配位策略制備的類漆酶納米酶及其分析應用

摘要 漆酶是一種多酚氧化酶，可以催化酚類、芳香胺類和兒茶酚胺類等化合物的氧化，在污染物降解和分析檢測領域有廣泛的應用。但是，天然漆酶制備成本高，其活性受環境因素的影響較大，易變性失活，影響了其實際應用效果。納米酶是一類具有類天然酶活性的納米材料，具有易于制備、活性可調和穩定性高等優點。目前，研究者已經開發出多種納米酶。天然漆酶活性位點的Cu2+與氨基酸配位，受此啟發，研究者將配位合成策略即基于金屬離子和配體相互作用的策略用于類漆酶納米酶的制備。在已報道的采用配位策略制備的類漆酶納米酶中，金屬節點通常為銅、錳和鈰等，配體涉及多類化合物（包括核苷酸、氨基酸、多肽和芳香酸等），可通過調控金屬與配體的比例、配體的還原能力、緩沖溶液、氯離子和溴離子等因素實現對類漆酶納米酶催化活性的調節。本文分類綜述了采用配位策略合成的類漆酶納米酶及其在檢測酚類化合物、疾病標志物、抗生素、農藥、含硫污染物以及時間-溫度指示等領域的應用，討論了當前類漆酶納米酶研究中存在的問題，并展望了其未來的發展趨勢。

關鍵詞 漆酶；類漆酶納米酶；配位策略；分析應用；評述

漆酶（Laccase， EC 1.10.3.2）是一種多酚氧化酶，其活性中心包含4 個Cu2+，這4 個Cu2+分為3 種類型：1 個Ⅰ型、1 個Ⅱ型和2 個Ⅲ型。Ⅰ型Cu2+呈順磁性，與組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）配位，負責底物的氧化和電子的捕獲。Ⅱ型Cu2+呈順磁性，Ⅲ型Cu2+呈反磁性，這兩種類型的Cu2+形成的三核銅簇共與8 個組氨酸配位，在該三核銅簇位點，分子氧被還原為水分子[1]。漆酶可以氧化幾乎所有的多酚類底物，在酚類物質的檢測中廣泛應用[2]。但是，天然漆酶存在一些天然酶固有的缺點，例如制備和純化成本高、穩定性差和再循環率低等，阻礙了其廣泛應用。

納米酶是一類具有類酶催化性質的納米材料，因其具有可規模化制備、形貌和組分可調以及穩定性高等優點，受到了研究者的青睞，近年來發展迅速[3-6]。目前已開發了多種納米酶，包括具有類過氧化物酶、類超氧化物歧化酶、類漆酶納米酶和類水解酶活性的納米酶等。按照組成分類，類漆酶納米酶主要包括金屬氧化物[7]、金屬硫化物[8]、鈣鈦礦氫氧化物[9]以及金屬離子與小分子配體配位形成的納米材料等。小分子配體種類繁多，為制備類漆酶納米酶提供了多樣化的選擇，因此基于金屬離子（銅、鈰、鐵和錳等）與小分子配體配位的類漆酶納米酶近幾年發展尤其迅速。目前，已經發表了許多關于納米酶的綜述，但聚焦于類漆酶納米酶的綜述卻很少[1，10]。

本文分類介紹了近年來基于配位策略合成的類漆酶納米酶，綜述了其在檢測酚類化合物、疾病標志物、抗生素、農藥和含硫污染物等領域中的應用，并討論了當前類漆酶納米酶研究中存在的問題和未來的發展方向，以期為合成新型類漆酶納米酶及拓展類漆酶納米酶的分析應用提供參考。

1 類漆酶納米酶的催化性能

類漆酶納米酶具有與天然漆酶類似的活性，可以催化多種化合物的氧化。腎上腺素（Epinephrine，Epi）與2，4-二氯苯酚（2，4-Dichlorophenol， 2，4-DP）常被用作底物用于研究類漆酶納米酶的活性（圖1）[11]。類漆酶納米酶催化2，4-DP 氧化產生的自由基與4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine， 4-AP）發生顯色反應生成紅色染料，該染料在510 nm 處具有較強的吸收；類漆酶納米酶催化Epi 氧化生成紅色產物，該產物在485 nm 處具有較強的吸收。米氏動力學模型是天然酶學研究中最常用的動力學模型，廣泛用于研究納米酶的催化活性。通過測定類漆酶納米酶催化底物2，4-DP 或Epi 的反應動力學，可獲得類漆酶納米酶的米氏常數（Km）和最大反應速度（vmax），這兩個參數數值的大小可用于評價類漆酶納米酶的催化性能。

