一株花生根瘤菌高效菌株的篩選及其在原生環境中的應用

摘 要：本研究從湖南省7個主要花生種植區采集的新鮮花生根瘤進行根瘤菌分離、純化，共獲得7株根瘤菌菌株。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測試品種，通過溫室盆栽接種試驗進行篩選，7株根瘤菌均能在兩個花生品種上有效結瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強。通過16S rDNA基因測序及序列比對，初步鑒定菌株R3-2屬于日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）。室內耐酸試驗結果顯示，菌株R3-2具有一定的耐酸性能，在pH為 5.4 （含pHgt;5.4 ）的改良的Keyser和Munns培養基上生長良好，且具有一定的重金屬耐受性。在原生環境中進行的田間小區試驗結果表明，70%常規施氮量并接種R3-2根瘤菌的處理組花生生長最佳，產量比對照組（常規施氮無接種根瘤菌）提高28.54%。菌株R3-2在固氮的同時具有一定的抵抗土壤中氫離子和重金屬脅迫的能力，為我國南方花生栽培應用根瘤菌提供了一種新的選擇。

關鍵詞：花生；日本慢生根瘤菌；耐酸；產量；生物固氮

中圖分類號：Q939.36" " " " " " " " " " 文獻標志碼：A" " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.01.006

Abstract： In this study， fresh peanut nodules were collected from seven major peanut growing areas in Hunan Province， and a total of 7 rhizobia strains were isolated and purified. The local peanut varieties Anhua small-seeded peanut and Changning small-seeded peanut varieties in Hunan Province were selected to test the capability of the 7 rhizobia strains by greenhouse pot inoculation experiments， and all 7 rhizobia strains could effectively form nodulation on the two peanut varieties， among which R3-2 and R4-6 showed the strongest nitrogen-fixing capability. Through 16S rDNA gene sequencing and sequence alignment， strain R3-2 was preliminarily identified as belonging to Bradyrhizobium japonicum. Further experiments demonstrated that the strain R3-2 had certain acid resistance and it grew well in modified Keyser and Munns medium while the pH is equal to 5.4 （including pHgt;5.4）， and holding a certain tolerance to heavy metals. Finally， field experiments were carried out in the native environment of R3-2， and the results showed that peanut yield of the treatment group with 70% conventional nitrogen application and R3-2 rhizobia inoculation was the highest， which was 28.54% higher than that of the control group which is with conventional nitrogen application without rhizobia inoculation. With the fine effect on nitrogen fixation， as well as its positive tolerances on hydrogen ion and heavy metals， strain R3-2 is the potential rhizobium utilized in peanut cultivation in southern China.

花生（Arachis hypogaea L.）是豆科一年生草本植物，我國三大傳統油料作物之一［1］。同時，花生也是全球繼大豆（Glycine max L.）、油菜（Brassica campestris L.）、向日葵（Helianthus annuus L.）之后的第四大食用油來源，第三大植物蛋白來源，花生仁平均含油45%～51%、蛋白質25%、碳水化合物24.2% ［2］。氮是農作物生長必需的三大元素之一，化學氮肥的施用為農業增產作出了巨大貢獻，但長期施用氮肥導致農田土壤出現酸化、板結等問題，影響農業健康可持續發展［3］。生物固氮是利用微生物自身固氮或微生物與植物共生固氮的模式將空氣中的氮氣轉化為植物可吸收的氮素形式，其中尤其以豆科植物和豆科根瘤菌的共生固氮效率最高［4］?；ㄉ鷮儆诙箍浦参?，花生與花生根瘤菌通過形成根瘤來固定空氣中的氮氣，為花生生長提供必需的氮素營養［5］。花生-根瘤菌共生固氮體系可以滿足花生生長所需氮量的50%左右，同時還可以改善土壤肥力，提高花生的產量和品質［6］。Shang等［7］證明，花生接種慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）后顯著改變了其根際微生物群落結構組成，增加了潛在有益微生物的相對豐度，改變了根際細菌的共生網絡。

