貢柑和沃柑E3泛素連接酶U-box基因的克隆

摘要 為了研究貢柑和沃柑無籽形成的分子機理，選取了貢柑和沃柑作為研究對象，成功克隆了它們的E3泛素連接酶U-box基因。通過測序結果分析，發現貢柑和沃柑的U-box基因存在15個核苷酸差異，導致貢柑中有4個氨基酸發生了改變。通過序列比對，發現沃柑和無籽沙糖橘的E3泛素連接酶U-box基因相似度為98.19%，貢柑和無籽沙糖橘的E3泛素連接酶U-box基因相似度為97.72%，而沃柑和貢柑的E3泛素連接酶U-box基因相似度高達99.47%。

關鍵詞 貢柑；沃柑；E3泛素連接酶U-box

中圖分類號 S666" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0101-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.020

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning of E3 Ubiquitin Ligase U box Gene in Citrus reticulata cv.Gonggan and Orah mandarin

WU Shao ping1，QIN Fei2，LIAO Jin yan1 et al

（1.School of Life Sciences，Zhaoqing University，Zhaoqing，Guangdong 526061;2.Fruit Tree Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510610）

Abstract In order to study the molecular mechanism of seedless formation in Citrus reticulata cv.Gonggan and" Orah mandarin，Citrus reticulata cv.Gonggan and" Orah mandarin were selected as research objects，and their E3 ubiquitin ligase U box genes were successfully cloned.After analyzing the sequencing results，it was found that there were 15 nucleotide differences in the U box genes of Citrus reticulata cv.Gonggan and" Orah mandarin，resulting in changes in 4 amino acids in Citrus reticulata cv.Gonggan.Through sequence alignment，it was found that the similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between" Orah mandarin and Citrus reticulata ‘Wuzishatangju’ was 98.19%，while the similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between Citrus reticulata cv.Gonggan and Citrus reticulata ‘Wuzishatangju’ was 97.72%.The similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between" Orah mandarin and Citrus reticulata cv.Gonggan was as high as 99.47%.

Key words Citrus reticulata cv.Gonggan;Orah mandarin;E3 ubiquitin ligase U box

基金項目 國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202310580011）；肇慶市科技創新指導類項目（2023040308015）。

作者簡介 吳少平（1981—），男，湖北蘄春人，講師，博士，從事植物分子遺傳育種研究。

收稿日期 2024-03-21

泛素化系統是細胞內一種特殊酶的體系，能將泛素連接到靶蛋白質上，在植物的生長和發育中扮演著多種調控角色^［1］。這些特殊酶包括泛素激活酶、結合酶、連接酶和降解酶，其中E3泛素連接酶在泛素化過程中起著關鍵的識別靶蛋白質的作用。根據共價鍵連接方式，E3泛素連接酶可以分為U-box蛋白家族、HECT結構域和RING結構域^［2］。U-box結構域是由70余個氨基酸殘基組成的植物特有的高度保守的功能結構^［3-4］。有研究表明，植物的E3泛素連接酶U-box基因在植物生長發育、應對生物和非生物脅迫等過程中扮演著重要的調控作用^［5］。

花粉萌發是植物進行有性生殖的重要過程，花粉的正常發育直接影響雄性特性，如育性和自交親和性等。據報道，植物的泛素化系統參與調控花粉的發育^［1］。AtPUB4是一種U-box型E3泛素連接酶，其突變體所產生的植株花粉粒會被吸附在未完全分解的絨氈層中，導致難以正常從開裂的花藥中釋放，從而導致植株發生不育。這表明U-box型E3泛素連接酶在調控植物的花粉發育過程中起著重要作用，進而影響植物的繁殖生長^［6-7］。邵麟惠等^［8］通過對苜蓿進行研究，成功克隆了苜蓿的U-box基因（MtPUB4），結果表明，MtPUB4基因可能在苜蓿的生長發育和抗逆性中發揮關鍵的調節作用。在大豆中，宮宇等^［5］克隆了E3泛素連接酶基因GmPUBl，轉基因擬南芥株系中高表達GmPUBl基因的千粒質量顯著提高，但種子萌發率下降，這說明GmPUBl基因在調控種子繁殖發育過程中起著重要作用。另一方面，葛城成等^［9］研究發現了水稻中編碼的U-box型E3泛素連接酶基因OsPUB67參與調控水稻對非生物脅迫的應對。同時，唐文武等^［10］克隆了無籽沙糖橘的E3泛素連接酶U-box（CrU-box）基因，其基因表達分析結果顯示CrU-box基因在沙糖橘子房中表達量最高，綜合分析表明，沙糖橘無籽形成的原因可能是由于CrU-box基因突變以及自交授粉后的高表達。目前，在柑橘中關于U-box型E3泛素連接酶的鑒定和功能研究較為缺乏。筆者基于已有的研究基礎，利用貢柑和沃柑作為材料，成功克隆出U-box基因，并探究其功能，旨在為進一步培育無籽貢柑和沃柑提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取貢柑和沃柑植株的葉片提取總RNA，貢柑和沃柑植株取自肇慶學院生物園（圖1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成。

