人參果總黃酮的提取及體外抗氧化活性研究

摘要 ［目的］研究人參果總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性。［方法］采用萃取法提取人參果總黃酮，探究人參果總黃酮提取工藝中乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對總黃酮提取量的影響。結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)，對人參果總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定其抗氧化能力。［結(jié)果］人參果總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶30（g∶mL）、乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h，總黃酮提取量達(dá)到10.543 mg/g。總黃酮提取液對DPPH自由基、羥自由基的半抑制濃度（IC50）分別為86.68、68.08 mg/mL。［結(jié)論］該研究為人參果總黃酮的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞 人參果；總黃酮；響應(yīng)面試驗(yàn)；提取工藝優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號 R284" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.033

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Total Flavonoids from Ginseng Fruit

MA Chang sheng1，CHEN Ying^2，3，GUO Xing chen^2，3 et al

（1.Tianshui City Zhangjiachuan Center for Disease Control，Tianshui，Gansu 741500;2.Biomedical Research Center，Northwest Minzu University/China Malaysia National Joint Laboratory，Lanzhou，Gansu 730124;3.College of Life Science and Engineering，Northwest Minzu University，Lanzhou，Gansu 730124）

Abstract ［Objective］To study the extraction process and antioxidant activity of total flavonoids from ginseng fruit.［Method］The extraction method was used to extract total flavonoids from ginseng fruit，the effects of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time and solid liquid ratio on the total flavonoids extraction amount in the extraction process of ginseng fruit total flavonoids were explored.Combined with the response surface experiment，the extraction process of total flavonoids from ginseng fruit was optimized，and its antioxidant capacity was determined.［Result］The optimal extraction process of total flavonoids from ginseng fruit was solid liquid ratio 1∶30 （g：mL），ethanol concentration 60%，extraction temperature 70 ℃ and extraction time 2 h，the extraction amount of total flavonoids reached 10.543 mg/g.The half inhibitory concentrations （IC50） of total flavonoid extract on DPPH radicals and hydroxyl radicals were 86.68 and 68.08 mg/mL，respectively.［Conclusion］ This study provides data support for the development and utilization of total flavonoids in ginseng fruit.

Key words Ginseng fruit;Total flavonoids;Response surface experiment;Extraction process optimization;Antioxidant activity

基金項(xiàng)目 西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資金資助項(xiàng)目（31920230153）；甘肅省高校青年博士支持項(xiàng)目（2023QB-001）；蘭州市城關(guān)區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022JSCX0011）；甘肅省科技廳科技專員專項(xiàng)（23CXGA0078）；甘肅省科技廳科技型中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（23CXGP0002）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2023-QN-69）；西北民族大學(xué)校地合作項(xiàng)目配套基金項(xiàng)目（BELTY201901，HLRP-KY-20210902）。

作者簡介 馬長生（1976—），男，甘肅天水人，教授，博士，從事營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究。

收稿日期 2024-03-27

人參果是一種茄科多年生雙子葉植物，其葉互生，單出或三裂片，花冠為白色或淡紫色^［1］，果實(shí)單個(gè)重量可達(dá)400 g^［2］。人參果起源于南美洲，在中國甘肅、青海、云南等地大面積種植^［3］，因其具有優(yōu)雅的香氣、新鮮多汁的果肉和獨(dú)特的風(fēng)味而備受關(guān)注^［4］。人參果可食用部分超過95%，含糖低，富含必需氨基酸、鋅、鐵、硒等，同時(shí)也含有豐富的抗氧化類黃酮物質(zhì)，被冠以“防癌之王”^［5］。因其屬弱堿性食品，能很好地預(yù)防冠心病、高血壓等，在人體內(nèi)具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等重要功能^［6］。

