在家畜精液冷凍保存中應用抗氧化劑的研究進展

摘 要：精液冷凍保存技術在畜牧養殖中具有不可替代的作用，它不僅提高繁殖效率、降低養殖成本，還為優良種質資源的保護和利用提供了重要支持。但是冷凍保存過程會出現冷凍損傷和氧化應激從而影響精液質量，因此，需要添加保護劑、抗氧化劑等外源物質以減少冷凍保存對精子細胞的有害影響。本文對精液冷凍保存技術、精子冷凍損傷、抗氧化劑的應用作一綜述，為精液冷凍保存技術的深入研究提供參考依據。

關鍵詞：家畜精液；冷凍保存；抗氧化劑

隨著經濟的發展，畜牧業正逐漸趨向規模化、集約化及高效化養殖，人工授精技術廣泛用于畜牧養殖，該技術的關鍵步驟是存有優質種公畜精液。在過去的七十年里，使用冷凍保存的精液進行人工授精在畜牧業中發揮了至關重要的作用。近些年來，在一些農場動物中，使用冷凍保存的精子進行人工授精表現出了很多優勢，其相關性變得更加明顯。精液冷凍保存是一種保存種質資源的常用方法，在牲畜優質種質的傳播中起著至關重要的作用。因此，深入研究家畜的精液冷凍保存技術對于精液的保存和精子存活率具有重要的意義，對于養殖業的發展也具有積極的促進作用。

1 精液冷凍保存技術

精液冷凍保存是人工育種、物種保護和人類生殖醫學的重要工具。精液冷凍保存是將按照一定比例混合于冷凍保護劑的精液保存至0 ℃以下的技術，通常是利用液氮或其他冷源將其迅速冷凍至極低溫度（-196 ℃），該過程中精子進入休眠狀態，代謝活動完全停止，從而實現精子細胞的長期保存。在進行人工授精時，通過適當的解凍程序將精液恢復液態化，使精子恢復活力。冷凍保存過程會添加冷凍保護劑以減少冰晶對細胞的損傷。此外，降溫速率對冷凍效果至關重要，快速冷凍可以避免冰晶形成，減少對精子的損傷，而慢速冷凍則需要更精確的溫度控制和保護劑組合，更易對精子細胞造成損傷。雖然精液冷凍保存可以延長精子細胞的儲存時間，但在不同的物種中，需根據實際情況選擇合適的精液冷凍保護劑，并制定規范的冷凍－解凍程序以達到最佳冷凍效果。

2 精子冷凍保存損傷

2.1 氧化應激與精子冷凍損傷

精液冷凍保存會導致精子質膜的各種物理、生化和氧化損傷，導致精子的活力和受精能力下降，這些冷凍損傷主要導致精子的運動能力、質膜功能和頂體完整性的喪失。氧化應激反應是精子冷凍損傷的重要因素之一，氧化應激的發生會導致精子活力和受精能力降低。細胞氧化還原穩態是一個動態過程，可確保細胞內還原反應和氧化反應之間的平衡，在生理條件下，活性氧（ROS）是正常的細胞代謝產物，并作為信號介質調節精子的產生、獲能和受精。然而，在非生理環境中進行精液冷凍保存，精子細胞維持生理氧化還原平衡的能力會受損，產生過量的ROS，損傷精子細胞的運動性、形態、DNA完整性和活力。冷凍保存過程中的氧化應激是由細胞氧化還原穩態失衡引起的，當氧化劑超過抗氧化劑時，細胞內會產生過量的ROS。與新鮮精子相比，在冷卻至5 ℃和冷凍保存期間，人類、反芻動物和犬精子中檢測到的ROS量明顯更高，冷凍－解凍精子中氧化亞氮、過氧化氫和氧自由基的含量也明顯更高。因此，冷凍保存過程應采取相應措施以盡量減少氧化應激對精子造成的有害影響。

2.2 精子冷凍損傷

精子質膜是冷凍保存過程中損傷的主要部位，質膜損傷可分兩種：冷凍保護劑發揮作用時誘導發生的損傷和冷卻過程中發生的損傷。冷凍保存過程中的滲透變化使精子暴露于滲透條件的變化中，從而導致細胞損傷，精子對這些滲透誘導的體積變化特別敏感，會造成精子膜完整性、運動性和頂體完整性的喪失。冷凍保存后精子運動性降低的主要原因是DNA斷裂和線粒體膜電位下降，線粒體通過調節氧化磷酸化和三羧酸循環在ATP產生中起著至關重要的作用，這對精子的運動和受精能力極其重要。研究發現，精液冷凍保存會破壞公豬精子的線粒體完整性[1]。在馬中，12%的凍融精子有頂體損傷，而在豬和綿羊中分別約為30%和50%的凍融精子有頂體損傷。

此外，冷凍保存還會破壞精子的蛋白質組，導致蛋白質降解、磷酸化和羰基化等。例如，研究發現，在冷凍保存過程中，公豬精子中有41種蛋白質發生了變化，這些蛋白質與精子活力、質膜完整性、能量代謝、獲能和精子－卵母細胞融合有關。同樣，與對公豬精子進行的研究結果相似，公羊精子的蛋白質組學分析發現51種蛋白質的豐度發生了顯著變化。與新鮮羚羊精子相比，凍融后的精子有85種蛋白質的濃度發生了變化，這些蛋白質主要與精子代謝途徑有關，包括線粒體能量產生和糖酵解。

