基于邏輯門的鄰位核酸熒光傳感器同時檢測凝血酶和肌紅蛋白

摘要 基于分裂適配體的靶標識別能力和分子邏輯門的智能分析能力，將兩種分裂適配體整合到“AND”邏輯門中，構建了一種新型鄰位核酸熒光傳感器，用于凝血酶（Tob）和肌紅蛋白（Myo）的同時檢測。當僅存在一種目標物時，信號的響應為單一熒光輸出信號，可作為早期低風險判斷的評價標準；當兩種目標物同時存在時，分裂適配體與目標物結合，形成三元復合物，分別導致首尾的鄰位核酸效應，同時觸發G-四鏈體增強硫磺素T 熒光信號和Cyanine 3 的熒光信號猝滅，可作為早期高風險判斷的評價標準。在優化條件下， 本方法檢測Tob 的線性范圍為3～200 nmol/L， 相關系數為0.9931， 檢出限（LOD）為0.97 nmol/L；檢測Myo 的線性范圍為6～400 nmol/L，相關系數為0.9933， LOD 為2.14 nmol/L。將本方法應用于臨床血清樣本中Tob 和Myo 的同時測定，加標回收率分別為85.4%～118.3%和85.8%～119.9%，相對標準偏差均小于6.5%。與標準方法的測定結果相比，本方法的相對誤差的范圍為–8.8%～5.6%。此外， 4 例血清樣品的邏輯診斷結果為急性心肌梗死高風險2 例，低風險2 例。本研究提出的“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法具有選擇性高、快速、準確和可同時檢測等優點，為急性心肌梗死早期診斷提供了重要參考，也為生物標志物的同時檢測提供了一種通用性檢測設計思路和平臺。

關鍵詞 邏輯門；分裂適配體；同時檢測；凝血酶；肌紅蛋白

心血管疾病是全球范圍內造成殘疾和死亡率最高的疾病之一，而急性心肌梗死發病前無癥狀是心血管疾病死亡率高的原因[1-2]。因此，快速和準確診斷急性心肌梗死對于挽救患者生命、提高患者生命質量至關重要。肌紅蛋白（Myoglobin， Myo）是心肌梗死的生物標志物，是心肌損傷后首先釋放的蛋白質，在急性心肌梗死的早期診斷中發揮了重要作用[3]。凝血酶（Thrombin， Tob）是一種重要的多功能酶，與血管損傷后形成血栓密切相關[4]。血栓形成可能導致血管閉塞和血流量減少，影響下游器官的氧氣和營養供應，嚴重時會導致心肌梗死[5]。因此， Tob 可作為急性心肌梗死早期的輔助診斷標志物。大多數疾病都具有多個生物標志物，對生物標志物進行同時檢測不僅可縮短檢測時間，而且可更準確地診斷疾病。因此，構建一種快速、準確和同時檢測Myo 和Tob 的生物傳感器具有非常重要的意義。

目前，文獻中報道的用于生物標志物定量分析的方法主要是免疫分析法。其中，放射免疫分析法靈敏度高、特異性強，但存在放射性污染[6]；化學發光免疫分析法靈敏度高、檢測時間短，但成本相對較高[7]；熒光免疫分析法以其良好的選擇性、穩定性和靈敏度而備受關注[8]，但是，大部分的熒光免疫分析法只能檢測單一的生物標志物，不能滿足目前的臨床診斷需求，尤其是在心血管疾病早期診斷的準確性方面尚存在不足。因此，綜合多個標志物的定量分析結果可以提供更全面的特征信息，有助于早期發現和精準識別心血管疾病，從而提高篩查的有效性和可靠性。