20世紀50年代開始，我國北方花生主產區開展了一系列花生高產栽培技術研究，包括高產品種選育、花生根瘤菌接種、科學施肥、拌種、起壟等高產種植管理技術，實現了花生的高產和穩產［5］。其中，1956—1985年，花生根瘤菌的研究和應用取得重大進展，接種根瘤菌后平均每畝花生增產23.6 kg，增產率為13.4%［8］，在北方主產區獲得廣泛應用。但是，豆科作物固氮效率在不同品種和不同菌系間差異很大。鄭永美等［9］利用同位素15N示蹤技術，探究了19個花生品種的根瘤固氮效率，發現不同花生品種的根瘤結瘤數和固氮量等存在顯著差異。豆科作物生物固氮效率是作物品種、菌系及品種與菌系互作的結果［10］，同時還受一系列外在因素如土壤氮素含量、酸堿度、水分、鉀肥、溫度、土壤類型、種植年限、種植方式（混播或單播）、土著根瘤菌系及其數量、菌劑接種技術措施等因素的影響［11］。熊煥燁［12］比較了遼寧省主栽的普通結瘤特性的花生品種農花5號（NH5）和高效結瘤特性花生品種紅花16號（HH16）不同施氮量時接種根瘤菌的效果，施氮量為105 kg/hm2時效果顯著，過量施用氮肥（gt;135 kg/hm2）會抑制花生的生長。Zhao等［13］調查了酸性土壤對花生-慢生根瘤菌共生相互作用和根瘤的碳、氮代謝的影響，發現魯花11號和贛花5號在pH為5.0的土壤生長時，其生產性能、根瘤數、根瘤干重以及地上部和根部的氮含量均較低。El-Sherbeny等［14］研究表明，根瘤菌的施用策略對其增產效果影響較大，前茬花生秸稈還田配合接種慢生根瘤菌后增產效果最佳。Shao等［15］發現，花生長期連作降低了根瘤菌種群的多樣性，優勢根瘤菌遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）和渥太華慢生根瘤菌（B. ottawaense）得到了顯著富集。

研究表明，豆科根瘤菌的生長和結瘤對生存環境要求較高，通常情況下根瘤菌在中性或中堿性的土壤中結瘤固氮效果最好，而在酸性土壤中固氮結瘤效果較差［16］。中國南方花生主要種植于丘陵紅壤、黃壤，大部分土壤瘠薄，屬酸性甚至強酸性（pH 4.5～5.5）土壤，地力普遍偏低［17］，北方主產區篩選的花生根瘤菌在南方不具有競爭優勢。湖南省花生種植區的土壤主要為酸性土壤，且生產上習慣種植的花生品種大多為具有地方特色和地域優勢的地方品種，如安化小籽花生［18］、常寧小籽花生等［19］。從湖南本土的花生品種和酸性土壤環境下分離的自然結瘤的野生根瘤菌資源，再應用到其原生環境中，比其他地域分離的根瘤菌具有更好的環境適應性和更高的定殖結瘤率及固氮效率［20］。因此，本研究嘗試從湖南省本土主要花生種植區采集的新鮮花生根瘤進行根瘤菌分離，通過室內盆栽試驗和田間試驗篩選出適宜我省土壤環境和本地品種的高效花生固氮菌株，為花生根瘤菌劑的開發提供菌種資源，實現化肥減量和農業增效。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

7株花生根瘤菌為本課題組自湖南省宜章、資興、常寧、湘鄉、漣源、永順、安化等地花生新鮮根瘤中分離，分別是R1-3、R3-2、R4-6、R7、R8-3、R9-7-1、R9-7-2，置于20%甘油凍存管中-80℃保存。

1.2 供試花生品種

盆栽試驗選用安化小籽紅皮花生（農業農村部批準的農產品地理標志品種）和常寧小籽紅皮花生，田間小區試驗采用資興本地小籽花生。

1.3 培養基

花生根瘤菌的培養和分離純化采用酵母甘露醇瓊脂（yeast mannitol agar，YMA）培養基，各菌株培養液采用酵母甘露醇（yeast mannitol，YM）培養基，YMA中加溴麝香草酚藍（bromothymol blue，BTB）檢查細菌生長時的產酸或產堿反應，花生溫室栽培采用液體微氮培養液，上述所有培養基配制方法均參照文獻［21］。

菌株耐酸性評估采用Graham等［22］改良的Keyser和Munns培養基，115℃蒸汽高壓滅菌15 min，冷卻至52℃，分別調節pH值為 5.0、5.4、6.0、6.5、7.0，倒入平板，冷卻至28℃備用。

1.4 花生高效共生固氮菌株室內盆栽篩選

選擇東北某公司花生根瘤菌產品中分離的菌株R6作為對照菌株，與上述7株供試菌株組成盆栽試驗菌株，同時設置不接種根瘤菌的空白，共9個處理，每處理3個重復，共27盆，隨機排列。

選飽滿、新鮮、無破損的花生種子，表面消毒后放入墊有濾紙并加無菌水潤濕的無菌培養皿中，25℃培養箱內萌發。待種子主根2 cm長時，在預先制備的OD600（600 nm波長處的光密度值）為0.6～1.0根瘤菌YM培養液中浸泡30 min，每苗1 mL根瘤菌培養液，浸泡完成后幼苗轉移到盛有滅菌蛭石和微氮培養液的組培盆（80 mm×95 mm）。對照用滅菌的YM培養液。每處理3個重復。組培盆外覆隔光膜，溫室放置15～28℃，采用全光譜植物生長光源，光照時間16 h/d。培養45 d收獲，測量并統計花生總結瘤數、植株的地上部分干重。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態觀察和生化特征分析