3 精子冷凍損傷的預防

3.1 傳統策略

目前主要采用的方法是在進行精液冷凍保存時添加冷凍保護劑、抗氧化劑、膜穩定劑和其他經典培養基等。在過去的幾十年中，各種冷凍保護劑和抗氧化劑的使用一直是對抗冷凍損傷的常規策略。例如，在精液稀釋液中添加茶多酚、綠原酸能夠顯著提升綿羊精子活率、活力、質膜和頂體完整率[2]。添加維生素C可顯著提高牦牛冷凍精液精子活力、頂體完整率，并且降低了精子畸形率[3]。

3.2 新型策略

除了添加冷凍保護劑和抗氧化劑等方法，還包括一些新的方法，例如，冷凍前誘導的輕度亞致死應激、冷凍前誘導磁場、納米粒子增強冷凍保存、通過冷凍干燥保存精子和單層離心等。冷凍前誘導的輕度亞致死應激可以增加精子對冷凍損傷的抵抗力，如靜水壓、滲透壓或氧化應激。高靜水壓力是一種亞致死環境應激，可顯著改善冷凍公牛和公豬精液的運動性、活力和生育參數。精子冷凍干燥是一種簡單的保存技術，是保護國內物種生物多樣性的另一種低成本儲存選擇，干燥后的精子可以在4 ℃下儲存并在室溫下運輸，不需要液氮，與冷凍保存的精子相比，冷凍干燥的馬精子的脂質過氧化較低、線粒體膜電位較高。研究表明，與公豬新鮮精子相比，冷凍干燥保存的精子DNA完整率差異不顯著，而冷凍保存的豬精子與新鮮精子、冷凍干燥保存的精子之間差異顯著[4]。

4 抗氧化劑的應用現狀

抗氧化劑是抵抗自由基引起的氧化應激的主要防御因素，能夠抑制ROS和脂質過氧化，對于保護精子細胞免受氧化損傷至關重要。ROS在精子功能中具有雙重作用，低水平和可控水平的氧衍生物種對精子生理學非常重要，它們是正常生理過程所必需的，如獲能、頂體反應和精子中的信號傳導過程，而高濃度的ROS會導致精子發生病理變化。在正常情況下，為了中和ROS的有害影響，精子和精清中擁有許多抗氧化系統，可以清除ROS并防止內部細胞損傷，然而，在進行精液冷凍保存時，正常采集的精液中含有的內源性抗氧化劑不足以保護精子，因此，通常會在冷凍保護液中添加抗氧化物質來保護精子免受ROS的影響，常用的抗氧化劑包括酶類抗氧化劑、非酶類抗氧化劑以及中藥提取物或單體等。為了達到最佳精液冷凍保存效果，需要研究者進一步探索一種抗氧化劑或多種抗氧化劑組合的臨床應用。

4.1 酶類抗氧化劑

酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，包括過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等，它們能夠清除過氧化物，減少氧化應激對精子細胞的損傷。在公豬精子冷凍保護劑中添加SOD或CAT不僅可以提高精子的活力和存活率，還可以減少解凍后ROS的產生，從而提高解凍精子的體外受精能力。同樣，在保護劑中添加CAT和SOD也提高了公羊精子的存活率和體外受精率?？傊?，在保護劑中添加天然抗氧化劑可以提高冷凍精子的活力和存活率，并且同時添加多種抗氧化劑對冷凍精子的保護效果更好。

4.2 非酶類抗氧化劑

非酶類抗氧化劑也稱為合成抗氧化劑或膳食補充劑，包括谷胱甘肽、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、泛醌、硒和鋅等。在公羊精液保存稀釋液中添加維生素E和維生素C可以提高精子的存活率和質量參數。在冷凍保護介質中補充維生素E（5 mmol/L）可以增強解凍后精子的活力，并有助于維持正常精子癥和弱精子癥精液中精子DNA的完整性，提高輔助生殖技術周期中的受孕率。同樣，在冷凍保護劑中添加維生素C可以改善牛精子活力、頂體和膜的完整性。此外，在綿羊精液稀釋液中添加1～2 mmol/L的谷胱甘肽可以提高GPX和SOD的活性，減少自由基并提高解凍后精子的存活率。

4.3 中藥提取物或單體

植物提取物作為一種廉價的天然抗氧化劑廣泛用于精液冷凍保存過程，通過發揮抗氧化作用清除ROS，減輕氧化應激對精子功能的有害影響。例如，白藜蘆醇、槲皮素、綠原酸、茶多酚、葛根素、姜黃素等植物提取物廣泛用于精液的冷凍保存，不僅能提升低溫條件下的精子活力，還能在一定程度上減少低溫引起的精子各種結構和DNA損傷。

結語

總之，冷凍保存對促進家畜繁殖具有重要意義。家畜精子的冷凍保存是一個復雜的過程，涉及多種試劑的調節、時間以及溫度的控制，為了實現更好的精液冷凍解凍，需要選擇合適的冷凍解凍程序、稀釋劑、冷凍保護劑、精子稀釋速率、冷卻速率和解凍速率。此外，還需要全面了解每個物種復雜的精子生理學，以最大限度地提高精子解凍后的恢復能力，從而提高生育能力。

參考文獻：

[1] 江中良.LDL和多糖在豬精液冷凍保存中的作用研究[D].陜西：西北農林科技大學，2010.

[2] 王宏利，張文倩，劉宗玲，等.茶多酚、綠原酸對綿羊精液保存的影響[J].中國畜牧雜志，2025，61（02）：212-216.

[3] 李景.不同抗氧化劑對牦牛冷凍精液精子活力的影響[J].特種經濟動植物，2024，27（10）：10-12.

[4] 孟祥黔.豬精子冷凍干燥保存技術建立及顯微注射受精的研究[D].四川農業大學，2010.