基于核酸的生物傳感策略通常由識別、信號傳輸和信號轉化等多模塊單元組成。適配體是一種單鏈寡核苷酸序列，對目標物具有高選擇性[9]。分裂適配體通常指從一條完整適配體鏈中間的某處截斷為兩條適配體鏈，當目標物不存在時，兩條鏈單獨存在；當目標物存在時，兩條鏈同時結合在目標物上，可以呈現與完整適配體類似的構象[9-10]。與完整的適配體相比，分裂適配體的長度更短，二級結構更少，在傳感中不易產生非特異性信號[11]。分子邏輯門是通過接收一個（或多個）化學過程作為輸入，并產生一個（或多個）容易檢測的分析信號作為輸出來實施邏輯運算的信號傳輸策略[12]。分子邏輯門能夠同時檢測多個分析物，簡化分析程序，提高檢測的準確性，滿足臨床“快速篩查”的需求，在智能生物傳感領域具有重要的應用前景[13-14]。迄今為止，已有電化學[15-16]、比色[17-18]、熒光[19]和其它類型的分子邏輯門用于同時檢測多個目標分析物的報道。但是，這些方法通常需要繁瑣的洗滌步驟或復雜的擴增反應。鄰位效應（Proximity effect）是指目標物與兩個親和配體的結合使互補的寡核苷酸聚集，從而顯著增加其局部濃度[20-21]。鄰位效應已被應用于開發多種生物傳感器，具有快速、選擇性強和免洗滌等優點[21]。

本研究將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時整合到“AND”邏輯門中，構建了一種新型鄰位核酸熒光傳感檢測技術。由于Tob 和Myo 分別具有兩個分裂適配體，將其中一條分裂適配體單元通過poly-A 序列相連，從而將兩種識別模塊整合到同一個核酸電路結構中。當僅存在一種目標物時，信號的響應為單一熒光輸出信號；兩個目標物同時存在時，分裂適配體與目標物結合，形成三元復合物，分別導致首尾的鄰位核酸效應，同時觸發G-四鏈體（G4）增強硫磺素T（Thioflavin T， ThT）熒光信號和Cyanine 3（Cy3）的熒光信號猝滅。“AND”邏輯運算能夠同時檢測Tob 和Myo，可為急性心肌梗死早期診斷提供重要參考，也為生物標志物的同時檢測提供了一種通用性檢測平臺和設計思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FA1604 電子天平（上海天平儀器廠）；ZWYR-240 恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；RF-5301PC 熒光分光光度計（日本島津醫療器械有限公司）；HE-120 Tanon 電泳儀（上海天能生命科學有限公司）；DigiGenius 凝膠成像系統（英國Syngene 公司）。

ThT 和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Tob 和Myo（人源，美國Sigma-Aldrich 公司）；人凝血酶和肌紅蛋白酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（96 孔，武漢華美生物工程有限公司）；NaCl、CaCl2 和MgCl2（分析純，廣州化學試劑廠）；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。HEPES 緩沖溶液（pH 7.0）含20 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2 和120 mmol/L NaCl。寡核苷酸（HPLC 純化，上海生工生物科技有限公司）序列（５′→３′）如下：

P1：BHQ2-ACACCCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTTTTTTTTTTGGGTTGGG/isp9/GGTTGGTG

P2：TGGTTGG/isp9/GGGTAGGG

P3：TGCTGCGTTGTTCCGAGTGT-Cy3

1.2 實驗方法

1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳

分別按邏輯輸入（0， 0）、（1， 0）、（0， 1）和（1， 1）的試劑順序添加寡核苷酸和待測物溶液，孵育60 min。分別將10 μL 上述溶液與2 μL 6×DNA 上樣緩沖溶液（pH 7.6，含溴酚藍、乙二胺四乙酸和甘油）混合，室溫孵育10 min，注入2%瓊脂糖凝膠（含Super red 染料），在1×Tris-Acetate-EDTA（TAE， pH 8.0）緩沖溶液中于100 V 恒壓下電泳70 min，采用DigiGenius 凝膠成像系統掃描電泳后的凝膠。

1.2.2 定量檢測

鄰位核酸探針P1、P2 和P3 分別用HEPES 緩沖溶液稀釋成1.5、1.0 和1.0 μmol/L 的工作液。將P1溶液于95 ℃水浴孵育5 min，自然冷卻至室溫。將20 μL P1、20 μL P2、20 μL P3 和10 μL Tob 標準溶液和/或10 μL Myo 標準溶液、20 μL 40 μmol/L 的ThT 溶液依次加入到0.6 mL 離心管中，加入HEPES 緩沖溶液至溶液總體積為200 μL；渦旋混勻，在37 ℃恒溫搖床中避光孵育60 min。采用熒光分光光度計測定溶液的熒光發射光譜，設置激發波長為460 nm，狹縫為10 nm。測量此溶液體系分別在483 和563 nm處的熒光強度（FTob 和FMyo），以相同體積的超純水代替Tob 和Myo 作為空白對照，并測定熒光強度（F0）。

