處理與D3處理的A622活性較CK略有降低但未達到顯著水平，其余試驗組較CK均顯著降低。其中D5、D6處理之間的A622活性差異不顯著，較CK分別降低了2.89、3.10 U/L，D1處理的A622活性最低，為8.21 U/L，較CK降低幅度最大，為3.80 U/L。

由圖9可知，CK與CK1中PMT活性無顯著差異，其余試驗組較CK均顯著降低。其中D1、D3、D4處理之間的PMT活性差異不顯著，較CK分別降低了1.09、1.13、1.00 U/L；D3處理與D5處理之間的PMT活性差異不顯著，D5處理較CK降低了 1.47 U/L；D6處理的PMT活性最低，為 1.76 U/L，與D2處理差異不顯著，D2處理與D6處理較CK分別降低了1.93、2.05 U/L。

由圖10可知，CK與CK1中BBL活性無顯著差異，其余試驗組較CK均顯著降低。其中D1處理的BBL活性較CK降低幅度最小，為13.03 ng/L；D3處理與D5處理之間的BBL活性差異不顯著，較CK分別降低了57.03、59.11 ng/L；D6處理的BBL活性最低，為72.65 ng/L，較CK降低了 69.71 ng/L。

2.3" 各處理沉默后葉片煙堿含量的差異分析

由圖11可知，接種混合浸染液15 d，各處理的煙堿含量較對照組CK與空載體對照組CK1都有不同程度的下降。其中CK與CK1的葉片煙堿含量變化無明顯差異，其余試驗組葉片煙堿含量較CK均存在顯著差異，葉片煙堿含量降低最少的是D1處理，煙堿含量為0.72%，較CK降低21.84%；D2處理與D3處理無顯著差異，D3處理與D4處理無顯著差異；葉片煙堿含量降低最多的是D6處理，煙堿含量為0.41%，較CK降低55.86%。

2.4" 各處理平均沉默效率對煙堿降低率的貢獻度分析

由圖12可知，D2處理的基因平均沉默效率最高，與D3處理差異不顯著，但顯著高于其他處理，D4處理的基因平均沉默效率最低，顯著低于其他處理；D6處理煙堿含量降低率顯著高于其他處理，D1處理的煙堿含量降低率最低。通過分析，D1處理的基因平均沉默效率對煙堿含量的降低率貢獻度最低，為0.545；D6基因平均沉默效率對煙堿含量的降低率貢獻度最高，為1.194。

3" 討論與結論

煙堿生物合成調控的相關研究一直是煙草學科的前沿課題，不同的煙草工業企業對煙葉原料的煙堿高低偏愛不一。部分烤煙種植區片面追求煙葉產量，大量追加氮肥，導致出現煙葉常規化學成分協調性差、煙堿含量偏高等問題［22］。楊淳婷等通過煙茄嫁接的方法對白肋煙換根，能夠顯著降低葉片中的煙堿含量，但過多降低煙堿含量導致了煙葉香氣量減少，勁頭、刺激性明顯減小［23］。張明月利用RNAi技術成功降低了PMT基因表達量，進而降低葉片煙堿含量，但只沉默了單一基因［24］。

隨著分子生物學的迅速發展，針對煙堿生物合成的調控方式也不再局限于大田措施，越來越多的調控手段開始從煙堿的代謝、轉運和上游調控等方面入手。煙堿的生物合成受代謝途徑中多個基因共同調控。有研究表明，將不同基因片段同時組合到TRV病毒載體上，可顯著降低2個基因的表達量，說明VIGS可用于同時沉默2個目標基因［25-26］；也有研究表明，VIGS 技術體系采用葉片接種后病毒可高效擴散到受體植株的根、莖和葉等器官，并且在受體植株根中能檢測到目的基因的表達量有效降低［27-28］。本研究結果表明，利用VIGS 技術對代謝途徑中4個關鍵基因分別進行組合式沉默是可行的，成功降低了煙草根中目的基因的表達量，進而降低葉片中煙堿含量。

本研究結果表明：D1處理的目的基因NtA622、NtMYB305a表現下調，NtBBL和NtPMT基因均表現下調；D2處理目的基因NtPMT、NtMYB305a表現下調，NtA622基因無顯著變化，NtBBL基因表現下調；D3處理目的基因NtBBL、NtMYB305a表現下調，NtA622基因無顯著變化，NtPMT基因表現下調；D4處理的目的基因NtA622、NtBBL表現下調，NtPMT和NtMYB305a基因均表現下調；D5處理的目的基因NtA622、NtBBL、NtMYB305a表現下調，而NtPMT基因也表現下調；D6處理的目的基因NtA622、NtPMT、NtBBL、NtMYB305a均表現下調。綜上所述，表明NtMYB305a沉默后會導致其他目的基因的表達下調，這與卞士權的研究結果［29］相似，NtMYB305a可以對NtA622、NtPMT、NtBBL基因的表達進行調控；各處理沉默相應目的基因后，會在一定程度上影響本研究中其他目的基因的表達，這與郭玉鴿等的研究結果［20］相似。根據本研究各處理沉默后各基因表達量的差異分析，NtA622基因的表達受其他基因的影響較小，原因可能是NtA622不僅參與吡啶環與吡咯環的結合，還參與其他生物堿合成的吡啶環形成途徑中煙酸衍生物前體的形成［11］。NtPMT基因的表達受其他基因的影響較大，有研究表明，NtPMT基因主要作用是在吡咯環形成途徑中催化腐胺能夠生成S-腺苷甲硫氨酸和N-甲基腐胺［30］，是煙堿代謝途徑中的上游基因；NtBBL基因的表達受其他基因的影響也較大。BBL蛋白雖然參與煙堿形成的最后階段，但NtBBL的作用階段是在吡啶環和N-甲基-吡咯環起始縮合之后，這個階段屬于煙堿代謝途徑中的下游［31］。

本研究結果表明，PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢基本一致，A622活性與煙堿含量趨勢不完全一致，各處理的煙堿含量均顯著降低，表明各處理沉默對應基因后對葉片煙堿含量的降低是有效果的，且蒲媛媛研究認為，A622活性與煙堿含量達到顯著正相關，BBL活性與煙堿含量呈負相關［32］，本研究結果與之略有差異；有研究表明，PMT活性與煙堿含量成正比［7］，本研究結果與之一致。

貢獻度可以表示混合載體接種后的目的基因平均沉默效率對煙堿含量降低多少的影響力。本研究通過分析各處理基因平均沉默效率與煙堿降低率的關系，表明基因平均沉默效率低于煙堿含量降低率越多，說明對煙堿降低的貢獻度越大；基因平均沉默效率高于煙堿含量降低率越多，說明對煙堿降低的貢獻度越小。

本研究建立的VIGS技術體系同時沉默4個目的基因的表達，基因平均沉默效率46.78%，進而有效降低煙堿含量，煙堿含量降低率55.85%，平均沉默效率對煙堿降低的貢獻度達1.194。在煙堿代謝途徑上，NtA622基因相對較穩定，而NtPMT與NtBBL基因相對不穩定；PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢基本一致。本研究進一步為煙堿合成的生物調控提供理論基礎，對于煙草栽培和育種工作等有重要科學意義。

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