茶樹(shù)ICE基因家族鑒定及CsICE43克隆和低溫表達(dá)分析

摘要：近年來(lái)全球極端低溫天氣頻發(fā)，嚴(yán)重影響了茶樹(shù)的產(chǎn)量和品質(zhì)。ICE（Inducer of CBF expression）基因家族主要參與植物的低溫脅迫響應(yīng)，但在茶樹(shù)領(lǐng)域中的相關(guān)研究還不夠全面。本研究從茶樹(shù)基因組中鑒定出51個(gè)茶樹(shù)CsICEs基因，對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件展開(kāi)生物信息學(xué)分析。茶樹(shù)CsICEs基因的啟動(dòng)子區(qū)域富含光響應(yīng)、植物激素、生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫相關(guān)順式作用元件，其可能參與多種逆境脅迫響應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析和RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫下CsICE43基因的表達(dá)量上升了4.24倍，其可能與茶樹(shù)低溫響應(yīng)相關(guān)。以茶樹(shù)品種‘保靖黃金茶1號(hào)’的cDNA為模板，克隆獲得了CsICE43基因，其在不同組織中的表達(dá)模式存在差異，在頂芽和嫩葉中特異性高表達(dá)。蛋白氨基酸序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，CsICE43基因包含與ICE家族其他成員一致的S-rich、bHLH、ACT等保守結(jié)構(gòu)域，且與毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）的親緣關(guān)系較近。在STRING在線網(wǎng)站中以擬南芥AtICEs為模型，推測(cè)茶樹(shù)CsICE43蛋白與HOS1、MYB15、DREB1/2存在潛在的互作關(guān)系。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明CsICE43定位于細(xì)胞核，與跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CsICE43基因可能與茶樹(shù)低溫響應(yīng)關(guān)聯(lián)，為深入挖掘其基因功能與抗寒分子機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；ICE基因家族；抗寒；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；S435.711" " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " "文章編號(hào)：1000-369X（2025）01-0043-18

Identification of Tea ICE Gene Family and Cloning and Expression Analysis of CsICE43 under Low-temperature

ZHU Qian， SHAO Chenyu， ZHOU Biao， LIU Shuoqian， LIU Zhonghua， TIAN Na*

National Engineering Research Center for the Utilization of Plant Functional Components， Key Laboratory of Tea Science， Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract： In recent years， extreme low-temperature weather has frequently occurred worldwide， significantly affecting the yield and quality of tea plants. The ICE （Inducer of CBF expression） gene family plays a crucial role in the low-temperature stress response of plants. However， research specifically focused on tea plants is still limited. This study identified 51 ICE genes from the tea genome and performed a bioinformatics analysis to examine their physical and chemical properties， gene structure， and promoter cis-acting elements. The promoter regions of the CsICE genes are rich in cis-acting elements related to light response， plant hormones， growth and development， and abiotic stress， suggesting their involvement in various stress responses. Transcriptome analysis and RT-qPCR verification indicate that the expression of the CsICE43 increased 4.24 folds under low-temperature conditions， highlighting its potential role in the low-temperature response of tea plants. To further investigate this， the cDNA of tea cultivar‘Baojing Golden Tea No. 1’ was used as a template to clone the CsICE43 gene. Its expression varied across tissues， with exceptionally high levels observed in terminal buds and young leaves. Further amino acid sequence and phylogenetic tree analysis indicate that the CsICE43 gene contains conserved domains such as S-rich， bHLH， and ACT， which are consistent with other members of the ICE family. It is closely related to Actinidia eriantha. The STRING online database utilized Arabidopsis thaliana AtICEs to hypothesize potential interactions between CsICE proteins and HOS1， MYB15， and DREB1/2. Subcellular localization experiments demonstrate that CsICE43 is located in the nucleus， which is consistent with the findings from the transmembrane structure analysis. In summary， this study suggests that the CsICE43 gene may be associated with the low-temperature response in tea plants， providing a theoretical foundation for further exploration of its gene function and the molecular mechanisms underlying cold resistance.

Keywords： Camellia sinensis， ICE gene family， cold resistance， bioinformatics， expression analysis

茶樹(shù)［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)作物[1]。然而，近年來(lái)全球氣候變化引起了多種極端天氣，特別是低溫，對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[2]。茶樹(shù)春季和越冬期遭受低溫冷害、凍害已經(jīng)成為制約我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題[3]。因此研究茶樹(shù)的抗寒機(jī)理對(duì)提高茶樹(shù)的抗寒性，以及選育茶樹(shù)抗寒性新品種都具有重要意義。