黃酮類化合物是指苯環(huán)由3個(gè)碳原子和2個(gè)酚羥基結(jié)合而構(gòu)成的化合物，主要以糖苷的形式存在^［7］。它們大多為結(jié)晶狀，在極性溶劑如水、乙醇中溶解，在苯類、氯仿等有機(jī)溶劑中不易溶解^［8］。黃酮具有較好的抗氧化特性，如焦興弘^［9］研究發(fā)現(xiàn)從天梯山人參果中得到的黃酮溶液具有清除游離·OH和O2-·的特殊作用，在2.0 mg/mL的條件下，其清除效果與VC、檸檬酸的效果基本一致。總黃酮具有舒張血管的功效，同時(shí)具有降血壓、抗血栓的功能，因此可以有效地防治心腦血管疾病^［10］。孫皎等^［11］研究發(fā)現(xiàn)人參果皂莢聯(lián)合九里香葉總黃酮能夠保護(hù)糖尿病性心肌病，其作用機(jī)理是提高身體的抗氧化能力，大大降低自由基在體內(nèi)的氧化作用。黃酮類化合物能夠抑制癌細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫力。現(xiàn)有研究表明，黃芩^［12］、黃花羊耳蒜^［13］、藤本豆豆莢^［14］等植物中的總黃酮能夠抑制腫瘤生長，這也為人參果總黃酮的醫(yī)用價(jià)值提供了參考。同時(shí)，黃酮類化合物在抗炎、抗菌和抗肝毒性方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如周強(qiáng)等^［15］研究發(fā)現(xiàn)黃酮醇類化合物能夠抑制枯草芽孢桿菌，晏俊玲等^［16］研究發(fā)現(xiàn)苦筍總黃酮濃度在1.20 mg/mL時(shí)，對NO的抑制率達(dá)到93.94%，具有極好的抗炎癥效果。人參果中含有大量的類黃酮，如果能夠得到合理的提取，將為生物營養(yǎng)、保健、藥物研發(fā)等方面提供切實(shí)可行的思路。

有機(jī)溶劑提取、微波加熱提取、超聲波加熱輔助提取是目前從天然植物中提取黃酮的主要工藝方法。葉嘉等^［17］采用乙醇回流浸提法從柴胡莖葉中提取總黃酮，發(fā)現(xiàn)在1∶20（g∶mL）的料液比和70 ℃的條件下，使用60%乙醇溶液浸提2 h效果最佳，提取液與VC在抑制自由基方面有協(xié)同作用。李少華等^［18］采用微波輔助酶法提取葛根黃酮，發(fā)現(xiàn)在pH=6和200 W的微波功率下，添加3.0%的復(fù)合酶并提取40 min時(shí)的效果最佳。王順新等^［19］采用超聲波輔助提取人參果葉黃酮，在1∶20（g∶mL）的料液比和320 W的超聲功率下，使用80%甲醇溶液浸提55 min，提取率高達(dá)1.39%。目前，對人參果總黃酮提取的研究較少。該研究采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化人參果總黃酮的提取工藝參數(shù)，并通過DPPH自由基和羥自由基清除試驗(yàn)，研究其體外抗氧化能力，為人參果總黃酮的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑 石油醚（沸程60～90 ℃，分析純）、過氧化氫（分析純），山東初鑫化工有限公司；無水三氯化鋁（分析純）、無水乙醇（分析純）、水楊酸（分析純），山東初鑫化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（C27H30O16·3H2O，純度gt;98%）、硫酸亞鐵（分析純），上海純優(yōu)生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；抗壞血酸（VC），西安拉維亞生物科技有限公司。

0.100 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱量0.100 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于50%乙醇溶液中，定容至100 mL。將上述溶液移出10 mL，用50%乙醇溶液定容至100 mL，備用。

1.2 原料預(yù)處理 人參果果實(shí)采摘于中國甘肅省武威市，將人參果去皮后切片，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)凍干72 h，粉碎后過60目篩子備用。

1.3 人參果總黃酮提取工藝流程 將1 g人參果樣品置于三角瓶中，加入50 mL乙醇，超聲提取50 min后，過濾到容量瓶中。三角瓶中加入40 mL乙醇溶液后超聲提取20 min并過濾。取10 mL乙醇溶液再次對濾渣進(jìn)行超聲提取20 min并過濾，濾液置于容量瓶中，乙醇溶液定容至刻度。

1.4 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定參考SZDB/Z 349—2019。吸取0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，以試劑作為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以總黃酮含量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取2.0 mL樣品置于比色管中，使用乙醇溶液補(bǔ)充至5.0 mL，依次加入NaNO2溶液、Al（NO3）3溶液、NaOH溶液，混勻，放置6 min，用乙醇溶液定容至刻度，混勻，放置15 min。以不添加Al（NO3）3溶液的試樣液吸光度作為空白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣溶液的總黃酮含量。樣品中總黃酮含量（ω，mg/g）按下列公式計(jì)算：

ω=m×VM×V1×100

式中：m為試樣溶液的總黃酮（mg）；V為試樣的提取體積（mL）；V1為檢測時(shí)吸取試樣的體積（mL）；M為試樣的質(zhì)量（g）。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用乙醇為萃取劑提取人參果總黃酮，以乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，g∶mL）、提取時(shí)間（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以萃取時(shí)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，總黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值。利用Design-Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken Design原理，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化人參果總黃酮的提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.7 人參果總黃酮抗氧化能力測定