2 采用配位策略制備的類漆酶納米酶

用于制備類漆酶納米酶的配位策略主要有：（1）通過金屬離子與小分子配體直接配位合成類漆酶納米酶；（2）構建具有M-N（M 指金屬原子， N 指氮原子）活性中心的單原子類漆酶納米酶。根據所用配位策略的不同，以下對基于金屬配位的類漆酶納米酶分別進行介紹。

2.1 金屬離子與小分子配體直接配位的類漆酶納米酶

基于金屬離子與小分子配體直接配位制備的類漆酶納米酶中，銅基的類漆酶納米酶最多，錳基和鈰基類漆酶納米酶也有報道，配體涉及多種小分子。首先，鳥嘌呤核苷酸（GMP）[11-12]、三磷酸腺苷（ATP）[13]和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）[14-15]等均被報道用于制備類漆酶納米酶。例如， Liang 等[11]首次在HEPES 溶液（一種非離子兩性緩沖劑）中，以GMP 為配體、Cu2+為金屬離子，通過簡單的溶液混合并離心，制備了由Cu2+和GMP 配位形成的納米無定形金屬有機骨架材料，該納米材料對2，4-DP 和Epi 兩種底物均展現出優異的類漆酶活性。實驗證明該類漆酶納米酶中的銅以Cu+和Cu2+兩種形式存在，且該納米酶的類漆酶活性源于Cu2+與N 的配位而非與磷酸基團的配位。Tang 等[12]利用Mn2+與鳥苷酸進行配位，通過一鍋法合成了具有類漆酶活性的納米片Mn-GMPNS，該類漆酶納米酶在熱穩定性和耐酸堿性等方面均優于天然漆酶。

其次，半胱氨酸（Cys）[16]、半胱氨酸-組氨酸（Cys-His）[17-19]、谷胱甘肽（GSH）[20]和苯丙氨酸（Phe）[21-22]也被用于制備類漆酶納米酶。例如， Yan 等[18]以Cys-His 為配體、Cu2+為金屬離子，采用溶劑熱法制備了類漆酶納米酶Cys-His-Cu，而改變配體為單個氨基酸（Cys或His）、二肽（Cys-Cys或His-His）以及三肽（His-His-Cys、Cys-His-Cys、Cys-Cys-His 和His-Cys-His）所合成的納米材料的類漆酶活性均低于Cys-His-Cu。Hu 等[23]選擇Phe 和His 兩種氨基酸，采用溶劑熱法制備了雙配體類漆酶納米酶Cu-Phe/His，其類漆酶活性高于使用單一配體Phe 制備的類漆酶納米酶Cu-Phe。Li 等[24]以His 為配體、Cu2+為金屬離子，并以葡萄糖為還原劑，制備了直徑超小的類漆酶納米酶Cu2O@His，采用同樣的方法以甘氨酸、酪氨酸、精氨酸和賴氨酸為配體的類漆酶對照組的類漆酶活性均低于Cu2O@His。

此外，其它許多小分子包括芳香羧酸[25-28]（圖2A～2D）、雜環小分子包括咪唑[29]、2-甲基咪唑（圖2E）[30]、4-4′-聯吡啶（圖2F）[31]、三聚氰胺[32]、2-氨基-1，3，4-噻二唑[33]（圖2G）、4-吡唑醇羧酸[34]（圖2H）、煙酸（圖2I）[35]和三聚氰酸[36]中因具有羧基、氨基和巰基等基團，也被用于制備類漆酶納米酶。不同配體制備的類漆酶納米酶表現出不同的特點。例如，以2-氨基對苯二甲酸[27]為配體制備的銅基類漆酶納米酶不僅具有類漆酶活性，同時兼具配體的發光性質；以2-氨基-1，3，4-噻二唑[33]為配體制備的銅基類漆酶納米酶中Cu+的含量高達84.5%，是已經報道的銅基類漆酶納米酶中Cu+含量最高的；Li 等[37]以組氨酸和氨基對苯二甲酸兩種小分子為配體，制備的雙配體銅基納米材料不僅具有良好的類漆酶活性，也具有良好的熒光性質。Liang等[38]合成了以對苯二甲酸和均苯三甲酸為配體的鈰基類漆酶納米酶，并推測該納米酶的活性來源于金屬有機骨架中六核Ce團簇中Ce3+/Ce4+的內在氧化還原反應性。