當(dāng)植物面臨低溫脅迫時(shí)，存在于體內(nèi)的大量轉(zhuǎn)錄因子會(huì)激活一系列基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)低溫脅迫的耐受性[4]。目前，研究者已經(jīng)在植物中挖掘到了3個(gè)主要的冷響應(yīng)基因：C-重復(fù)結(jié)合因子（CBFs）、CBF表達(dá)誘導(dǎo)因子（ICE）和冷誘導(dǎo)基因（CORs）。CBF信號(hào)調(diào)控途徑是目前植物對(duì)低溫反應(yīng)機(jī)制中研究最為透徹的途徑，即ICE-CBF-COR轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)。ICE基因?qū)儆诼菪?環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族，含有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域。它位于CBF冷響應(yīng)通路上游，能夠誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，從而提高植物的低溫耐受能力[5]。COR基因是由冷脅迫調(diào)節(jié)的一類(lèi)基因，能在某些特定的條件（低溫、短日照等）下被激活以響應(yīng)多種冷調(diào)節(jié)蛋白，進(jìn)而提高植物對(duì)低溫脅迫的耐受性[6]。COR基因啟動(dòng)子區(qū)域中含有與脅迫相關(guān)的脫水響應(yīng)元件（DRE）[7]和低溫響應(yīng)元件（CRT）[8]。當(dāng)植物感受低溫時(shí)，CBF上游的ICE轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量會(huì)增加，促進(jìn)CBF與COR基因啟動(dòng)子區(qū)的DRE/CRT順式作用元件特異性結(jié)合，激活COR基因的表達(dá)，從而提高植物的抗寒性[9]。Gilmour等[10]和Chinnusamy等[11]的研究表明，常溫條件下ICE并無(wú)表達(dá)，但當(dāng)植物遭遇低溫時(shí)，ICE基因開(kāi)始被活化、被磷酸化修飾或結(jié)合其他蛋白，產(chǎn)生的ICE蛋白可與DREB啟動(dòng)子上的MYC順式元件結(jié)合，啟動(dòng)其表達(dá)，調(diào)控下游RD29A基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的抗寒性。ICE基因在植物抵御低溫脅迫中發(fā)揮著重要的作用。目前已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）[12]和龍眼（Dimocarpus longan）[13]等多個(gè)植物物種中鑒定出ICE基因，研究表明龍眼DlICE1的過(guò)表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性[13]。過(guò)表達(dá)水稻OsICE1同時(shí)提高了擬南芥的耐寒性[14]、耐旱性和光合作用效率[15]。

在茶樹(shù)中，品質(zhì)好、抗性強(qiáng)的茶樹(shù)品種資源是茶葉高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的前提。因此，研究茶樹(shù)CsICEs基因家族如何調(diào)控茶樹(shù)在低溫脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。目前，茶樹(shù)抗寒機(jī)理研究在生理和分子等方面取得了一定進(jìn)展。Li等[16]從茶樹(shù)中分離出一個(gè)新的冷調(diào)節(jié)基因CsCOR1，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)表達(dá)茶樹(shù)CsCOR1明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)CsCBF1蛋白具有與擬南芥RD29A[7]啟動(dòng)子中DRE/CRT順式元件結(jié)合的能力。Ding等[18]發(fā)現(xiàn)在低溫（4、﹣5 ℃）脅迫下CsICE1的表達(dá)量顯著升高。Gilmour等[10]推測(cè)ICE除了可以調(diào)控CBF的轉(zhuǎn)錄，可能還調(diào)控其他與低溫相關(guān)基因的表達(dá)。本研究利用全基因組鑒定方法對(duì)茶樹(shù)CsICEs基因家族進(jìn)行分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR驗(yàn)證，篩選到CsICE43基因。對(duì)其進(jìn)行同源克隆以及生物信息學(xué)分析，為茶樹(shù)ICE基因參與響應(yīng)低溫脅迫提供了理論依據(jù)，旨在為進(jìn)一步分析其在低溫脅迫中的功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

本研究以來(lái)自湖南省茶葉研究所高橋基地（113°08′ E，28°20′ N）的一年生茶樹(shù)幼苗‘保靖黃金茶1號(hào)’為試驗(yàn)材料。將植株放置在通風(fēng)透氣的透明溫室中適應(yīng)生長(zhǎng)1個(gè)月。選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的茶樹(shù)放入低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理（LT，晝夜溫度0 ℃/4 ℃，光照16 h，光照強(qiáng)度10 000 lx，黑暗8 h，3 d）和恢復(fù)常溫（R，25 ℃恢復(fù)3 d），并設(shè)置對(duì)照組（CK，25 ℃，光照16 h，光照強(qiáng)度10 000 lx，黑暗8 h）。分別取CK、LT和R 3組植株的一芽二葉在液氮中冷凍，并在﹣80 ℃下保存以供進(jìn)一步分析。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的茶樹(shù)的不同器官進(jìn)行取樣（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、莖、花、果、根），置于液氮中冷凍后保存于﹣80℃冰箱，用于后續(xù)組織表達(dá)量分析。

