不同抗氧化劑和吸附劑對褐苞薯蕷組培褐化的影響

摘要 以“安砂小葉薯”組培苗為試驗材料，研究4種抗氧化劑（檸檬酸、抗壞血酸、植酸、硝酸銀）和2種吸附劑［活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）］在褐苞薯蕷組培繼代培養過程中的抗褐化效果及其對增殖和生長的影響。結果表明，4種抗氧化劑均不適合用作抗褐化劑，2種吸附劑中，PVP 0.2" g/L抗褐化效果最佳，褐化指數降低，有效芽率提高。活性炭對降低褐化指數效果不顯著，但可以減輕褐化危害，促進生長，提高有效芽率。

關鍵詞 褐苞薯蕷；組織培養；褐化；抗褐化劑

中圖分類號 S632.1" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0025-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Different Antioxidants and Sorbents on Tissue Browning of Dioscorea persimilis

LI Li hong，HUA" Shu mei，CHEN" Zhi hua et al

（Sanming Academy of Agricultural Sciences /Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountain Area， Sanming， Fujian" 365051）

Abstract The tissue cultured seedlings of Dioscorea persimilis cv.AnSha was used as experimental material to study the effects of four antioxidants （citric acid， ascorbic acid， phytic acid，silver nitrate） and two adsorbents （activated carbon （AC），Polyvinylpyrrolidone acid （PVP）） on anti browning，growth and multiplication of subculture propagators in tissue culture.The results showed that four antioxidants were not suitable for use as anti browning agents. The optimum dosage of PVP was 0.2" g/L" in the two treatments of adsorbents， the explants browning index were significantly decreased and the effective germination rate were increased.The activated carbon had no significant effect on decreasing browning index， but it mitigated the harm of browning， promoted the growth and effective rate of bud.

Key words Dioscorea persimilis；Tissue culture；Browning；Browning inhibitors

基金項目 三明市科技計劃項目（2021-N-9）。

作者簡介 李麗紅（1980—），女，河南焦作人，副研究員，碩士，從事植物組織培養技術研究。

收稿日期 2024-03-11

褐苞薯蕷在南方各地俗稱“薯仔”“小薯”等，在福建、廣西、海南等地被作為山藥的地區習用品，藥用與食用由來已久。山藥為營養繁殖，長期營養繁殖，許多優良品種出現病害加重、產量降低、品質下降現象。生產上一般采用零余子繁殖的方式提純復壯山藥品種，但褐苞薯蕷具有不結實零余子的特性，無法通過這種方式達到復壯的目的。筆者所在課題組前期研究結果表明，通過植物組織培養的方法可以達到提純復壯褐苞薯蕷種薯的效果^［1］，但由于褐苞薯蕷在組培過程中容易褐化，有效增殖效率低。因此，如何減輕褐化危害，提高有效增殖率是一項迫切需要解決的技術。

褐化又稱褐變，是由于植物材料在組織培養過程中受到傷害，體內分泌的酚類物質在酚氧化酶作用下被氧化成褐色的醌類物質^［2］，而醌類物質對植物材料產生毒害作用，影響其生長和分化，嚴重時導致組織死亡。目前科研工作者對不同類型山藥組培的研究較多^［3-7］，但有關其褐化原因及如何控制褐化的研究較少，在防褐化劑試驗中前人研究了山藥不同外植體褐化情況以及幾種某一濃度的防褐劑對

褐化率的影響，未見對增殖和生長的影響，而最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長^［8］。且在前期研究中筆者發現，褐苞薯蕷比薯蕷、參薯、山薯等其他山藥類型組培褐化危害問題更嚴重，組培過程中易出現因褐化造成新芽生長停滯甚至死亡的現象。因此，筆者通過在培養基中添加不同濃度的抗褐化劑，統計其褐化指數、增殖系數、有效芽率，并記錄生長情況，篩選出既能較好地控制組培苗褐化，又不影響其生長的抗褐化劑及適宜濃度，減輕褐化危害，為實現褐苞薯蕷組培苗規模化生產以及組培復壯技術的推廣應用提供理論依據和技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年在三明市農業科學研究院種苗繁育中心進行，供試山藥品種為福建地方優良品種“安砂小葉薯”，以安砂小葉薯繼代培養1年的組培苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

選取生長健壯、長勢一致的不定芽接種到MS+KT 1.0" mg/L+6-BA 0.3" mg/L +NAA 0.05 mg/L+蔗糖30" g/L+瓊脂5.5 g/L的繼代培養基上，培養基中分別添加不同濃度的4種抗氧化劑（檸檬酸、植酸、抗壞血酸、硝酸銀）和2種吸附劑（活性炭、PVP），具體使用濃度見表1，以不添加任何抗褐化劑的處理為對照。抗壞血酸和硝酸銀采用過濾滅菌法加入培養基以防止其受熱分解，其他防褐劑直接加入培養基中進行高壓滅菌。培養基的pH均調至5.8，培養條件為溫度（25±2）℃，光照時數14 h/d，光照強度2 000～2 500 lx。每處理接種3瓶，每瓶接種10 株，重復3次。