表1 歸納了上述以不同小分子為配體制備的類漆酶納米酶的形貌特征及其酶動力學參數。除以苯丙氨酸為配體的類漆酶納米酶[21-22]外，其它類漆酶納米酶的米氏常數（Km）和最大反應速度（vmax）與天然漆酶相比均處于同一數量級，表明這些類漆酶納米酶均具有與天然漆酶相當的催化活性。Makam 等[21]指出雖然以Km 值和vmax 值作為比較參數時，天然漆酶的催化活性優于合成的具有超薄二維層狀的類漆酶納米酶Cu-Phe，但若以催化效率（kcat/Km）為評價參數， Cu-Phe 的催化效率（kcat/Km=62.65 mmol/（L·s））比天然漆酶的催化效率（kcat/Km=0.03 mmol/（L·s））高4 個數量級。此外，不同文獻中天然漆酶的Km 和vmax 值存在明顯差異，這可能與漆酶的來源、供應商以及實驗操作等因素不同有關。

2.2 單原子類漆酶納米酶

單原子納米酶憑借其超高的原子利用率和優異的催化性質成為納米酶研究的的前沿領域。已報道的單原子類漆酶納米酶中錨定金屬原子的基質通常為氮摻雜碳材料（N/C），金屬與氮配位的位點（M-N）通常是其類酶催化活性中心。熱解金屬與配體配位形成的前驅體是制備N/C 錨定單原子納米酶的主要方法之一[39-42]。例如， Li 等[39]通過熱解Cu2+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅體制備了單原子類漆酶納米酶CuZn-N/C; Lin 等[40]通過熱解Fe2+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅體制備了單原子類漆酶納米酶Fe1@CN-20；Zhu 等[41]通過熱解Co2+與聚乙烯吡咯烷酮（PVP）配位形成的前驅體制備了單原子納米酶Co/CoOx-N/C；Guan 等[42]通過熱解Rh3+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅體制備了單原子納米酶Rh-N/C，該納米酶具有多種類酶活性，其中類漆酶和類氧化酶的活性最佳。

3 影響類漆酶納米酶活性的因素

除溫度和pH 值外，配位策略制備的類漆酶納米酶的催化活性會受到金屬與配體比例、緩沖溶液的種類、氯離子和溴離子濃度以及其它金屬摻雜等多種因素的影響。Cu2+與Cys 比例為5∶1 時，類漆酶納米酶Cu-Cys 的類漆酶催化活性最強[16]；Cu2+與GSH 的比例為2∶1 時，類漆酶納米酶Cu-GSH 表現出最佳類漆酶活性[20]；Cu2+與三聚氰酸（CA）的原料比為1∶2 時，類漆酶納米酶Cu-CA 類漆酶催化活性最強[36]。類漆酶納米酶Cu-Cys 在MES 緩沖溶液中其類漆酶活性最高[16]；Cu-腺嘌呤類漆酶納米酶在Tris-HAc緩沖液中表現出優異的類漆酶活性，而在MES 緩沖液中活性顯著降低，在HEPES 緩沖液中則進一步降低[43]。研究發現，在類漆酶納米酶催化的顯色體系中添加合適濃度的Cl– 時，類漆酶納米酶的催化活性會顯著增加[15，17，29]， Yan 等[18]研究指出Br– 對類漆酶納米酶的催化性能的提高要強于Cl–。Huang 等[44]發現硫化物的引入能使Cu-GMP 的類漆酶催化活性顯著提高約3.5 倍，這種類漆酶活性增強的機制涉及Cu2+的還原反應和Cu—S 鍵的形成。Xu 等[13]研究發現，在Cu 與ATP 配位合成的納米酶中摻雜Fe3+會使其具有類過氧化氫酶活性，但是類漆酶活性降低，在此基礎上繼續引入Mn2+可以在保持類過氧化氫酶活性的同時，顯著增強類漆酶活性。