1.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析

茶樹(shù)葉片總RNA提取采用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation試劑盒（Vazyme，中國(guó)）。使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液（Agbio，中國(guó)）從總RNA中合成用于RT-qPCR的第一條鏈cDNA。使用BYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒（Agbio，中國(guó)）在QuantStudio 3定量PCR儀（Thermo fisher scientific，USA）進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系總體積20 μL，包含10 μL 2X SYBR Green Pro Tag HS Premix，上、下游引物各0.4 μL，1 μL cDNA模板，RNase free water補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參基因，采用 法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[19]。使用National Center for Biotechnology Information（NCBI）設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.3 茶樹(shù)CsICEs基因家族成員鑒定

茶樹(shù)蛋白質(zhì)序列從TPIA（http：//tpia. teaplants.

cn/index.html）下載，并構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載bHLH結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的隱馬爾可夫模型文件（PF00010），使用TBtools軟件中的本地工具Simple HMM Search在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查找相似序列，設(shè)置E≤1×10-20，獲得候選基因家族成員。擬南芥AtICEs蛋白序列從TAIR（https：//www.arabidopsis.org）下載，并以此為問(wèn)詢(xún)序列，利用NCBI Blast和SMART[20]對(duì)已鑒定的ICE結(jié)構(gòu)特性全面分析，最終獲得茶樹(shù)ICE基因家族成員信息。

1.4 茶樹(shù)CsICEs基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用ExPASy網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)茶樹(shù)CsICEs基因家族蛋白理化性質(zhì)。利用SoftBerry ProtComp 9.0網(wǎng)站（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）預(yù)測(cè)茶樹(shù)CsICEs蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.5 茶樹(shù)CsICEs基因家族結(jié)構(gòu)和順式元件分析

從TPIA下載gff3文件，提取基因信息，在GSDS網(wǎng)站上繪制茶樹(shù)CsICEs基因結(jié)構(gòu)（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）。利用MEME在線網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)CsICEs蛋白序列中的保守基序展開(kāi)分析，利用TBtools軟件分析內(nèi)含子、外顯子、染色體位置信息并可視化繪圖。利用PlantCARE網(wǎng)站對(duì)CsICEs基因家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析，對(duì)其結(jié)果篩選排序后利用Tbtools軟件中Simple Bio Sequence Viewer模塊進(jìn)行可視化。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

前期研究采集了低溫處理（與本研究相同處理參數(shù)）0、2 d和恢復(fù)5 d的茶樹(shù)葉片樣品，送至武漢邁維代謝生物科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。植物樣本采用乙醇沉淀法和CTAB-PBIOZOL進(jìn)行提取后，使用Qubit熒光定量?jī)x和Qsep400高通量生物片段分析儀對(duì)總RNA進(jìn)行鑒定和定量。隨后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)量檢查，合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。數(shù)據(jù)分析使用fastp對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，主要去除帶接頭（adapter）的reads：當(dāng)任一測(cè)序reads中N含量超過(guò)該reads堿基數(shù)的10%時(shí)，去除此paired reads；當(dāng)任一測(cè)序reads中含有的低質(zhì)量（Q≤20）堿基數(shù)超過(guò)該條reads堿基數(shù)的50%時(shí)，去除此paired reads。后續(xù)所有分析均是基于clean reads，獲得有效的clean reads并比對(duì)到參考基因組（http：//tpia.teaplants.cn/download.html）。基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究深入開(kāi)展一系列茶樹(shù)抗寒分析。

1.7 茶樹(shù)CsICE43的跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)分析和互作蛋白分析

采用在線軟件TMHMM Server v. 2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）對(duì)CsICE43的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和Swiss-Model在線網(wǎng)站（http：//www.swissmodel. expasy.org）分別對(duì)茶樹(shù)CsICE43蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。以擬南芥AtICEs蛋白為模型，利用STRING在線網(wǎng)站（https：//string-db.org/cgi）預(yù)測(cè)CsICEs蛋白潛在的互作關(guān)系。

1.8 茶樹(shù)CsICE43氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用Clustal X工具對(duì)茶樹(shù)CsICE43蛋白序列和多個(gè)植物物種的ICE蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，然后用Gene Doc軟件進(jìn)行編輯。采用Clustw 2.0和MEGA 4.0軟件對(duì)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定的多個(gè)ICE-like蛋白的編碼區(qū)全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用鄰接法重復(fù)1 000次。