根據材料周圍培養基褐化顏色和褐化半徑（褐色物質的溢出半徑），將褐化程度分為6級，分別用0、1、2 、3 、4、5表示。0級，無褐化，培養基半透明狀；1級，切口褐色，周圍培養基仍半透明；2級，切口有淡褐色物質滲出，材料周圍直徑0.5 cm范圍內淺褐色，輕度褐化;3級，褐化加重，材料周圍培養基呈現褐色或直徑大于0.5 cm小于1.0 cm范圍淺褐色;4級，嚴重褐化，材料周圍培養基呈黑褐色或者褐色直徑達1.0 cm以上;5級，材料褐化死亡。褐化指數計算公式：褐化指數=∑（褐化級別×該級別的株數）/（調查總株數×5）×100％，增殖系數=增殖培養后瓶內總芽數/接種時的總芽數，有效芽率=有效芽數/增殖后瓶內總芽數×100%，有效芽標準為高度≥2.0 cm，新芽無褐化跡象，葉片舒展。

1.3 數據統計分析 采用Excel 2013、DPS v7.65軟件對試驗數據進行處理和統計分析，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同抗氧化劑對褐苞薯蕷組培苗褐化及生長的影響

2.1.1 不同濃度檸檬酸對褐化指數與生長的影響。

由圖1可知，不同濃度檸檬酸處理在整個培養過程中褐化指數均高于對照，培養21 d時褐化程度基本達到4級，之后趨于平穩。說明添加檸檬酸不僅未抑制褐化作用，反而在前期會加重褐化，加快褐化進程。

從表1可以看出，當檸檬酸為0.1 g/L時，褐苞薯蕷生長基本正常，但增殖系數和有效芽率均顯著低于對照。當檸檬酸濃度為0.5 g/L時，葉色開始變黃，并隨著檸檬酸濃度的增加，對生長和增殖的不良影響越嚴重，有效芽率顯著下降。試驗結束后30 d發現檸檬酸2.0和3.0 g/L的處理植株出現死亡現象，說明對褐苞薯蕷而言，添加檸檬酸非但沒有降低褐化作用，反而會加重褐化，抑制生長，因此檸檬酸不適宜用于控制褐苞薯蕷組培褐化。

2.1.2 不同濃度植酸對褐化指數與生長的影響。

由圖2可知，在轉接后7～21 d，不同濃度植酸處理的褐化指數均高于對照，培養21 d時，0.5和1.0 g/L植酸處理與對照的褐化指數相當，但0.1、1.0、2.0 g/L植酸處理仍高于對照，35 d時對照和各植酸處理褐化指數基本相同，因此植酸對抑制褐苞薯蕷的褐化無作用，反而會加快褐化進程。

由表2可知，當植酸濃度在0.1～1.0 g/L時，增殖系數略有下降但與對照差異未達顯著水平，當植酸用量達2.0 g/L時，增殖系數顯著低于對照，說明高濃度的植酸不利于增殖。加入植酸，植株的葉色黃，生長較差，有效芽率顯著降低，故植酸不能用來抑制褐苞薯蕷組培過程中的褐化。

2.1.3 不同濃度硝酸銀對褐化指數與生長的影響。

由圖3可知，當硝酸銀濃度為1.0 mg/L時，褐化指數與對照相接近外，其他處理均低于對照，說明硝酸銀具有一定抑制褐化的效果。其中50和100 mg/L處理效果較好，褐化指數為52.5%和55.5%，褐化程度多數在三級左右。

從表3可以看出， 1.0～10.0 mg/L硝酸銀對增殖系數和有效芽率無顯著不良影響，但50.0和100.0" mg/L硝酸銀會造成增殖系數和有效芽率顯著降低，因此，低濃度的硝酸銀對增殖和生長影響不大，但高濃度的硝酸銀雖然降低褐化指數的效果較好，但降低增殖系數和有效芽率，因此對褐苞薯蕷而言，硝酸銀也不是合適的抗褐化劑。

2.1.4 不同濃度抗壞血酸對褐化指數與生長的影響。

由圖4可知，7 d時抗壞血酸處理與對照褐化指數相同，隨著培養時間的增加，不同濃度抗壞血酸處理的褐化程度逐漸高于對照，其褐化程度和濃度之間無明顯規律，35 d時，褐化程度與對照基本相同。因此，不同濃度抗壞血酸對抑制褐化均無明顯作用。