4 類漆酶納米酶的分析應用

基于類漆酶納米酶的分析檢測方法已被用于多種目標物包括酚類化合物（包括酚類污染物和茶多酚）、疾病標志物、含硫污染物、抗生素和農藥等的檢測及時間-溫度指示應用，從原理上大致可以分為以下兩類：第一類是待測目標物具有酚羥基官能團，能直接在類漆酶納米酶的催化下發生顯色反應，其顏色深淺與分析物濃度有關，這一原理被用于酚類化合物以及兒茶酚胺的檢測；第二類是待測目標物對類漆酶納米酶催化活性具有抑制或增強作用，即該類目標物影響類漆酶納米酶催化的顯色反應，根據顏色的變淺或加深程度，對待測目標物進行定量檢測，這一原理被用于含硫污染物、抗生素以及農藥等的檢測。此外，類漆酶納米酶還經常用于構建陣列傳感器[27-28，43，45-47]，結合數學判別模型，以實現對多種類似待測目標物的區分。根據待測目標物的不同，本節對類漆酶納米酶在分析檢測中的應用進行分類介紹。

4.1 酚類化合物的檢測

類漆酶納米酶可以催化一些酚類化合物與4-AP 發生顯色反應，基于該原理， Lin 等[40]利用合成的類漆酶納米酶Fe1@CN-20 建立了檢測不同酚類污染物包括苯酚、4-氯苯酚、2，4-DP、2，6-二甲氧基苯酚和鄰苯二酚等的方法，且這幾種酚類化合物的檢出限均低于3.5 μmol/L。為了進一步鑒別不同種類的酚類污染物，研究者開發了基于類漆酶納米酶的傳感陣列。Tian 等[43]利用Cu2+與腺嘌呤配位的類漆酶納米酶在3 種不同緩沖溶液中對酚類化合物與4-AP 反應催化活性的不同，構建了3 通道比色陣列，并將其用于鑒別6 種具有代表性的酚（包括2，4-DP、鄰氯酚（o-CP）、間氯酚（m-CP）、對氯酚（p-CP）、苯酚和鄰苯二酚）。用數據降維方法線性判別分析處理該陣列獲得的信號，結果顯示，該陣列可在10～1000 μmol/L的較寬濃度范圍內有效區分6 種酚類化合物。

Yang 等[48]利用類漆酶納米酶Cu-GMP 催化不同茶多酚與4-AP 反應的吸收光譜的變化，結合遺傳算法篩選了特征光譜，構建了一個包含15 通道（5 個波長×3 個時間點）的傳感器陣列。使用支持向量機判別模型處理所得數據，該傳感陣列對綠茶中不同濃度茶多酚的判別率達到100%，檢出限為5 μmol/L。此外，該陣列對8 種綠茶的分類準確率為96.88%，對不同摻假比例碧螺春的識別準確率為100%，為綠茶品牌和摻假的快速鑒別提供了一種高效、可靠的技術手段。

4.2 疾病相關標志物的檢測

Epi、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）是人體中3 種重要的兒茶酚胺類物質，它們在健康人體內的含量水平是相對恒定的，在某些病理條件下，體內這幾種兒茶酚胺的含量水平會發生變化，因此準確檢測兒茶酚胺類物質的含量有助于健康監測和臨床診斷。嗜鉻細胞瘤（PCC）是一種起源于腎上腺髓質的腫瘤，其顯著特點是Epi 和NE 含量升高，而中樞神經系統的多種退行性疾病與DA 含量密切相關。類漆酶納米酶能夠催化Epi 和DA 氧化并生成有色產物，基于此，許多類漆酶納米酶被應用于Epi 的比色檢測[11-12，17，21，24-25，40-42，49-50]及DA 的檢測[22]。如圖3A 所示， Tang 等[12]基于類漆酶納米酶Mn-GMPNS 對Epi的氧化顯色，結合智能手機拍照并提取顏色通道中的R 值和G 值，構建了檢測Epi 的方法，檢出限為0.87 μg/mL。Kulandaivel 等[34]報道了一種可以對同時含有Epi 和NE 樣品中的Epi 和NE 進行連續檢測的方法（圖3B）。該方法的具體原理為：類漆酶納米酶Cu-Cp 催化Epi 氧化生成在485 nm 處具有較強吸收的紅色產物， 485 nm 處的吸光度值與體系中的Epi 含量相關，由此實現了對樣品中Epi 的檢測，檢出限為0.36 μmol/L；然后調節體系pH 為堿性，堿性條件下NE 與加入的PEI 可生成熒光聚合物，基于此，實現了對NE 的熒光傳感，檢出限為0.068 μmol/L。