1.9 亞細(xì)胞定位分析

將CsICE43的全長(zhǎng)編碼序列插入到融合了GFP的載體pEAQ-GFP中，形成pEAQ-CsICE43-GFP構(gòu)建體。將其轉(zhuǎn)入GV3101根癌農(nóng)桿菌中，并將攜帶綠色熒光蛋白的構(gòu)建體的農(nóng)桿菌菌株（菌株的OD600值為0.6～0.8）注射煙草。在25 ℃弱光條件下處理12 h，將其轉(zhuǎn)移至正常光照條件下處理48 h，使用Axio Scope.A1正置式熒光顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國(guó)）檢測(cè)GFP信號(hào)。引物見(jiàn)表1。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0（IBM，美國(guó)）進(jìn)行相關(guān)性分析，Student’t檢驗(yàn)，以及Duncan’多重比較，Plt;0.05表示顯著性。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，3次及以上重復(fù)。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美國(guó)）進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CsICEs基因家族成員鑒定結(jié)果

基于隱馬爾可夫模型及擬南芥AtICEs同源序列比對(duì)，對(duì)茶樹(shù)舒茶早基因組進(jìn)行Blast檢索，并結(jié)合TBtools軟件，共鑒定得到51個(gè)CsICEs家族成員。根據(jù)其染色體位置命名為CsICE1～CsICE51（表2）。CsICEs基因家族成員的蛋白理化性質(zhì)差異較大，其編碼129～741個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量（Mw）在15.02～81.02 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為4.75～10.16。其中理論等電點(diǎn)小于7的ICE數(shù)量超過(guò)一半，說(shuō)明CsICEs大多為酸性蛋白。51個(gè)CsICEs蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.65～92.87，說(shuō)明茶樹(shù)中所有的ICEs較為不穩(wěn)定。CsICEs蛋白的脂肪指數(shù)為53.72～99.28，CsICEs蛋白親水性指數(shù)為﹣0.895～﹣0.278，這說(shuō)明CsICEs均為親水蛋白。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示51個(gè)CsICEs蛋白均定位在細(xì)胞核上，為核蛋白。

2.2 茶樹(shù)CsICEs基因結(jié)構(gòu)分析

為了更好地了解CsICEs基因家族的進(jìn)化和結(jié)構(gòu)多樣性，分別對(duì)茶樹(shù)CsICEs基因家族的保守基序、結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。通過(guò)在線工具M(jìn)EME對(duì)51個(gè)CsICEs家族蛋白保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖1A，圖1B），51個(gè)茶樹(shù)CsICEs總共鑒定到10個(gè)保守基序。根據(jù)同一家族中的保守基序的分布，可以將該家族劃分為兩亞組：第Ⅰ組所有成員的基序數(shù)量為1～3個(gè)，少數(shù)成員只含有基序1；第Ⅱ組成員基序分布較為相似，大部分成員都含有基序1～6和基序10，少數(shù)成員只含有基序1～3和基序6，如CsICE21，而CsICE15、CsICE34只含有基序1、基序2和基序6，CsICE37只含有基序1和基序6。同一亞組中密切相關(guān)的成員具有相對(duì)一致的基序組成，這意味著它們可能具有相似的功能。不同亞族的CsICEs蛋白保守基序有些許差別，這可能與不同亞族之間的功能差異有關(guān)，體現(xiàn)了CsICEs基因的相似性和多樣性。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖1C），各個(gè)成員間外顯子個(gè)數(shù)及基因長(zhǎng)度差異較大。內(nèi)含子相位（Intron phase）表示內(nèi)含子位于密碼子不同堿基后的位置情況，51個(gè)CsICEs成員中只有CsICE44存在phase0、phase1和phase2，少部分成員存在phase0、和phase2，其余含有內(nèi)含子的家族成員內(nèi)含子相位均為phase0。

2.3 茶樹(shù)CsICEs基因家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE對(duì)茶樹(shù)CsICEs基因家族成員基因翻譯起始位點(diǎn)上游2 000 bp啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，茶樹(shù)CsICEs基因家族啟動(dòng)子區(qū)域包含豐富的順式作用元件（圖2）。根據(jù)功能注釋可將這些順式作用元件分為4類(lèi)：（1）光響應(yīng)元件表明CsICEs