1.7.1 人參果總黃酮對DPPH自由基的清除率。用無水乙醇將總黃酮提取液配制成濃度為20、50、80、110、140、180 μg/mL的樣品溶液，參照Zhang等^［20］的研究，取每種濃度樣品溶液2 mL并加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，以VC作為陽性對照，測定517 nm處溶液的吸光度，計(jì)算試樣總黃酮對DPPH自由基的清除率：

清除率=（1-A-A0A0）×100%

式中：A0為陽性對照組吸光度；A為樣品所測吸光度。

1.7.2 人參果總黃酮對羥自由基的清除率。參照Wang等^［21］的研究，取“1.7.1”所述各濃度樣品溶液2 mL，加入4.5 mmol/L FeSO4溶液、4.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、4.4 mmol/L H2O2溶液，以VC作為陽性對照，計(jì)算試樣總黃酮對羥自由基的清除率：

清除率=（1-A-A0A0）×100%

式中：A0為陽性對照組吸光度；A為樣品所測吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)處理 使用Origin 2022繪制數(shù)據(jù)圖像，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總處理。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響。從圖1可以看出，隨著乙醇濃度增加，總黃酮提取量先是迅速增加之后又不斷減少，在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到峰值（7.17 mg/g），此后由于醇溶性雜質(zhì)干擾總黃酮的溶解，使得比色后的吸光度降低，影響了總黃酮的提取量^［22］。趙象忠^［23］使用65%乙醇溶液提取人參果黃酮時(shí)黃酮提取量達(dá)到4.71 mg/g，低于該試驗(yàn)（7.17 mg/g）。綜上，該試驗(yàn)確定適宜的乙醇濃度為60%。

2.1.2 料液比對總黃酮提取量的影響。從圖2可以看出，原料總量不變而乙醇溶液增加時(shí)，總黃酮提取量先是迅速增加之后又不斷減少，在料液比1∶30時(shí)達(dá)到峰值。正常情況下，溶劑量越大，物質(zhì)浸取效果越好，但在提取總黃酮過程中，浸提液過量，醇溶性雜質(zhì)大量溶解，總黃酮逐步氧化，影響了提取效果^［24］。周新崇等^［25］研究發(fā)現(xiàn)料液比增大到一定程度后，總黃酮溶解完全，受到非黃酮物質(zhì)的活性競爭，含量會(huì)大大降低。綜上，該試驗(yàn)確定最佳料液比為1∶30。

2.1.3 提取時(shí)間對總黃酮提取量的影響。從圖3可以看出，2 h前總黃酮提取量逐漸增加，2 h之后提取量下降。這可能是由于總黃酮在長時(shí)間提取時(shí)發(fā)生氧化和降解，導(dǎo)致吸光度驟然減小，致使提取量降低^［26］。盧健新等^［27］研究發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間過長時(shí)總黃酮擴(kuò)散速率減慢，且有效成分被酶水解，這使得分解量高于溶解量，提取量不斷減小。該試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取時(shí)間是2 h。

2.1.4 提取溫度對總黃酮提取量的影響。從圖4可以看出，提取溫度升高時(shí)，總黃酮提取量明顯增加，在70 ℃時(shí)總黃酮提取量達(dá)到最高（7.66 mg/g），此后突然降低，這是因?yàn)辄S酮化合物只能存在于溫度較低的環(huán)境中，溫度過高造成其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使吸光度減小，提取量降低^［28］。孟永海等^［29］研究發(fā)現(xiàn)溫度升高會(huì)使總黃酮分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，其與顯色劑絡(luò)合的活性受到影響，同時(shí)高溫環(huán)境不利于溶液體系的穩(wěn)定，在低溫中提取總黃酮是最優(yōu)的選擇。綜上，該試驗(yàn)確定最佳提取溫度為70 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken Design原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。分析表2得出響應(yīng)回歸模型的多元二次關(guān)系式為Y=10.65-0.14A+0.22B+0.11C+0.02D-7.50×10^-3AB+0.01AC-0.05AD+0.12BC-0.05BD-0.22CD-0.79A2-0.58B2-0.50C2-0.47D2。