按細菌鑒定手冊，對根瘤菌進行革蘭氏染色確定其革蘭氏屬性，然后在光學顯微鏡下觀察菌體形狀和大??；同時在YMA培養基中培養7 d，觀察菌落形態特征。

在添加BTB的YMA培養基中觀察根瘤菌的產酸產堿屬性，通過盆栽進行花生的回結瘤試驗［23］，檢驗這些菌株與花生共生結瘤的能力。

1.5.2 分子鑒定

提取根瘤菌基因組DNA，利用引物27F/1492R 進行16S rDNA擴增，采用DNA膠回收試劑盒，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段［20］，送湖南擎科生物技術有限公司測序。所測序列經校對、拼接后與NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank數據庫中相關種屬的序列進行BLAST比較。利用軟件MEGA 11.0構建系統進化樹，采用自舉法（Bootstrap）評估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000［21］。

1.6 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內評估

采用室內評估法對根瘤菌的pH耐受性進行初步評估。將菌株在YM培養液中28℃、150 r/min培養5 d，發酵液采用無菌水進行稀釋，至菌液濃度為2～4 CFU/μL。取25 μL上述稀釋菌液涂布在不同pH值的耐酸培養皿上，每處理5個重復。28℃培養7 d，觀察菌株生長情況。

1.7 根瘤菌R3-2菌株對多種重金屬的抗性測定

將根瘤菌在YM培養液中28℃、150 r/min培養5～7 d，取100 μL培養液涂布于含不同濃度K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4?7H2O、MnSO4?H2O、CuSO4?5H2O、Pb（NO3）2 和CoCl3 的YMA培養基上，以不添加任何重金屬的YMA平板為對照，每處理3個重復，28℃培養5～7 d［24］。根據平板上根瘤菌有無生長來評估各金屬的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.8 田間小區試驗

試驗在湖南省資興市州門司鎮燕窩村前臺組進行，土壤為細沙壤土，pH為5.1，有機質為44 g/kg，全氮為2.06 g/kg，堿解氮為153.6 mg/kg，有效磷為14.7 mg/kg，緩效鉀為544 mg/kg，速效鉀為29 mg/kg。供試菌株是根瘤菌R3-2和對照菌株R6。試驗設7個處理，每處理3個重復，隨機區組排列，小區面積20 m2，共21個小區，總面積420 m2。處理1：Con（常規施肥量施肥）；處理2：50%NR3（常規施肥量的50%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理3：50%NR6（常規施肥量的50%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理4：70%R3（常規施肥量的70%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理5：70%NR6（常規施肥量的70%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理6：100%NR3（常規施肥量施肥，根瘤菌R3拌種）；處理7：100%NR6（常規施肥量施肥，根瘤菌R6拌種）。常規施肥量的N、P、K用量水平一致，分別按N、P2O5、K2O計算含量為15%－15%－15%，總施用量按375 kg/hm2進行。同時，田土翻耕前按750 kg/hm2標準施用鈣鎂磷肥。2022年4月22日播種，點播，穴間距20～25 cm，每穴3粒，出苗后間苗，每穴定苗2株。播種前用菌劑拌種，根瘤菌水劑用量每畝100 mL，菌數2×108 CFU/mL，先將菌劑與適量細土混合加適量水拌種、晾干，即拌即用。試驗地的田間管理同一般大田。

花生成熟后，2022年8月18日收獲，每小區單打單收測產，同時每一處理按五點隨機法取樣5穴共10株，分別測定株均根瘤數、株均瘤干重、飽果率、莢果產量（kg/hm2）。

1.9 試驗設計與統計分析

采用隨機區組的試驗設計，試驗結果采用新復極差多重比較法（Duncan’s new multiple range test，MRT）［25］。所有數據分析應用SPSS statistics 17.0軟件完成［26］。

2 結果與分析

2.1 室內盆栽篩選結果

2.1.1 總結瘤數

對分離的野生根瘤菌進行盆栽回接試驗，檢驗這些菌株與花生共生結瘤的能力。首先考察了總平均結瘤數，由表 1、圖1可知，兩種花生品種接種不同根瘤菌菌株后均能有效結瘤，不同菌株在同一品種上的總平均結瘤數存在差異，且不同菌株在兩種花生上的總平均結瘤數的排列順序呈現相同的趨勢，結瘤數由低到高依次為R9-7-2、R9-7-1、R3-2、R4-6、R6、R1-3、R7、R8-3。其中R8-3在常寧花生和安化花生兩個品種上的結瘤數最高，分別為173.0±8.7和201.3±34.5，顯著高于其他菌株，其次為菌株R7，在兩個品種上的結瘤數分別達到133.3±23.5和135.3±24.0，顯著高于除R8-3之外的其他菌株，表明這兩株菌在這兩個品種上的結瘤能力最強。其他菌株之間的結瘤數部分有顯著差異，且兩種不同的花生品種上的差異性也不一致。