基因家族成員可能受光誘導(dǎo)；（2）與脫落酸（Abscisic acid，ABA）、生長(zhǎng)素（Indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（Gibberellins，GA）和茉莉酸甲酯（Methyljasmonate，MeJA）等激素相關(guān)反應(yīng)或調(diào)節(jié)元件，由ABA響應(yīng)（ABRE）、IAA響應(yīng)（AuxRR-core）、GA響應(yīng)（P-box）和MeJA響應(yīng)（CGTCA-motif）等應(yīng)答元件組成，說(shuō)明CsICEs基因家族成員表達(dá)可能受多種植物激素調(diào)控；（3）由響應(yīng)低溫脅迫、干旱及厭氧誘導(dǎo)等非生物脅迫響應(yīng)元件組成，包括低溫反應(yīng)（LTR）、響應(yīng)干旱誘導(dǎo)（MBS）和厭氧誘導(dǎo)反應(yīng)（ARE）等元件，提示CsICEs基因可能參與調(diào)控多種逆境響應(yīng)；（4）與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件，包括胚乳表達(dá)相關(guān)元件和分生組織表達(dá)響應(yīng)元件等。上述結(jié)果表明，CsICEs基因可能參與多種逆境響應(yīng)，并在茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。

2.4 茶樹(shù)低溫轉(zhuǎn)錄組分析與基因篩選

前期研究對(duì)低溫處理下0、2 d和恢復(fù)5 d（R5d）的茶樹(shù)葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率都低于0.5%，符合質(zhì)檢要求（圖3）。GC含量分布分析表明G和C堿基及A和T堿基含量在每個(gè)測(cè)序循環(huán)上均相等，且整個(gè)測(cè)序過(guò)程穩(wěn)定不變（圖4）。但由于隨機(jī)引物擴(kuò)增偏差等原因，測(cè)序得到的每個(gè)read前6～7個(gè)堿基有較大的波動(dòng)，這種波動(dòng)屬于正常情況。同時(shí)，測(cè)序得到的原始測(cè)序序列，含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads。為了保證分析質(zhì)量，必須對(duì)raw reads進(jìn)行過(guò)濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads（圖5）。測(cè)序結(jié)果符合質(zhì)檢要求后，本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組中51個(gè)CsICEs基因表達(dá)量進(jìn)行了聚類(lèi)熱圖分析（圖6A）。結(jié)果將所有CsICEs基因分為了6大類(lèi)，如CsICE5、CsICE11和CsICE43等的共性是在低溫下表達(dá)量顯著上升，在恢復(fù)常溫后降低。而CsICE4、CsICE7和CsICE8等表達(dá)量在低溫下顯著降低。因此，本研究選取了在低溫下表達(dá)量上升的CsICEs基因，在CK組、LT組和R組中進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證（圖6B）。結(jié)果均符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，其中CsICE43的表達(dá)量上升倍數(shù)最高，因此本研究聚焦該基因進(jìn)行下一步的深入探究。

2.5 茶樹(shù)CsICE43基因克隆及RT-qPCR驗(yàn)證

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及RT-qPCR驗(yàn)證分析，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的CsICE43基因（XM_028201366.1）設(shè)計(jì)特異性引物，以‘保靖黃金茶1號(hào)’茶樹(shù)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CsICE43基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到清晰的陽(yáng)性條帶（圖7A）。回收目的條帶并將其與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR驗(yàn)證后送樣測(cè)序，經(jīng)比對(duì)，測(cè)序序列與目標(biāo)序列結(jié)果一致，條帶長(zhǎng)度為576 bp。

為明確ICE基因家族在茶樹(shù)低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，本研究采用RT-qPCR對(duì)CsICE43進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（CK）相比，低溫處理后CsICE43的表達(dá)明顯被誘導(dǎo)，其表達(dá)量顯著上升（圖7B）（Plt;0.001）。

2.6 茶樹(shù)CsICE43基因表達(dá)特性分析

RT-qPCR分析結(jié)果顯示（圖8），CsICE43基因在‘保靖黃金茶1號(hào)’各器官表達(dá)模式上存在差異。CsICE43在頂芽和嫩葉的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他器官，而在花中的相對(duì)表達(dá)量最低，這一發(fā)現(xiàn)表明CsICE43可能在茶樹(shù)的頂芽和嫩葉中發(fā)揮重要作用。與此同時(shí)，低溫脅迫下茶樹(shù)的嫩葉和頂部枝葉比老葉更易受到損傷。因此，可以推測(cè)CsICE43基因在嫩葉中的高度表達(dá)可能與茶樹(shù)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)性密切相關(guān)，特別是在保護(hù)嫩葉免受低溫傷害方面可能起著關(guān)鍵作用。這種基因表達(dá)模式強(qiáng)調(diào)了對(duì)CsICE43在茶樹(shù)抗寒性中作用進(jìn)一步研究的重要性，以期通過(guò)遺傳改良提高茶樹(shù)的耐寒能力。

2.7 茶樹(shù)CsICE43蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

跨膜結(jié)構(gòu)分析表明（圖9），CsICE43蛋白各氨基酸位點(diǎn)處于膜外的概率極接近1，可信度較高。這表明CsICE43蛋白整條多肽鏈位于細(xì)胞膜外，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白。