1.2.3 實際樣品分析

血液樣本由廣東藥科大學附屬醫院提供，相關研究經廣東藥科大學公共衛生學院倫理委員會批準，志愿者知情同意。靜脈取血于無抗凝劑的采血管中，室溫靜置4 h，待血液完全凝結后， 1600 g （3700 r/min）離心10 min，將上層血清小心轉移至新離心管中， 8000 g （8400 r/min）離心20 min，再將上清液轉移至新離心管中，于–20 ℃保存。測定時，將血清樣品用PBS 緩沖溶液稀釋至合適濃度，按照1.2.2 節中的方法進行定量檢測。

作為對比，血清樣品分別用Tob 和Myo 的商業ELISA 試劑盒進行測定，具體操作步驟嚴格按照試劑盒的使用說明書進行。

2 結果與討論

2.1 “AND”邏輯門的檢測原理

與完整適配體相比，分裂適配體的結合能力幾乎不受影響[22]，其序列較短，適用于設計同時檢測多種生物標志物的新型邏輯門策略。Tob 分裂適配體的解離常數（Kd）約為100 nmol/L[23]， Myo 分裂適配體的Kd≈5 nmol/L[24]，表明兩種分裂適配體與目標物有較強的親和力。由圖1A 可見， P1 探針由Tob 分裂適配體（紅色）、分裂G4 序列（紫色）以及猝滅劑（BHQ2）標記Myo 分裂適配體（藍色）構成。P2 探針由Tob 分裂適配體序列（紅色）和分裂G4 序列（紫色）組成。P3 探針由Cy3 熒光探針（發射波長：563 nm）標記Myo 分裂適配體序列（藍色）組成。ThT 可與完整的G4 結構特異性結合而產生熒光，其最大發射波長為483 nm， ThT 和Cy3 兩種熒光報告分子的最大發射波長間隔為80 nm，發射峰區分明顯，可用于兩種目標物同時檢測。

“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感器的檢測原理、邏輯電路和真值表分別如圖1A、圖1B 和圖1C所示。如圖1B 所示，此“AND”邏輯門以Tob 和Myo 濃度為輸入，熒光信號變化為輸出，以真值“0”（低風險）和“1”（高風險）表示邏輯判斷。當Tob 和Myo 都不存在時，即輸入為（0， 0）時， P1 探針的Tob 分裂適配體和P2 探針的Tob 分裂適配體不結合， P1 和P2 探針無法有效結合形成G4 結構，此時ThT 的熒光值較低。同時， P1 探針與P3 探針同樣距離較遠， Cy3 由于無法發生熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET），熒光值較高，此時輸出為0（低風險）。當僅存在Tob 時，輸入為（1， 0）， P1 探針和P2 探針的Tob 分裂適配體與Tob 緊密結合，形成三元復合物，導致末端分裂的G4 序列鄰位效應，形成G4 結構，后者與ThT 結合，在483 nm 處熒光值增加，此時輸出也為0（低風險）。當僅存在Myo 時，輸入為（0， 1）， P1 探針和P3 探針的Myo 分裂適配體序列與Myo 形成三元復合物， Cy3和BHQ2 發生FRET 使得Cy3 在563 nm 處的熒光值降低，此時輸出也為0（低風險）。當Tob 和Myo 同時存在時，輸入為（1， 1）， P1 和P2 探針中的Tob 分裂適配體與Tob 結合形成G4 結構， ThT 在483 nm 處的熒光信號增強；同時， P1 和P3 探針中的Myo 分裂適配體與Myo 結合，導致Cy3 熒光信號被猝滅，在563 nm 處的熒光信號降低，此時輸出為1（高風險），提示急性心肌梗死的風險較高。