總RNA提取按照Vazyme公司的FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（RC411）試劑盒的操作步驟進行，通過紫外分光光度儀檢測RNA濃度，并使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以評估RNA的質量。cDNA的第一鏈合成根據TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Code No.RR047A）試劑盒的說明書操作步驟進行。

1.2.2 CrU-box基因克隆。

參考甜橙基因組（http：//citrus.hzau.edu.cn）上Cs6g21870的U-box序列，設計引物Cs6g21870-F/R用于擴增貢柑和沃柑的U-box基因cDNA。PCR擴增反應體系總體積為50 μL，包括25 μL Phanta Max Master Mix（Dye Plus，Vazyme公司）、各2 μL Cs6g21870-F/R引物、500 ng cDNA模板，最后添加去離子水至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；34個循環，包括95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min；終止4 ℃恒溫。隨后，利用TIANGEN公司生產的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（增強型，DP219）回收PCR產物，并連接到克隆載體pClone007 Versatile Simple Vector Kit（擎科生物）中。轉化至大腸桿菌感受態DH5α（擎科生物），最終將驗證過的陽性單克隆送至擎科生物公司進行測序（表1）。

2 結果與分析

2.1 CrU-box基因克隆

提取貢柑和沃柑葉片的總RNA后，測得其OD260/OD280比值均在1.8～2.1，表明RNA受到的蛋白污染較少，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰，說明DNA污染程度低（圖2）。使用Cs6g21870-F/R引物擴增貢柑和沃柑的cDNA，結果如圖3所示，產物條帶單一，大小均在約3 000 bp。

2.2 貢柑和沃柑U-box基因序列分析

將貢柑和沃柑的cDNA擴增產物回收后連接到克隆載體上進行測序，DNA測序結果和蛋白質序列見圖4和圖5。據分析，貢柑和沃柑的U-box基因的開放閱讀框（ORF）長度為31 50 bp，可以預測編碼1 049個氨基酸的蛋白質。在ORF區域，貢柑和沃柑存在15個堿基對的差異，分別為第652、1 124、1 315和1 664位的T變為C，以及689、698、1 357、1 433、1 601、1 628和2 909位的G變為A，843和848位的T變為G，1 124和1 949位的A變為G，這些改變導致氨基酸發生變化。具體來說，第281位的纈氨酸變為甘氨酸，第282位的絲氨酸變為精氨酸，第438位的纈氨酸變為丙氨酸，第452位的精氨酸變為谷氨酰胺（圖5）。

3 討論與結論

U-box基因家族具備U-box結構域，編碼的蛋白質大多數是泛素系統中負責底物識別的關鍵酶，即E3泛素連接酶。幾乎所有植物體內都含有相當數量的U-box蛋白，如柑橘中已經報道存在56個U-box基因成員^［11］，擬南芥包含64個U-box基因^［12］，苜蓿鑒定出41個U-box基因^［13］，番茄有56個^［14］，水稻中共有77個^［15］，雷蒙德氏棉中則發現了93個GrPUBs基因家族成員^［16］。這些數據表明，不同植物中的U-box家族成員數量存在顯著差異。

研究表明，柑橘中的U-box蛋白質為31.97～160.62 kD，等電點（PI）范圍則在5.19～9.14。柑橘的U-box基因家族中，每個成員編碼的蛋白質在大小和PI等特征上存在差異，除了含有U-box結構域外，U-box蛋白還具備TPR、WD40和ARM等次級結構域，這些結構域主要用于特異性識別U-box蛋白與底物蛋白之間的相互作用^［11］。文獻報道指出，U-box蛋白在植物生長發育中扮演著重要的調控作用，參與植物生長發育的不同階段，包括根系的發育及生殖器官的成長等。植物具有自交不親和性，是一種維持后代的機制，在植物進化過程中促使植物進行異花授粉，避免自花授粉，從而保持植物群體的多樣性，避免種族的退化^［17］。長期進化過程中，這種機制可以提高植物的遺傳多樣性，導致可育的雌雄同花植物在自花授粉后無法結實，表現為不育表型^［18］。目前，貢柑和沃柑因其高產、穩產、易剝皮、果肉清甜爽口的品質而備受消費者喜愛，然而大多數商品性好的品種都含有種子，即使是無籽貢柑也并非完全不含種子，只是單個果實的種子數量較少。因此，培育無籽性成為柑橘品種改良的重要目標，而自交不親和特性則是導致柑橘無籽果實形成的關鍵因素。

目前，我國柑橘育種方面存在一些挑戰，柑橘品種的選育通常采用有性雜交、實生選育、芽變選育、誘變育種等傳統方法進行品種改良。然而，這些育種方法周期長，目標性狀難以穩定遺傳，給育種工作帶來挑戰。相比之下，基因工程技術能夠通過特異改造基因組，以達到品種改良的目的。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的廣泛應用，有望實現對柑橘進行有針對性的基因編輯，為柑橘育種帶來新的可能性^［19］。在該研究中，筆者成功在貢柑和沃柑中克隆了沙糖橘的U-box基因。U-box基因在貢柑和沃柑中的作用，其是否參與了自交不親和反應的過程，以及其在這一過程中的分子機理，仍需要進行進一步研究。結合CRISPR/Cas9基因編輯技術，希望為培育無籽的貢柑和沃柑新品種提供理論支持和實踐指導。

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