2.8 茶樹(shù)CsICE43蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CsICE43蛋白包含4種二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其中無(wú)規(guī)則卷曲占61.17%，是最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。其次α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占26.89%、8.71%和3.22%，不存在β-折疊（圖10A）。以匹配度最高的中國(guó)軟毛獼猴桃A0A2R6QG68.1模型為模板建模，得到蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖10B），相似度高達(dá)81.7%，分?jǐn)?shù)較高，說(shuō)明建模結(jié)果可信度較高。且CsICE43蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)多由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，這也與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果相符。

2.9 茶樹(shù)CsICE43蛋白氨基酸序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步研究茶樹(shù)CsICE43蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用DNAMAN將CsICE43蛋白與其他植物物種的ICE蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CsICE43蛋白序列與其他植物蛋白序列高度同源。CsICE43蛋白在N端和C端分別含有1個(gè)保守的富含絲氨酸（S-rich）結(jié)構(gòu)域和ACT-like結(jié)構(gòu)域，以及保守的bHLH和NLS結(jié)構(gòu)域，與ICE家族其他成員一致（圖11A）。使用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果表明，茶樹(shù)CsICE43與毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）親緣關(guān)系最近，與檀香（Santalum album）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖11B）。

2.10 茶樹(shù)CsICE43互作蛋白分析

利用STRING在線網(wǎng)站，以擬南芥AtICEs為參考，進(jìn)行茶樹(shù)CsICE43潛在的互作蛋白預(yù)測(cè)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將二者進(jìn)行對(duì)應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)CsICE43蛋白與擬南芥低溫響應(yīng)基因1編碼蛋白（High expression of osmotically responsive gene 1，HOS1）、MYB15、DREB1/2存在潛在的互作關(guān)系（圖12）。

2.11 茶樹(shù)CsICE43基因的亞細(xì)胞定位分析

為了驗(yàn)證CsICE43基因的亞細(xì)胞定位情況，在煙草中短暫表達(dá)pEAQ-CsICE43-GFP，以pEAQ-GFP作為對(duì)照。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)性對(duì)照中整個(gè)細(xì)胞都能觀察到綠色熒光，而導(dǎo)入pEAQ-CsICE43-GFP融合質(zhì)粒農(nóng)桿菌的煙草只在細(xì)胞核中檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)（圖13），說(shuō)明CsICE43基因定位于細(xì)胞核中，屬于核蛋白。

3 討論

茶樹(shù)作為一種多年生常綠木本植物，對(duì)溫度變化極為敏感，尤其是低溫環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)有著顯著影響[21]。近年來(lái)，“倒春寒”等惡劣氣候頻發(fā)，茶樹(shù)新梢的抗寒能力對(duì)保障春茶產(chǎn)量顯得尤為重要[22]。茶樹(shù)抗寒機(jī)理研究一直是茶樹(shù)研究領(lǐng)域的重要部分。近年來(lái)，隨著茶樹(shù)抗寒分子機(jī)理研究的深入，已成功鑒定和證明了抗寒性受幾個(gè)主效基因控制，其中主要包括ICE1、CBF/DREB基因家族和COR基因家族等[23]。本研究采用全基因組鑒定的方法從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出51個(gè)茶樹(shù)ICEs基因家族成員，它們大多數(shù)為酸性蛋白，且所有蛋白均屬于不穩(wěn)定的親水蛋白（表2）。51個(gè)茶樹(shù)ICEs基因分布在14條染色體上。CsICEs基因家族成員蛋白劃分為2個(gè)亞家族，亞家族成員間保守結(jié)構(gòu)域排列較為相似，與已報(bào)道的研究結(jié)果相一致[24]。研究表明，植物可通過(guò)激活水