2.1.2 地上部分干重

花生地上部分干重是間接反映固氮能力的指標，為此我們測定了所有盆栽試驗各處理組的地上部分干重。結果如表2、圖1a所示，不同花生接種不同菌株后地上部分干重差異很大。各處理組常寧花生的地上部分干重從小到大依次為Con、R9-7-2、R9-7-1、R7、R8-3、R1-3、R6、R3-2、R4-6，而安化花生的不同處理組地上部分干重從小到大依次為R8-3、R7、Con、R9-7-1、R9-7-2、R1-3、R4-6、R6、R3-2。對比結瘤數據，發現結瘤能力強的菌株并未表現出相應的高固氮能力，具體表現在R8-3、R7總結瘤數遠高于其他菌株（圖1b），而相對應兩個花生品種的地上部分干重卻都不是最高的，甚至R7菌株在安化花生上接種后地上部分干重居于所有菌株的最低水平。而R4-6、R6、R3-2三個菌株，卻在兩種花生品種的地上部分干重上都表現出顯著優勢。商業菌株R6作為東北地區的優勢菌株，也在此次室內盆栽試驗中表現了優良的固氮性能。因此，通過地上部分干重，初步確定有潛力的優勢菌株為R4-6、R3-2。

2.2 根瘤菌R3-2菌株鑒定

在盆栽回接試驗的基礎上，選擇1株固氮優勢菌株R3-2進行菌種鑒定試驗。

首先對根瘤菌R3-2進行形態鑒定，結果如圖2所示，菌體細胞呈桿狀、不直，革蘭氏染色陰性，菌體大小為（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm。在YMA培養基上培養7 d后菌落圓形，凸起，半透明，乳白色，直徑1～2 mm， 好氧生長，在添加BTB的YMA培養基上產堿。

以菌株R3-2基因組DNA為模板，利用引物27F/1492R對其16S rDNA基因序列進行擴增和測序，獲得了長度為1 366 bp的序列，并提交至GeneBank數據庫，基因登錄號為PP956620。在NCBI數據庫中經過BLAST比對后，結果表明，該菌株的16S rDNA序列與日本慢生根瘤菌（B. japonicum）序列的相似度為99.71%。進一步選擇部分相似度較高菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 11.0軟件的鄰接法構建系統發育樹（圖3）。結果表明，菌株R3-2與多株日本慢生根瘤菌（B. japonicum）聚類在一起，處于一個分支， 初步將該菌鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。

2.3 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內評估

由于南方花生產區的土壤主要為酸性土壤，需要對花生根瘤菌對酸性的適應性進行測定［17］。結果如圖4所示，R3-2具有一定的耐酸性能，在pH 為5.4至弱酸性的改良的Keyser和Munns培養基仍生長良好，但在pH為4.8的培養基上不能生長。

2.4 根瘤菌對多種重金屬的抗性測定

由于南方花生產區的部分土壤重金屬含量較高，需要對花生根瘤菌對重金屬的耐受性進行測定。結果如表3所示，R3-2對K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、Pb（NO3）2、CoCl3等多種重金屬都具有一定的抗性。

2.5 田間小區試驗

選取固氮和耐酸能力較強的R3-2菌株在其分離的田塊進行田間小區試驗，收獲后每處理組隨機取樣5穴共10株，分別測定根瘤數、瘤干重、地上部分干重、飽果率、莢果每公頃產量（kg/hm2）。結果如表4所示，在田間小區試驗中，R3-2菌株和商業菌株R6在不同施氮量的處理組中都能與花生正常結瘤，平均每株結瘤數量都維持在較高的水平［（129.0～198.7）個/株］，其中平均結瘤數最高的處理組為100R6組，達到（198.7±15.5）個/株。各處理組平均瘤干重雖然也呈現一定的差異性，但差異經統計學分析，不顯著。產量方面，3個不同施氮水平下接種R3-2菌株處理組的產量都高于接種商業菌株R6處理組。其中70R3組（70%施氮量接種R3-2處理組）花生產量最高，折合產量達到（2 722.3±196.67） kg/hm2，顯著高于70R6組（70%施氮量接種R6處理組）和其他處理組（Plt;0.05），該處理組比對照組Con增產28.54%，比70R6組增產14.20%；其次為100R3組（100%施氮量接種R3-2處理組），產量比對照組Con增加13.88%（Plt;0.05），比100R6組增產6.59%；50R3組（減氮50%后接種R3-2處理組）花生產量與對照組Con（100%施氮量）相當，比50R6組（減氮50%后接種R6處理組）產量高6.11%，其差異不顯著。

上述結果表明，R3-2菌株的增產性能優于北方商業菌株R6，接種R3-2菌株能減少氮肥用量50%，在減少30%氮肥用量的情況下同時接種R3-2菌株能獲得較高的花生產量。