從表4可以看出，添加0.1～200.0 mg/L的抗壞血酸對褐苞薯蕷的生長未造成不良影響，但除抗壞血酸0.1" mg/L處理有效芽率和對照差異不顯著外，1.0～200.0 mg/L處理的有效芽率顯著低于對照。因此，抗壞血酸不適宜作為褐苞薯蕷組培的防褐劑。

2.2 不同吸附劑對褐苞薯蕷組培苗褐化及生長的影響

2.2.1 不同濃度PVP對褐化指數與生長的影響。

PVP 是一種酚類物質專用吸附劑，通過氫鍵與酚類物質結合，減少酚類物質的毒害，起到減輕褐化的作用。從圖5可以看出，添加PVP可以顯著降低褐化指數，有效減輕褐化程度，說明PVP具有明顯的抑制褐化的作用，但其抑制褐變的效果隨PVP的濃度增加呈降低趨勢，以0.2～1.0" g/L PVP效果更好。

由表5可知，PVP各處理對增殖系數無顯著影響，但隨著PVP濃度的增加，其有效芽率呈降低趨勢，表現為芽小，生長緩慢，說明高濃度的PVP有一定抑制生長的作用。綜合褐化指數與生長情況，以PVP 0.2 g/L為最佳處理，可以作為褐苞薯蕷的防褐化劑。

2.2.2 不同濃度AC對褐化指數與生長的影響。

AC 具有吸附特性，在試管苗繼代增殖培養過程中，添加0.1和0.5 g/L的活性炭在前期褐化指數與對照相近，但后期褐化指數則會低于對照，說明添加活性炭具有一定減輕褐化的作用（圖6）。由于活性炭用量大于1.0 g/L時，培養基呈現黑色，無法記錄褐化程度，造成數據缺失。

從表6可以看出，添加活性炭作為防褐劑，褐苞薯蕷的增殖系數明顯降低，但有效芽率顯著高于對照，說明活性炭對生長有利，但對增殖不利。原因可能是活性炭具有無選擇吸附性，它在吸附培養基中醌類等有害物質的同時，還吸附生長調節劑對增殖造成影響。因此添加活性炭作為防褐劑時應少量添加或者在添加的同時提高培養基中生長調節劑的濃度。

3 結論與討論

在組織培養過程中，添加抗褐化劑是控制褐化現象發生的常見方法，最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長。研究認為在培養基中加入抗氧化劑可以明顯減少褐變發生^［9］。該研究結果表明，4種抗氧化劑均不適宜用于控制褐苞薯蕷的組培褐化，2種吸附劑PVP和AC則明顯優于抗氧化劑。但在蘭花春劍花梗組織培養研究中，郭翠娥^［10］研究表明，抗氧化劑中抗壞血酸和檸檬酸防褐化效果好，吸附劑PVP和AC的防褐化效果不理想，甚至加劇外植體褐變，與該研究結果相反。說明不同植物對抗氧化劑和吸附劑的反應差別較大。

褐苞薯蕷在轉接后3 d左右材料切口處變褐，7 d左右傷口處開始溢出淡褐色物質，隨時間推移，褐色逐漸加深或不斷擴散至整個培養基。褐苞薯蕷的褐化率在7 d后基本達100%，添加防褐化劑并不能降低褐化率，只能在一定程度上減輕褐化程度。該試驗中檸檬酸非但沒有降低褐化指數，減輕褐化程度的效果，反而會加重褐化，且隨濃度增加對增殖和生長均產生不利影響。植酸會加速褐化進程，添加植酸后，葉色會變黃。在銀杏愈傷組織防褐化研究中，邵菊芳等^［11］也認為植酸無論是抗褐化效果還是對愈傷組織細胞生長都不理想，且隨著濃度的增加，銀杏愈傷組織中其葉綠素含量減小，與該試驗中的現象相吻合，研究結果相一致。但秦衛東等^［12］研究表明，一定范圍內，隨植酸濃度的增大，銀杏愈傷組織的褐變程度減輕，生長量提高，當濃度超過0.1%時，愈傷組織褐變程度略有增加，生長量也有所降低。可見同一種植物，不同品種對同一防褐劑的反應也不同。

該試驗中，硝酸銀對降低褐化指數具有一定作用，并以高濃度的硝酸銀效果最好，但高濃度的硝酸銀會降低增殖系數和有效芽率。原因可能是當硝酸銀濃度高時，Ag+會競爭性地進入葉綠素分子內，改變其結構，使其功能喪失，蛋白質的合成也相應地受到抑制，進而抑制生長^［13］。陳琴芳等^［14］研究表明12～15 mg/L AgNO3可以有效抑制葉片褐化，但不定芽分化率明顯降低，與該研究結果基本一致。試驗中還發現，添加硝酸銀的培養基其褐化物質能較好地向周圍擴散，一定程度上降低了褐化程度，而添加檸檬酸和植酸的培養基，褐化物僅聚集在材料附近，基本不擴散，褐化顏色近乎黑色，故褐化及危害程度更重。抗壞血酸對抑制褐苞薯蕷的褐化無明顯效果，且隨著濃度增加培養時間延長，褐化指數還會高于對照。在紫山藥莖尖和莖段培養過程中，王碧琴等^［5］研究表明添加抗壞血酸沒有抑制褐化的效果，反而對培養基凝固有負作用，與該研究結果基本一致。