2.2 “AND”邏輯門的可行性研究

研究了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感同時檢測Tob 和Myo 的可行性。熒光發射光譜圖如圖2A所示，圖2B 是483 和563 nm 處對應的熒光峰值。當Tob 和Myo 均不存在時，輸入為（0， 0）， 483 nm 處的熒光峰值較低， 563 nm 處熒光峰值較高；僅存在Tob 時，輸入為（1， 0）， 483 nm 處的熒光峰值增加，563 nm 處熒光峰值不變；僅存在Myo 時，輸入為（0， 1）， 483 nm 處熒光峰值不變， 563 nm 處熒光峰值降低；只有當Tob 和Myo 同時存在時，輸入為（1， 1）， 483 nm 處熒光峰值增加， 563 nm 處熒光峰值降低，說明采用此“AND”邏輯門同時檢測Tob 和Myo 可行。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證了此“AND”邏輯門策略同時檢測的可行性。如圖2C 所示，對于泳道a，當Tob 和Myo 均不存在時，出現3 個游離的DNA 條帶；對于泳道b，僅存在Tob 時，出現了P1 和P2 與Tob 的結合條帶（藍框）；對于泳道c，僅存在Myo 時，出現了P1 和P3 與Myo 的結合條帶（黃框）；對于泳道d，當Tob 和Myo 同時存在時，出現了P1、P2、P3、Tob 和Myo 的結合條帶（綠框）。上述結果進一步說明采用此邏輯門策略同時檢測Tob和Myo 可行。

2.3 檢測條件的優化

為了獲得最佳的分析性能，優化了用于Tob 和Myo 檢測的適配體濃度和孵育時間等條件。首先，考察了不同濃度的P1（0.1、0.5、1.0、1.5 和2.0 μmol/L）對Tob 熒光強度差值（FTob–F0）的影響。如圖3A 所示，隨著P1 濃度增大，分裂適配體與Tob 的結合增加，形成的G4 增多， G4 與ThT 結合，熒光信號增強；P1 濃度達到1.5 μmol/L 時， FTob–F0 最大；隨著P1 濃度繼續增加， FTob–F0 略降，這可能是空白值增加所致。考察了孵育時間（10、20、40、60 和90 min）對FTob–F0 的影響。如圖3B 所示，隨著孵育時間延長，分裂適配體與Tob 的結合增加， FTob–F0 增大，孵育時間為60 min 時， FTob–F0 達到最大，此后基本保持穩定。

考察了P1 與P3 的濃度比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1 和3∶1）對Myo 熒光強度差值（F0–FMyo）的影響。如圖3C 所示，隨著P1 與P3 的濃度比增大，分裂適配體與Myo 的結合增多，導致Cy3 和BHQ2 發生的FRET 效應增強，熒光信號降低， F0–FMyo 增大；當P1 與P3 的濃度比增至1.5∶1， F0–FMyo 變化不大，達到穩定狀態。因此，選擇1.5∶1 作為最佳適配體濃度比?？疾炝薖1 和P3 與Myo 反應的孵育時間（10、20、40、60 和90 min）對F0–FMyo 的影響。如圖3D 所示，隨著孵育時間延長， F0–FMyo 增大，在60 min 時達到穩定，說明反應已基本完全。最終確定P1、P2 和P3 探針的最優濃度分別為1.5、1.0 和1.0 μmol/L，最優孵育時間為60 min。

2.4 方法的分析性能

2.4.1 分析參數

在最優的反應條件下，考察了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法的分析性能。如圖4A 所示，隨著Tob 濃度增大， 483 nm 處的熒光信號逐漸增強。483 nm 處熒光強度與Tob 濃度的關系如圖4B 所示，在3～200 nmol/L 濃度范圍內， Tob 濃度與熒光強度的差值呈線性關系，線性方程為FTob–F0=2.65CTob+3.66，相關系數（r）為0.9931，計算得到檢出限（LOD， S/N=3）為0.97 nmol/L。健康人血液中幾乎不含Tob，在凝血過程中， Tob 的濃度能夠達到nmol/L 水平[25]，因此，此策略能滿足對Tob 臨床診斷的要求。如圖4A 所示，隨著Myo 濃度增大， 563 nm 處的熒光信號逐漸降低。熒光強度差值與不同濃度Myo 的關系如圖4C所示，在6～400 nmol/L 濃度范圍內， Myo 濃度與熒光差值呈線性關系，線性方程為F0–FMyo=0.53CMyo+11.49（r=0.9933）， LOD 為2.14 nmol/L，明顯低于正常人閾值（36 nmol/L）[26]，滿足對Myo 臨床檢測的要求。