3 討論

3.1 花生根瘤菌在原生環境中的生物適應性和競爭優勢

為提高根瘤菌對本土環境的適應性，本研究從湖南采集的花生根瘤中分離到了7株根瘤菌。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測試品種，通過溫室盆栽接種試驗進行篩選，7株根瘤菌均能在兩個花生品種上有效結瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強。本研究通過實驗室內栽培和田間小區試驗結果，表明菌株R3-2具有很好的耐酸、固氮、增產性能，還具有一定的重金屬抗性，是一株綜合性能優良、能夠適應我國南方酸性土壤花生栽培的優良花生根瘤菌株。雖然室內栽培試驗時選自東北的R6菌株與R3-2比較沒有顯著差異，但在酸性土壤的田間試驗中，R3-2優勢凸顯，減氮30%后仍增產28.54%，同等情況下R6僅增產12.56%，甚至在減氮50%時接種R6出現減產（-4.82%），表明在原生環境下R3-2具有顯著的生物適應性和競爭優勢。這一結果和目前許多通過從本土分離根瘤菌提高對環境適應性和競爭力的報道是一致的。例如，Jovino等［27］通過田間試驗證明，接種本土分離的Bradyrhizobium sp. ESA 123分別使豆莢和花生粒產量提高了9.3%～44.1%、14.5%～51.3%，比廣泛應用的商業化菌種B. elkanii SEMIA 6144結瘤效果更好。El-Sherbeny等［14］施用植物殘體和本土慢生根瘤菌顯著提高了花生鮮重和干重、莢重和種子重及生物產量。杜普旋等［28］從廣東省本土分離篩選出了1株共生固氮性狀優良的花生根瘤菌GDHS-5，屬于慢生根瘤菌屬，這個菌株具有廣譜結瘤性，田間試驗表明，接種GDHS-5分別使單株莢果數和產量顯著增加35.82%、9.92%。劉鵬［17］從福建不同酸性土壤種植區域的花生根瘤中分離到4株固氮效率較高的根瘤菌，田間試驗表明，接種根瘤菌后花生生物量分別提高了33.6%、37.7%、38.0%和27.1%，花生產量提高了24.7%～104.2%，增產最高的為FAMB12-6菌株。劉瑞瑞等［29］以采自河北省保定市淶水縣的花生根瘤為原材料，成功篩選出可與該種花生高效固氮的優良菌株，接種Hbu074005菌株效果最佳，花生植株干質量較對照組提高52.29%，其結瘤數、果穗數、植株株高等指標也明顯優于對照組及其他處理，分別較對照組提高235.56%、112.00%、31.31%。與這些菌株相比，本研究分離的R3-2菌株是從湖南本土分離的耐酸能力強的菌株，能在pH為5.4的培養基上生長，同時還有耐受重金屬的性能，且由于該菌株分離自本地花生品種，其在原生環境中的田間應用效果表現非常穩定，對于湖南本地花生品種的高效種植具有較大的應用潛力。

3.2 花生根瘤菌的種群多樣性

本研究從湖南地方品種中采集的花生根瘤中分離到優異根瘤菌R3-2，通過16S rDNA基因測序及序列比對，初步鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。當前已報道從花生根瘤中分離到的根瘤菌具有一定的種群多樣性，如Chen等［30］調查了廣東省花生根瘤菌的多樣性和地理分布，分離到的216株在屬水平都屬于慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），在種水平可以歸屬為22個種，其中占比高的14個種都為新種，還包括日本慢生根瘤菌（B. japonicum）、重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficiens）、圓明園慢生根瘤菌（B. yuanmingense）、花生慢生根瘤菌（B. arachidis）、廣東慢生根瘤菌（B. guangdongense）、廣西慢生根瘤菌（B. guangxiense）、西表島慢生根瘤菌（B. iriomotense）和遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）等8個已知種。Paudel等［31］從花生根瘤中分離到了一株慢生根瘤菌Lb8 初步鑒定為重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficens），并證明水平基因轉移和轉座子等DNA元件的插入為根瘤菌基因組帶來了可塑性。Bouznif等［32］嘗試研究來自不同地理區域的許多不同野生和栽培豆類物種相關的慢生根瘤菌的系統地理學，對67株來自花生的慢生根瘤菌基因組序列（絕大部分來自中國，1株來自印度）進行系統進化分析，表明從中國分離的花生根瘤菌跟非參考菌株聚在一類，說明這些菌株的來源還不清楚，但這些菌株跟大豆中分離的根瘤菌具有高度的相似性。Zhang等［33］從河南正陽采集的花生根瘤中分離、鑒定了3株慢生根瘤菌新種，定名為正陽慢生根瘤菌（B. zhengyangense sp. nov.）。Li等［34］從廣東采集的花生根瘤中分離鑒定了3個慢生根瘤菌新種 ，定名為南寧慢生根瘤菌（B. nanningense sp. nov.）、 廣州慢生根瘤菌（B. guangzhouense sp. nov.）和湛江慢生根瘤菌（B. zhanjiangense sp. nov.）。本研究從湖南本土分離出的花生根瘤菌的遺傳多樣性與上述研究結果相符，同時也表明慢生根瘤菌是與花生共生結瘤固氮的主要根瘤菌類群。