蔡建榮^［3］研究表明，150 mg/L PVP能有效抑制“寸金薯”外植體褐化，褐化率最低，效果最好，但未見其對增殖和生長情況的報道。雖然試驗材料不同，但該試驗中PVP對控制褐化也明顯的作用，對增殖系數無影響，但隨著濃度的升高，有效芽率降低，考慮到控制褐化與兼顧生長，PVP的濃度以0.2 g/L最合適。該研究中，活性炭對降低褐化指數具有一定效果，但隨著活性炭使用量的增加，增殖系數會顯著降低，但添加活性炭可有效促進試管苗的生長，提高有效芽率， 因此，添加活性炭有減輕褐化危害、促進生長的作用。在蝴蝶蘭組織培養中防褐化技術研究中劉真華等^［15］、王立婭等^［16］也有同樣的觀點。

添加防褐劑，無論是抗氧化劑還是吸附劑，均會在一定程度上影響培養基的性質和培養物的質量，即使是合適劑量，若長期使用也會產生不良影響，如在枇杷胚性愈傷組織繼代培養中，如果連續多代使用AgNO3，不但會抑制愈傷組織分化，而且愈傷組織褐變也會嚴重^［17］，因此，使用防褐劑

時既要根據植物本身的特點選擇合適類型和濃度的防褐劑，又要把握好使用次數。在使用活性炭控制褐化時，則應注意調整活性炭與生長調節物質等培養基成分的用量，使兩者協同發揮作用。

參考文獻

［1］

李麗紅，華樹妹，陳芝華，等.清流雪薯組培復壯技術［J］.江蘇農業科學，2020，48（19）：151-155.

［2］ 李萍，成仿云，張穎星.防褐劑對牡丹組培褐化發生、組培苗生長和增殖的作用［J］.北京林業大學學報，2008，30（2）：71-76.

［3］ 蔡建榮.山藥組織培養褐化反應的研究［J］.中國農學通報，2008，24（8）：118-120.

［4］ 劉金英，徐有明，李雙來，等.佛手山藥組織培養的研究［J］.植物研究，2006，26（3）：323-328.

［5］ 王碧琴，朱祺，劉騰云，等.紫山藥組織培養及褐化因素的研究［J］.江西科學，2014，32（1）：43-45.

［6］ 張振霞，葉靜鵬，鄭莉，等.廣山藥組織培養技術的研究［J］.江蘇農業科學，2016，44（2）：76-80.

［7］ 黃枝英，許朝輝，周婷，等.淮山組織培養研究進展［J］.安徽農業科學，2018，46（28）：29-31.

［8］ 張艷麗，劉秀賢，王雁，等.滇牡丹愈傷組織繼代培養中的褐化防治［J］.中南林業科技大學學報，2011，31（2）：77-81.

［9］ 曾鐳，劉燕.植物組織培養中褐化問題的研究進展［J］.安徽農學通報，2007，13（14）：49-50，152.

［10］ 郭翠娥.春劍花梗離體培養中褐化的研究［D］.雅安：四川農業大學，2008.

［11］ 邵菊芳，朱紅威，于文峰，等.抗氧化劑和吸附劑促進銀杏愈傷組織生長及防止褐化作用研究［J］.福建林業科技，2009，36（3）：117-120，140.

［12］ 秦衛東，高明俠，呂兆啟.銀杏愈傷組織培養及其黃酮生物合成的初步探討［J］.食品科學，2002，23（11）：38-41.

［13］ 張建民，韓曉弟，劉新寧，等.銀離子處理微藻的生物學效應的研究［J］.煙臺大學學報（自然科學與工程版），2006，19（1）：25-29.

［14］ 陳琴芳，戴良英，鄒學校.草莓高效離體再生體系的研究［J］.湖南農業科學，2004（2）：19-21.

［15］ 劉真華，葛紅，郭紹霞，等.蝴蝶蘭組織培養中的褐化控制研究［J］.園藝學報，2005，32（4）：732-734.

［16］ 王立婭，方正，李英麗，等.蝴蝶蘭組織培養中防褐化技術研究［J］.河北農業大學學報，2008，31（5）：42-45.

［17］ 沈慶斌，賴鐘雄，蔡漢權，等.枇杷幼胚培養與體胚誘導植株再生［J］.江西農業大學學報，2005，27（3）：379-384.