楊酸（SA）[25]、脫落酸[26]和茉莉酸[27]信號(hào)聯(lián)級(jí)網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)ICE轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制及發(fā)育進(jìn)程。本研究對(duì)已鑒定出的51個(gè)CsICEs基因的順式元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其主要包括光響應(yīng)元件，ABA、IAA等激素相關(guān)反應(yīng)或調(diào)節(jié)元件，低溫脅迫、干旱及厭氧誘導(dǎo)等非生物脅迫響應(yīng)元件，與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件（圖2）。表明CsICEs基因家族可能參與光響應(yīng)、植物激素以及非生物脅迫應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程。這與Wang等[28]的研究結(jié)果一致。以上這些結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了CsICEs基因挖掘的準(zhǔn)確性，也為揭示CsICEs基因在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗外界脅迫中的作用機(jī)理研究提供理論參考。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及RT-qPCR驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在低溫下表達(dá)量上升的CsICEs基因中，CsICE43基因的相對(duì)表達(dá)量上升倍數(shù)最高（圖3～圖6），從而聚焦到CsICE43基因。CsICE43基因在不同組織中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)其在茶樹(shù)頂芽、嫩葉中的表達(dá)量最高（圖8）。已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)在低溫脅迫下，CsICE基因在葉中的表達(dá)量最高，是根、莖、果中表達(dá)量的4倍。特別是在4 ℃低溫處理下，CsICE基因表達(dá)量顯著增加[29]，這與本研究結(jié)果一致。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下茶樹(shù)的嫩葉和頂部枝葉比老葉更易受到損傷，推測(cè)茶樹(shù)葉片中ICE基因的顯著表達(dá)與茶樹(shù)在低溫脅迫下的響應(yīng)密切相關(guān)[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)CsICE43屬于非跨膜蛋白（圖9），其結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成（圖10）。同時(shí)通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CsICE43蛋白含有典型的bHLH、S-rich、NLS和ACT-like結(jié)構(gòu)域（圖11A），與已報(bào)道的其他雙子葉植物ICE蛋白結(jié)構(gòu)一致[24]。此外，有研究表明[30]，茶樹(shù)CsICE1基因C末端的bHLH結(jié)構(gòu)域和拉鏈區(qū)域?qū)τ诎邢蛳掠位騿?dòng)子具有重要意義。綜上可見(jiàn)，CsICE43蛋白具有符合ICE蛋白的結(jié)構(gòu)特征，表明其可能在茶樹(shù)中作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用，并調(diào)控非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，CsICE43基因與毛花獼猴桃親緣關(guān)系較近（圖11B），同時(shí)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CsICE43定位于細(xì)胞核上（圖13）。這一結(jié)果與尹盈等[29]在茶樹(shù)中的研究結(jié)果一致，證明CsICE43基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。綜上所述，ICE基因在很大程度上參與了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)調(diào)控，是植物抗逆性的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。

本研究首先對(duì)誘導(dǎo)茶樹(shù)耐寒性的ICE基因家族進(jìn)行了蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)以及順式作用元件分析，揭示了CsICEs基因家族成員在響應(yīng)低溫脅迫及其他逆境中的潛在作用，以及在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及RT-qPCR分析驗(yàn)證，篩選到CsICE43基因，并對(duì)其進(jìn)行組織表達(dá)特異性、蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以及互作蛋白預(yù)測(cè)等分析，進(jìn)一步證實(shí)了ICE基因參與植物對(duì)低溫脅迫響應(yīng)的調(diào)控。同時(shí)通過(guò)亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CsICE43基因定位于細(xì)胞核中，為進(jìn)一步探究該基因在低溫脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉春方， 劉文艷， 滕瑞敏， 等. 茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子CsbHLH137基因鑒定及光合特性與生物鐘響應(yīng)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2022， 42（2）： 210-220.

Liu C F， Liu W Y， Teng R M， et al. Identification and Response of the CsbHLH137 transcription factor gene to photosynthetic characteristics and circadian clock in Camellia sinensis [J]. Journal of Northwest Botany， 2022， 42（2）： 210-220.

[2] Thomashow M F. Plant cold acclimation： freezing tolerance genes and regulatory mechanisms [J]. Annual Review of Plant Biology， 1999， 50（1）： 571-599.

[3] Ban Q Y， Wang X W， Pan C， et al. Comparative analysis of the response and gene regulation in cold resistant and susceptible tea plants [J]. PLoS One， 2017， 12（12）： e0188514. doi： 10.1371/journal.pone.0188514.

[4] Fowler S， Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway [J]. The Plant Cell， 2002， 14（8）： 1675-1690.

[5] Hwarari D， Guan Y L， Ahmad B， et al. ICE-CBF-COR signaling cascade and its regulation in plants responding to cold stress [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（3）： 1549. doi： 10.3390/ijms23031549.

[6] Guo X Y， Liu D F， Chong K. Cold signaling in plants： insights into mechanisms and regulation [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2018， 60（9）： 745-756.

[7] Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K. A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought， low-temperature， or high-salt stress [J]. The Plant Cell， 1994， 6（2）： 251-264.

[8] Baker S S， Wilhelm K S， Thomashow M F. The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-， drought-and ABA-regulated gene expression [J]. Plant Molecular Biology， 1994， 24： 701-713.

[9] Hao X Y， Wang L， Zeng J M， et al. Response and adaptation mechanisms of tea plant to low-temperature stress [J]. Stress Physiology of Tea in the Face of Climate Change， 2018： 39-61. doi： 10.1007/978-981-13-2140-53.

[10] Gilmour S J， Zarka D G， Stockinger E J， et al. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression [J]. The Plant Journal， 1998， 16（4）： 433-442.

[11] Chinnusamy V， Ohta M， Kanrar S， et al. ICE1： a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis [J]. Genes amp; Development， 2003， 17（8）： 1043-1054.