3.3 花生根瘤重量與植株產量的相關性

本研究在盆栽試驗中發現，R8-3的結瘤水平最高，但它處理后的花生地上部分干重卻低于其他結瘤水平中等的R3-2和R4-6，尤其是處理安化花生品種后，地上部分干重顯著低于R3-2和R4-6處理后的花生（Plt;0.01）。酸性田間土壤的田間小區試驗也發現，三種不同施氮水平下，北方商業化根瘤菌R6的根瘤干重均大于本土分離的R3-2，部分處理的根瘤數也大于R3-2處理，但是R3-2處理后的花生產量則均高于R6處理，尤其是在70%施氮量下，差異達到顯著水平（Plt;0.05）。這些結果說明，根瘤菌在花生上形成的根瘤數和根瘤重量與植株生長和產量不呈現正相關，該結果與前人報道的根瘤菌鮮重與產量呈顯著正相關［35］的結論不同。分析原因，可能是由于根瘤的產生需要消耗大量的能量和光合代謝產物，本土菌株R3-2在進化過程中與原生寄主形成了更優的共生機制，對原生環境中的生長環境因素如光照強度、土壤氮濃度、溫濕度、土著微生物群落等更加適應，能夠將根瘤的重量控制在合理的水平，表現了更好的根瘤生產經濟性，而北方的R6菌株應用到南方非原生環境中后，土壤更低的氮素水平、pH等因素，刺激菌株做出對環境的競爭性響應，表現出根瘤超量，從而過多消耗寄主光合作用的產物，影響了寄主自身生長和花生生產。這些結果同時提示我們，優異根瘤菌的評價標準不應以結瘤數量和根瘤重量為主要衡量指標，而應根據結瘤水平并結合產量指標來進行綜合評價。

綜上所述，我們從湖南本土花生中分離到了一株日本慢生根瘤菌R3-2，該菌株在原生環境中展現出了優異的增產性能，具有很好的推廣應用前景。該菌株的田間小區試驗目前僅在原生環境和原生寄主進行，后續將進一步研究和考察它在湖南其他地區和其他花生品種上是否有同樣的優勢。

參考文獻（References）：

［1］ 崔釗達， 華樹春， 王善高. 中國花生產業集聚水平和比較優勢分析［J］. 河北農業大學學報 （社會科學版）， 2020， 22（5）： 20-27.

CUI Zhaoda， HUA Shuchun， WANG Shangao. The agglomeration level and comparative advantages of China’s peanut industry［J］. Journal of Hebei Agricultural University （Social Sciences）， 2020， 22（5）： 20-27.

［2］ 李林， 劉登望. 南方花生高產高效栽培新技術［M］. 長沙： 湖南科學技術出版社， 2015.

LI Lin， LIU Dengwang. New high-yield and high-efficiency cultivation techniques of southern peanut［M］. Changsha： Hunan Science and Technology Press Corporation， 2015.

［3］ 楊軍， 劉承武， 李霞， 等. 豆科植物-微生物共生固氮研究進展［J］. 植物生理學報， 2023， 59（8）： 1407-1435.

YANG Jun， LIU Chengwu， LI Xia， et al. Advances in the legume-rhizobia symbiosis［J］. Plant Physiology Journal， 2023， 59（8）： 1407-1435.

［4］ 胡楚婷. 根瘤菌與植物共生的研究進展［J］. 世界生態學， 2024， 13（2）： 134-142.

HU Chuting. Advances in research on rhizobium and plant symbiosis［J］. International Journal of Ecology， 2024， 13（2）： 134-142.

［5］ 周平貞， 胡濟生. 我國花生根瘤菌技術應用與研究進展［J］. 土壤學報， 1990， 27（4）： 353-360.

ZHOU Pingzhen， HU Jisheng. Recent advance in study of rhizobium inoculation technology in groundnut production of China［J］. Acta Pedologica Sinica， 1990， 27（4）： 353-360.

［6］ 吳月， 隋新華， 戴良香， 等. 慢生根瘤菌及其與花生共生機制研究進展［J］. 中國農業科學， 2022， 55（8）： 1518-1528.

WU Yue， SUI Xinhua， DAI Liangxiang， et al. Research advances of Bradyrhizobia and its symbiotic mechanisms with peanut［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2022， 55（8）： 1518-1528.