2.4.2 選擇性和穩定性

選擇性是評估分析性能的另一個關鍵因素。為了評價此傳感器同時檢測Tob 和Myo 的選擇性，分別加入100 μmol/L K+、1 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Ca2+、10 μmol/L Fe3+、1 μmol/L血紅蛋白（Hb）、1 mmol/L葡萄糖氧化酶（GO）、1 μmol/L C-反應蛋白（CRP）、1 μmol/L溶菌酶（LZM）、1 mmol/L 人血清白蛋白（HSA）、1 mmol/L 免疫球蛋白G（IgG）、50 nmol/L Tob 和100 nmol/L Myo 及其混合物，測定被測物加入前后傳感器的熒光峰值變化。如圖5A 所示，共存物質K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Hb、GO、CRP、LZM、HSA 和IgG存在時的熒光強度差值均很低。此外，其混合物的熒光強度差值與Tob 和Myo 的結果無顯著差異，說明此傳感方法對Tob 和Myo 具有良好的選擇性。

為了進一步評估傳感器的穩定性，對3 個不同濃度水平（10、50 和100 nmol/L）的Tob 和Myo 進行了5 次重復測定，結果如圖5B 所示，此傳感器檢測Tob 和Myo 的RSDs 分別為4.3%～8.4%和3.2%～7.2%，說明此傳感方法檢測Tob 和Myo 具有較好的穩定性。

2.5 實際樣品分析

為了評價建立的方法在實際樣品中的分析性能，采用此方法同時檢測臨床血清中的Tob 和Myo。如表1 所示， 1 號樣品和2 號樣品中Tob 濃度為9.68 和10.93 nmol/L，3 號樣品和4 號樣品未檢出。1 號樣品和2 號樣品中Myo 濃度為50.47 和36.92 nmol/L，超過正常值（36 nmol/L）， 3 號樣品和4 號樣品未檢出。血清樣品1 和2 中Tob 和Myo 濃度均超過正常閾值，邏輯判斷為1，邏輯診斷結果為急性心肌梗死高風險。樣品3 和4 中Tob 和Myo 濃度均未檢出，邏輯判斷為0，邏輯診斷結果為急性心肌梗死低風險。此外，對實際樣品進行單一目標物的加標回收實驗，測得Tob 和Myo 的加標回收率分別為85.4%～118.3%和85.8%～119.9%， RSD 分別小于5.9%和6.5%。與標準方法ELISA 檢測Tob 和Myo 的結果進行比較，相對誤差范圍為–8.8%～5.6%， RSD 小于7.9%，說明本方法的檢測結果與標準方法ELISA 一致。然而， ELISA方法檢測單個目標物的時間需要180 min，本方法在60 min 內即可完成兩個目標物的同時檢測，顯著縮短了分析時間。

3 結論

將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時整合到“AND”邏輯門中，構建了一種新型鄰位核酸熒光傳感方法，用于Tob 和Myo 的同時檢測。在優化條件下，本方法檢測Tob 的線性范圍為3～200 nmol/L， LOD 為0.97 nmol/L；檢測Myo 的線性范圍為6～400 nmol/L， LOD 為2.14 nmol/L。將此傳感器應用于臨床血清樣本分析， Tob 和Myo 的回收率分別在85.4%～118.3%和85.8%～119.9%之間， RSD 均小于6.5%。與標準方法ELISA 的測定結果相比，相對誤差范圍為–8.8%～5.6%。4 例血清樣品的邏輯診斷結果為急性心肌梗死高風險2 例，低風險2 例。此外，此方法能夠在60 min 內對兩種生物標志物進行檢測，縮短了分析時間。此適體傳感器具有選擇性高、穩定性好、快速、準確和可同時檢測的優點，在急性心肌梗死疾病標志物的快速檢測和多重篩查方面具有極大的應用潛力。

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國家自然科學基金重點項目（No. 22134007）和廣東省自然科學基金項目（No. 2024A1515011077）資助。