[12] Dubouzet J G， Sakuma Y， Ito Y， et al. OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought-， high-salt-and cold-responsive gene expression [J]. The Plant Journal， 2003， 33（4）： 751-763.

[13] Yang X， Wang R， Hu Q， et al. DlICE1， a stress-responsive gene from Dimocarpus longan， enhances cold tolerance in transgenic Arabidopsis [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2019， 142： 490-499.

[14] Deng C， Ye H， Fan M， et al. The rice transcription factors OsICE confer enhanced cold tolerance in transgenic Arabidopsis [J]. Plant Signaling amp; Behavior， 2017， 12（5）： e1316442. doi： 10.1080/15592324.2017.1316442.

[15] Chander S， Almeida D M， Serra T S， et al. OsICE1 transcription factor improves photosynthetic performance and reduces grain losses in rice plants subjected to drought [J]. Environmental and Experimental Botany， 2018， 150： 88-98.

[16] Li X W， Feng Z G， Yang H M， et al. A novel cold-regulated gene from Camellia sinensis， CsCOR1， enhances salt-and dehydration-tolerance in tobacco [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2010， 394（2）： 354-359.

[17] Wang Y， Jiang C J， Li Y Y， et al. CsICE1 and CsCBF1： two transcription factors involved in cold responses in Camellia sinensis [J]. Plant Cell Reports， 2012， 31： 27-34.

[18] Ding Z T， Li C， Shi H， et al. Pattern of CsICE1 expression under cold or drought treatment and functional verification through analysis of transgenic Arabidopsis [J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（3）： 11259-11270.

[19] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the" method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[20] Letunic I， Doerks T， Bork P. SMART 7： recent updates to the protein domain annotation resource [J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（D1）： D302-D305.

[21] Li N N， Yue C， Cao H L， et al. Transcriptome sequencing dissection of the mechanisms underlying differential cold sensitivity in young and mature leaves of the tea plant （Camellia sinensis） [J]. Journal of Plant Physiology， 2018， 224： 144-155.

[22] 李葉云， 舒錫婷， 周月琴， 等. 自然越冬過(guò)程中3個(gè)茶樹(shù)品種的生理特性變化及抗寒性評(píng)價(jià)[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2014， 23（3）： 52-58.

Li Y Y， Shu X T， Zhou Y Q， et al. Change in physiological characteristics and cold resistance evaluation of three cultivars of Camellia sinensis during natural overwintering period [J]. Journal of Plant Resources and Environment， 2014， 23（3）： 52-58.

[23] 田一粟， 姜明， 張啟宇. 植物抗寒基因及ICE-CBF-COR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程， 2023， 13（5）： 131-137.

Tian Y S， Jiang M， Zhang Q Y. Progress on cold resistance genes and ICE-CBF-COR signaling in plants [J]. Agricultural Engineering， 2023， 13（5）： 131-137.

[24] Chinnusamy V， Zhu J， Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants [J]. Trends in Plant Science， 2007， 12（10）： 444-451.

[25] Li S Q， He L， Yang Y P， et al. INDUCER OF CBF EXPRESSION 1 promotes cold-enhanced immunity by directly activating salicylic acid signaling [J]. The Plant Cell， 2024， 36（7）： 2587-2606.

[26] An J P， Xu R R， Liu X， et al. Abscisic acid insensitive 4 interacts with ICE1 and JAZ proteins to regulate ABA signaling-mediated cold tolerance in apple [J]. Journal of Experimental Botany， 2022， 73（3）： 980-997.

[27] Hu Y， Jiang L， Wang F， et al. Jasmonate regulates the inducer of CBF expression-c-repeat binding factor/DRE binding factor1 cascade and freezing tolerance in Arabidopsis [J]. The Plant Cell， 2013， 25（8）： 2907-2924.

[28] Wang B， Liu Q， Xu W， et al. Genome-wide identification of MsICE gene family in medicago sativa and expression analysis of the response to abiotic stress [J]. Agronomy， 2024， 14（9）： 2064. doi： 10.3390/agronomy14092064.

[29] 尹盈， 張玥， 胡靖妍， 等. 茶樹(shù)低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子CsICE的亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（10）： 1961-1969.

Yin Y， Zhang Y， Hu J Y， et al. Subcellular localization and expression analysis of CsICE transcriptionb factor related to cold stress in tea plant [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2013， 40（10）： 1961-1969.

[30] Zhu X J， Zhao X， Ren T Y， et al. CsICE1 functions in cold tolerance by regulating polyamine levels may through interacting with arginine decarboxylase in the tea tree [J]. Agriculture， 2020， 10（6）： 201. doi： 10.3390/agriculture10060201.