［7］ SHANG J Y， WU Y， HUO B， et al. Potential of Bradyrhizobia inoculation to promote peanut growth and beneficial Rhizobacteria abundance［J］. Journal of Applied Microbiology， 2021， 131（5）， 2500-2515.

［8］ 孫彥浩， 陳殿緒. 花生施氮肥效果與根瘤菌固N的關系［J］. 中國油料作物學報， 1998， 20（3）： 69-72.

SUN Yanhao， CHEN Dianxu. The relationship between the effect of N application and nitrogen fixation in peanut［J］. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 1998， 20（3）： 69-72.

［9］ 鄭永美， 孫秀山， 王才斌， 等. 高肥力土壤條件下不同基因型花生對氮素利用的差異［J］. 應用生態學報， 2016， 27（12）： 3977-3986.

ZHENG Yongmei， SUN Xiushan， WANG Caibin， et al. Differences in nitrogen utilization characteristics of different peanut genotypes in high fertility soils［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2016， 27（12）： 3977-3986.

［10］ 陸保福， 康文娟， 師尚禮， 等. 紫花苜蓿與根瘤菌共生過程中固氮效率的動態研究［J］. 中國草地學報， 2024， 46（6）： 36-48.

LU Baofu， KANG Wenjuan， SHI Shangli， et al. The study on dynamics of nitrogen fixation efficiency of alfalfa-rhizobia symbiosis［J］. Chinese Journal of Grassland， 2024， 46（6）： 36-48.

［11］ 曾昭海， 胡躍高， 陳文新， 等. 共生固氮在農牧業上的作用及影響因素研究進展［J］. 中國生態農業學報， 2006， 14（4）： 21-24.

ZENG Zhaohai， HU Yuegao， CHEN Wenxin， et al. Review on studies on the important role of symbiotic nitrogen fixation in agriculture and livestock production and the factors affecting its efficiency［J］. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2006， 14（4）： 21-24.

［12］ 熊煥燁. 根瘤菌劑和施氮量對不同結瘤特性花生生長發育及氮素轉運的影響［D］. 沈陽： 沈陽農業大學， 2023.

XIONG Huanye. Effects of rhizobia agent and nitrogen application rate on peanut growth and development and nitrogen transport with different nodulation characteristics［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University， 2023.

［13］ ZHAO Y Y， JIANG H J， XU F J， et al. Soil acidification negatively affects Arachis hypogeae L. growth by inhibiting nodule initiation and nitrogen fixation［J］. Journal of Soil Science and Plant Nutrition， 2021， 22（1）： 1-14.

［14］ EL-SHERBENY T M S， MOUSA A M， ZHRAN M A. Response of peanut （Arachis hypogaea L.） plant to bio-fertilizer and plant residues in sandy soil［J］. Environmental Geochemistry and Health， 2023， 45（2）： 253-265.

［15］ SHAO S， CHEN M， LIU W， et al. Long-term monoculture reduces the symbiotic rhizobial biodiversity of peanut［J］. Systematic and Applied Microbiology， 2020， 43（5）： 126-131.

［16］ 楊江科， 周琴， 周俊初. pH對土壤中土著快、慢生大豆根瘤菌結瘤的影響［J］. 應用生態學報， 2001， 12（4）： 639-640.

YANG Jiangke， ZHOU Qin， ZHOU Junchu. Effect of pH on nodulation of indigenous fast and slow growing soybean rhizobia in soil［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2001， 12（4）： 639-640.

［17］ 劉鵬. 酸性土壤上花生高效根瘤菌的發現及應用［D］. 福州： 福建農林大學， 2019.

LIU Peng. Discovery and application of effective rhizobium strains for peanut on acid soils［D］. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2019.

［18］ 田中華. 安化小籽花生［J］. 湖南農業， 2022， 1（4）： 25.

TIAN Zhonghua. Anhua small seed peanut［J］. Hunan Agricuture， 2022， 1（4）： 25.

［19］ 李玉芳， 馬杰， 肖立一， 等. 湖南花生產業發展現狀與建議［J］. 湖南農業科學， 2018， 1（11）： 105-107， 111.

LI Yufang， MA Jie， XIAO Liyi， et al. Development status and suggestions of peanut industry in Hunan province［J］. Hunan Agricultural Sciences， 2018， 1（11）： 105-107， 111.

［20］ ZHANG X， NICK G， KAIJALAINEN S， et al. Phylogeny and diversity of Bradyrhizobium strains isolated from the root nodules of peanut （Arachis hypogaea） in Sichuan， China［J］. Systematic amp; Applied Microbiology， 1999， 22（3）： 378.

［21］ 陳文新， 汪恩濤. 中國根瘤菌［M］. 北京： 科學出版社， 2011.

CHEN Wenxin， WANG Entao. Chinese Rhizobia ［M］. Beijing： Science Press， 2011.

［22］ GRAHAM P H， VITERI S E， MACKIE F， et al. Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli［J］. Field Crops Research， 1982， 5（1982）：121-128.