由表3可知，該模型具有高度的統(tǒng)計(jì)顯著性（模型的Plt;0.000 1）。失擬項(xiàng)Pgt;0.05，而未知因素對試驗(yàn)的影響較小，殘余誤差則是由于隨機(jī)誤差所致。在方差分析中，B、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，對黃酮類化合物的提取有極顯著的影響，各因素與總黃酮提取量之間有明顯的二次關(guān)系；A、C、CD的P值均小于0.05，對總黃酮提取量影響顯著。除CD外，其他因素兩兩交互對總黃酮提取量的影響不顯著。R2=0.946 5，模型與試驗(yàn)符合程度高。從模型分析得到，各因素對總黃酮提取量的影響程度為B（乙醇濃度）﹥A（提取溫度）﹥C（料液比）﹥D（提取時(shí)間）。

利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制4個(gè)因素兩兩相互作用形成的三維響應(yīng)面曲線，如圖5所示。從圖5可以看出，提取時(shí)間和料液比的曲面圖非常陡峭，說明提取時(shí)間和料液比對總黃酮提取量的影響顯著。其他因素兩兩交互對總黃酮提取量的影響不顯著。

響應(yīng)面優(yōu)化分析得到人參果總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶29.6、乙醇濃度59.2%、提取時(shí)間1.97 h、提取溫度70 ℃，預(yù)測總黃酮最大提取量為10.646 mg/g。調(diào)整此工藝參數(shù)為料液比1∶30、乙醇濃度60%、提取時(shí)間2 h、提取

溫度70 ℃，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)提取3次，得到總黃酮提取

量為10.543 mg/g，相對偏差0.967%。此工藝參數(shù)可靠，具有一定指導(dǎo)意義。

2.3 抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 DPPH自由基清除能力。VC常在抗氧化試驗(yàn)中作為陽性對照。相關(guān)研究表明VC對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的清除率在0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，清除率分別達(dá)到96.83%、99.80%、86.73%^［30］。DPPH能夠與總黃酮提供的質(zhì)子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致自身含量減少。從圖6可以看出，總黃酮提取液濃度越高，其反應(yīng)效果越好。總黃酮提取液和VC對DPPH自由基的IC50分別為86.68、139.53 mg/mL。結(jié)果表明，總黃酮提取液對DPPH自由基的清除作用優(yōu)于VC。

2.3.2 羥自由基清除能力。從圖7可以看出，總黃酮提取液濃度與羥自由基的清除率有顯著相關(guān)性。總黃酮提取液和VC對羥自由基的IC50分別為68.08、45.62 mg/mL。結(jié)果表明，總黃酮提取液對羥自由基的清除作用比VC弱。

3 結(jié)論與討論

此前國內(nèi)有少量針對人參果總黃酮提取的研究，如任雪峰等^［31］采用超聲波輔助提取法，得到最佳工藝為超聲波時(shí)間20 min、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度50 ℃，提取量達(dá)到12.071 mg/g。該試驗(yàn)中使用65%乙醇溶液作為萃取劑，沒有設(shè)置梯度試驗(yàn)加以驗(yàn)證乙醇濃度對提取試驗(yàn)的影響。王順新等^［19］研究發(fā)現(xiàn)人參果總黃酮提取率達(dá)到1.39%，較好地優(yōu)化了總黃酮提取的工藝參數(shù)，但缺少抗氧化活性相關(guān)的研究。

該試驗(yàn)結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了人參果總黃酮的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶30、乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h，總黃酮提取量可達(dá)10.543 mg/g。試驗(yàn)表明，該方法的響應(yīng)面模型判定系數(shù)（R2）為0.946 5，結(jié)果與模型預(yù)測一致。人參果總黃酮提取液對DPPH自由基和羥自由基均有較好的清除作用，IC50分別為86.68、68.08 mg/mL。

該試驗(yàn)中采用常規(guī)溶劑提取法提取人參果總黃酮，實(shí)際結(jié)果雖然略低于王順新等^［19］（1.39%）、任雪峰等^［31］（12.071 mg/g）的研究，考慮到該試驗(yàn)沒有使用超聲波輔助，結(jié)果卻接近超聲輔助提取的數(shù)據(jù)，為常規(guī)溶劑提取法提供了參考。而且該試驗(yàn)補(bǔ)充了人參果總黃酮提取液體外抗氧化研究，為人參果開發(fā)利用提供了思路。同時(shí)該試驗(yàn)仍存在很多未解決的問題，例如僅得到粗黃酮提取液，能夠抗氧化的成分較為復(fù)雜，不確定自由基清除的結(jié)果是否完全由黃酮物質(zhì)造成，還需要進(jìn)行更多的結(jié)構(gòu)鑒定、分離純化等試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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