神經遞質水平的失調會導致一系列疾病的發生，而乙酰膽堿酯酶（AChE）對維持神經遞質乙酰膽堿的水平至關重要。AChE 可催化巰基乙酰膽堿水解產生巰基膽堿，巰基膽堿可以抑制類漆酶納米酶的催化活性，基于此， Guan 等[42]建立了基于類漆酶納米酶Rh-N/C 的AChE 活性的檢測方法（圖3C），該方法的線性檢測范圍為0.001～1.0 mU/mL，檢出限為3.2×10–4 mU/mL。

程序性死亡配體1（PD-L1）是腫瘤早期診斷和預后的標志物。Hu 等[23]在類漆酶納米酶（Cu-F/Hs）表面修飾PD-L1 抗體（PD-L1 Ab），在電極表面修飾PD-L1 的核酸適配體（PD-L1 Apt），當待測體系中存在PD-L1 時， PD-L1 與PD-L1 Apt 和抗體修飾的類漆酶納米酶結合，形成三明治結構，電極附近的類漆酶納米酶濃度增大，其催化產生的電活性物質聚多巴胺（PDA）濃度也增大，據此可實現對PD-L1 的靈敏檢測（圖3D）。該方法的線性檢測范圍為0.5～200 ng/mL，檢出限為0.11 ng/mL。

4.3 含硫污染物的檢測

含硫污染物包括SO2、無機硫化物以及一些有機小分子（例如二硫化四甲基秋蘭姆和巰基苯并噻唑等），在食品及環境中廣泛存在，檢測含硫污染物對于加強環境監測和保證食品安全具有重要的意義。Huang 等[44]發現當S2– 存在時，可顯著增強Cu-GMP 的類漆酶活性，使Cu-GMP 催化的2，4-DP 和4-AP 的反應體系在510 nm 處的吸光度顯著上升，基于此發展了一種檢測硫化物的比色方法（圖4A），檢測體系在510 nm 處的吸光度與S2– 濃度在0～220 μmol/L 范圍內呈良好的線性關系，可定量檢測食品中的硫化物濃度，檢出限為0.67 μmol/L。Liang 等[38]利用巰基苯并噻唑對類漆酶納米酶Ce-UiO-66 和Ce-MOF-80 催化3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色反應的抑制（圖4B），成功實現了對巰基苯并噻唑的檢測，檢出限分別為5.34 和4.26 μmol/L。

4.4 抗生素的檢測

抗生素是一類能夠抑制或殺死細菌的化合物，被廣泛用于臨床治療細菌感染類疾病以及用于畜禽類和水產養殖業，但其濫用和不合理使用會導致細菌的耐藥性以及抗生素的過度排放，危害人體健康和生態環境。卡那霉素（Kan）是一種含羥基和氨基的糖苷類抗生素， Li 等[37]研究發現， Kan 可增強制備的熒光類漆酶納米酶（Cu-BH）的催化活性，基于此建立了一種檢測Kan 的比色/熒光雙模檢測方法，兩種模式對應的檢出限分別為0.26 和0.033 nmol/L。該方法的原理如圖5A 所示，制備的銅基雙配體類漆酶納米酶Cu-BH 是一種熒光納米酶，最大發射波長在440 nm 處；Cu-BH 可以催化鄰苯二胺（OPD）氧化生成黃色產物二氨基酚（DAP），該產物在566 nm 處有最大發射，且在440 nm 處有較強吸收，會淬滅Cu-BH 在440 nm 處的藍色熒光；當體系中存在Kan時， Cu-BH的類漆酶催化活性增強，即催化生成的DAP增多，體系黃色加深， 566 nm處的熒光（F566）增強而440 nm處的熒光（F440）減弱，比率熒光信號（F566/F440）進一步增大。四環素類抗生素（TCs）是一類含酚羥基的抗生素。Li 等[24]發現將TCs 加入類漆酶納米酶Cu2O@His催化的2，4-DP 與4-AP 的顯色反應體系后，由于TCs 和2，4-DP 均可被Cu2O@His 催化氧化即TCs 與2，4-DP 存在競爭關系，會使反應體系在510 nm 處的吸光度下降，且在不同pH 下的下降程度也不同，基于此，Li 等[24]構建了用于識別TCs 的陣列，并結合數據處理方法主成分分析（PCA），實現了4 種TCs（即四環素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）以及多西環素（DOX））在1～60 μmol/L濃度范圍內的區分（圖5B）。