［23］ 吳海燕. 花生根瘤菌高效菌株的篩選及固氮效果研究［D］. 長春： 吉林農業大學， 2002.

WU Haiyan. Study on inoculation effect and ecological characteristics of original peanut nodule bacteria in Jilin province［D］. Changchun： Jilin Agricultural University， 2002.

［24］ 崔永亮， 羅偉， 雷久城， 等. 重金屬脅迫下花生根瘤菌的溶磷作用研究［J］. 資源開發與市場， 2023， 39（9）： 1184-1190.

CUI Yongliang， LUO Wei， LEI Jiucheng， et al. Analysis on the phosphorus solubilization of peanut rhizobium under heavy metal stress［J］. Resource Development amp; Market， 2023， 39（9）： 1184-1190.

［25］ SIZENANDO C I T， RAMOS J P C， FERNANDES J P I， et al. Agronomic efficiency of Bradyrhizobium in peanut under different environments in Brazilian Northeast［J］. African Journal of Agricultural Research， 2016， 11（37）： 3482-3487.

［26］ 劉世旺， 徐艷霞， 顏蕾， 等. 土著花生根瘤菌田間試驗研究［J］. 湖北農業科學， 2015， 54（6）： 1328-1330.

LIU Shiwang， XU Yanxia， YAN Lei， et al. Studies on field experiment with Rhizobium strain of indigenous peanut［J］. Hubei Agricultural Sciences， 2015， 54（6）： 1328-1330.

［27］ JOVINO R S， DA SILVA T R， RODRIGUES R T， et al. Elite Bradyrhizobium strains boost biological nitrogen fixation and peanut yield in tropical drylands［J］. Brazilian Journal of Microbiology， 2022， 53（3）： 1623-1632.

［28］ 杜普旋， 陳榮華， 鄧權清， 等. 花生根瘤菌的分離篩選及應用［J］. 南方農業學報， 2023， 54（1）： 102-109.

DU Puxuan， CHEN Ronghua， DENG Quanqing， et al. Isolation， screening and application of peanut rhizobia［J］. Journal of Southern Agriculture， 2023， 54（1）： 102-109.

［29］ 劉瑞瑞， 危期， 劉夢函， 等. 高效固氮花生根瘤菌株的篩選［J］. 江蘇農業科學， 2016， 44（7）： 472-475.

LIU Ruirui， WEI Qi， LIU Menghan， et al. Screening of efficient nitrogen-fixing peanut rhizobia strains［J］. Jiangsu Agricultural Sciences， 2016， 44（7）： 472-475.

［30］ CHEN J， HU M， MA H， et al. Genetic diversity and distribution of Bradyrhizobia nodulating peanut in acid-neutral soils in Guangdong Province［J］. Systematic and Applied Microbiology， 2016， 39（6）： 418-427.

［31］ PAUDEL D， LIU F， WANG L， et al. Isolation， characterization， and complete genome sequence of a Bradyrhizobium strain Lb8 from nodules of peanut utilizing crack entry infection［J］. Frontiers in Microbiology， 2020， 11： 93-96.

［32］ BOUZNIF B， GUEFRACHI I， RODRíGUEZ DE LA VEGA R C， et al. Phylogeography of the Bradyrhizobium spp. associated with peanut， Arachis hypogaea： fellow travelers or new associations？ ［J］. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 2041-2047.

［33］ ZHANG J， WANG N， LI S， PENG S， et al. Bradyrhizobium zhengyangense sp. nov.， isolated from effective nodules of Arachis hypogaea L. in central China［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2023， 73（3）： 005723.

［34］ LI Y H， WANG R， SUI X H， et al. Bradyrhizobium nanningense sp. nov.， Bradyrhizobium guangzhouense sp. nov. and Bradyrhizobium zhanjiangense sp. nov.， isolated from effective nodules of peanut in Southeast China［J］. Systematic and Applied Microbiology， 2019， 42（5）： 126002.

［35］ 鄭永美， 杜連濤， 王春曉， 等. 不同花生品種根瘤固氮特點及其與產量的關系［J］. 應用生態學報， 2019， 30（3）： 961-968.

ZHENG Yongmei， DU Liantao， WANG Chunxiao， et al. Nitrogen fixation characteristics of root nodules in different peanut varieties and their relationship with yield［J］. The Journal of Applied Ecology， 2019， 30（3）： 961-968.

收稿日期：2024-07-12；修回日期：2024-08-16。

基金項目：長沙市自然科學基金項目（kq2208130）；國家自然科學基金項目（32000047）；湖南省技術攻關“揭榜掛帥”項目（2021NK1040）。

作者簡介：陳海榮，高級農藝師，主要從事農用微生物研究及開發。

*通信作者：劉宇波，高級工程師，主要從事農用微生物研究及開發。E-mail： lyubo123@163.com。