4.5 農藥的檢測

農藥在農業生產中常被用于病蟲害的防治，但過量或者不合理使用會導致農藥在環境和農作物中殘留，危害食品安全及環境安全[18，27，46，51，52]。目前，類漆酶納米酶已被用于多種農藥的檢測。

Yan 等[18]建立了基于類漆酶納米酶檢測有機磷農藥及評價有機磷解毒劑的方法。該方法的原理為：巰基膽堿的存在會抑制類漆酶納米酶催化的顯色反應，而巰基膽堿可由AChE 催化水解乙酰巰基膽堿產生；有機磷農藥（OPs）對AChE 具有很強的親和力，可以與AChE 形成磷酸化酶加合物從而抑制AChE 催化產生巰基膽堿的反應，即有機磷農藥的存在有利于類漆酶納米酶催化的顯色反應；而有機磷農藥的解毒劑碘解磷定（PAM）可以與有機磷農藥反應從而消除有機磷農藥對AChE 活性的影響，即當有機磷解毒劑PAM 存在時，由AChE 催化產生的巰基膽堿含量增加，類漆酶納米酶催化的顯色反應被抑制（圖6A）。該方法在對氧磷濃度為0～0.25 μg/mL 范圍內檢測效果良好，實驗結果表明， 1.2 mmol/L 的PAM 在10 min 內可以使對氧磷抑制的AChE 活性恢復到初始活性的90%。Song 等[46]將4 種具有類漆酶活性的銅基納米酶用于構建4 通道的比色陣列，用于OPs 的鑒別（圖6B）。結果表明，該陣列可檢測0.1～20 μg/mL 的水胺硫磷和0.1～10 μg/mL 的草銨膦，且對OPs 的鑒別不受非氨基甲酸酯農藥（CPs）或其它潛在干擾物的影響。該研究還結合智能手機的成像功能，構建了用于檢測水果和蔬菜中的OPs 的便攜裝置，該方法相比基于AChE 的方法抗干擾性更強。

此外， Song 等[51]基于農藥對Cu-Asp 的類漆酶、類過氧化物酶和類超氧化物歧化酶活性的直接影響，構建了3 通道的比色傳感陣列，并成功用于草甘膦、亞磷酸鹽、異碳磷、西維因和五氯硝基苯等8 種農藥的鑒別，且在復雜未知樣品中鑒別的準確度為100%。

4.6 時間-溫度指示器

時間-溫度指示器（Time-temperature indicator， TTI）是一種能夠實時監測產品熱變化的裝置，在多個領域特別是在食品安全和藥品保鮮等方面具有重要意義，其基本原理是通過監測受時間和溫度影響的反應來反映產品的熱變化。類漆酶納米酶可催化愈創木酚氧化并顯棕色，顏色深淺與時間、溫度相關，且該反應需要氧氣參與，基于此， Hu 等[53]設計了一種基于類漆酶納米酶的時間-溫度指示器（圖7）。通過擠壓可使包覆氧氣的氣囊破裂，釋放氧氣，觸發愈創木酚氧化顯色反應。這種設計使用戶能夠自主選擇激活時機，提高TTI 的靈活性和實用性。

5 結論與展望

本文對基于配位策略制備的類漆酶納米酶近年來在分析檢測中的應用進展進行了綜述。類漆酶納米酶在分析檢測領域被廣泛應用，但其相關研究仍然存在一系列問題亟待解決。（1）非銅基類漆酶納米酶的研究較少，其催化機理尚不明確；（2）配位策略制備的類漆酶納米酶中的配體選擇主要依靠嘗試，其選擇規律并未闡明；（3）單原子類漆酶納米酶的結構調控仍有很多問題需要解決，其負載基質、配位微環境和負載密度等的調控還需進一步探索；（4）在比較漆酶活性的實驗中存在差異性的問題，由于不同實驗室使用的漆酶來源、濃度各異，以及催化底物選擇的不同，使得各研究得出的漆酶活性結果難以直接比較，因此，漆酶活性的標準化測試方法亟待統一。此外，類漆酶納米酶在分析檢測中展現出可替代天然酶的潛力，但其與機器學習的深度融合仍處于早期階段，機器學習在基于類漆酶納米酶的分析檢測信號優化以及新應用場景方面的研究仍需進一步深入。

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浙江省教育廳項目（No. Y202351659）、寧波市自然科學基金項目（No. 202003N4078）和杭州電子科技大學科研啟動基金項目（No. KYS015624299）資助。