圓齒野鴉椿CLE多肽的系統鑒定及功能分析

摘 要 采用生物信息學的方法，鑒定和分析了圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）CLE基因家族組成及其表達調控作用機制。結果：從圓齒野鴉椿中共鑒定出15個CLE基因，分布在圓齒野鴉椿的6條染色體上，其編碼的前體肽大小介于94～920 aa，蛋白質相對分子質量介于10 705.66～101 725.48 KD，理論等電點介于5.84～12.01。多序列比對和偏好性分析表明，圓齒野鴉椿CLE與擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]CLE的同源多肽較為一致，但是部分圓齒野鴉椿CLE在第9位氨基酸上表現出了對絲氨酸的偏好性。系統進化分析表明，圓齒野鴉椿CLE基因成員分為6大亞家族，分別為Group1（0個）、Group2（0個）、Group3（CLE1、CLE2）、Group4（CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15）、Group5（CLE11、CLE12）、Group6（CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7）亞組。功能分析發現，CLE3、CLE4在根部維管束組織中表達，影響根的初生木質部發育，CLE9、CLE10、CLE8、CLE13、CLE14、CLE15在根部韌皮部中表達，可以通過間接或直接相互作用，引導根的初生韌皮部細胞從分裂向分化轉化。

關鍵詞 圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）；CLE多肽；系統進化；功能分析

中圖分類號：Q789 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.001

CLE（CLAVATA3/Embryo surrounding region-related）多肽是一種非常重要的植物生長調節劑，它在植物生長發育過程中，與細胞間的信號傳遞有關[1]，在分生組織細胞分裂和分化的維持中發揮著非常關鍵的信號轉導調節作用[2]。圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）屬于省沽油科（Staphylea）野鴉椿屬（Euscaphis），為落葉小喬木或灌木。圓齒野鴉椿除了具有觀賞價值外，還是功效極為出色的藥材，其根起到清熱解毒、祛濕的作用[3]。關于CLE多肽研究發現，鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中存在17個CLE基因[4]，楊樹（Populus L.）中具有50個CLE基因[5]，番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中含有15個CLE基因[6]。吳云飛等研究發現CLE多肽也調控維管組織分化與增殖的平衡，CLE40能促進干細胞的分化，對維持根頂端分生組織干細胞的動態平衡起著重要作用[7]。TDIF（Tracheary element differentiation inhibitory factor）是一種由百日草（Zinnia elegans Jacq.）和其他植物產生的小分子肽類信號物質，在植物導管形成過程中具有重要作用。李曉旭研究發現百日草TDIF氨基酸序列與擬南芥CLE41/CLE44序列完全相同，TDIF/CLE41/CLE44類信號物質是調控植物導管分化和組織發生的關鍵分子[8]。有研究表明，在擬南芥中，過表達CLE41/CLE44會導致原形成層細胞消耗，并造成導管斷裂，因此TDIF/CLE41/CLE44的作用是可以促進原形成層增殖，并對原形成層分化為導管進行抑制[9-11]。李天笑等提出PgCLE9、PgCLE14、PgCLE16等基因對人參不定根分支數有抑制作用，而PgCLE5通過促進不定根的分支來增加不定根的分支數[12]。同時，在擬南芥的初生根系統中，這些成員都能夠顯著抑制主根和側根的生長。目前關于圓齒野鴉椿的分子研究集中在果色形成機制上[13]，對圓齒野鴉椿根生長發育的分子研究較少。本研究通過對圓齒野鴉椿CLE多肽功能分析及鑒定，進一步挖掘圓齒野鴉椿中的功能多肽及其信號轉導在根生長發育中的功能，為圓齒野鴉椿初生根調控提供一定的理論支撐。

1 "材料與方法

1.1 "圓齒野鴉椿CLE基因的查找

在獲得圓齒野鴉椿基因組數據的基礎上[14]，以模式植物擬南芥[15]作為參考，鑒定圓齒野鴉椿CLE多肽基因。在TAIR10數據庫（https：//www.Arabidopsis.org/）中以“CLAVATA3”作關鍵詞搜索[16]，獲取擬南芥的CLE多肽蛋白序列，利用ATCLE的peptide sequence，進行BLASTP檢索，E值≤10-10的基因作為候選基因。同以上方法，再用候選基因的peptide sequence進行二次查找。

1.2 "圓齒野鴉椿CLE基序圖譜的繪制

把圓齒野鴉椿CLE多肽序列和擬南芥CLE多肽序列合成一個文檔，以fasta格式，打開方式選擇MEGA7.0軟件，點擊“Align selected with MUSCLE”，再點擊“Align Protein”，進行多序列比對，根據已經報道的擬南芥CLE多肽，找到對應的圓齒野鴉椿保守序列，利用在線軟件WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制CLE基序圖譜，進行偏好性分析。

1.3 "多序列比對與系統進化樹構建

利用MEGA 7.0軟件對獲得的CLE蛋白序列進行多重序列比對。以多序列比對結果為基礎，最大似然算法構建系統進化樹，Bootstrap重復測試（ReplicATions）設置為1 000[17]，輸出方式為Newick格式，打開FigTree v1.4.4軟件美化進化樹，對圓齒野鴉椿CLE多肽進行亞家族分類。

1.4 "圓齒野鴉椿CLE基因表達熱圖譜的構建

根據本課題組測得的圓齒野鴉椿枝條、果實、葉片、花瓣、花瓣+萼片、雄蕊和雌蕊轉錄組數據，獲得CLE基因表達量的FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值，打開TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists）v1.108軟件[18]，選擇Gra-phis中的HeatMap，粘貼EXCEL中整理好的基因表達量數值，點擊Start，得到表達量熱圖，利用Show Contronl Dialog調整色階梯度，使得熱圖具有最好的分辨率。最后以jpg格式輸出熱圖。

2 "結果與分析

2.1 "圓齒野鴉椿CLE多肽的鑒定與理化性質

利用在線預測軟件SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[19]，對圓齒野鴉椿CLE基因信號肽位置進行預測，獲得15個圓齒野鴉椿CLE基因，比對基因號，將其命名為Ej-CLE+阿拉伯數字（見表1）。

通過對圓齒野鴉椿CLE多肽基因家族的理化性質分析（見表2），CLE基因家族編碼的長度介于94～920 aa；蛋白質相對分子質量介于10 705.66～101 725.48 KD；理論等電點介于5.84～12.01，偏酸性的只有EjCLE11，為5.84，其他14位成員均為堿性，平均為9.7，表明該基因家族多肽很大程度上偏堿性；不穩定系數介于44.6～75.68，親水性總平均值大多為負數，表明圓齒野鴉椿的CLE蛋白大多為不穩定的親水蛋白[20]，僅CLE7編碼的蛋白為不穩定的疏水蛋白，其他的都為不穩定的親水蛋白。

2.2 "圓齒野鴉椿CLE多肽基序

根據擬南芥和圓齒野鴉椿CLE基因編碼蛋白序列的多序列比對結果，圓齒野鴉椿CLE多肽的基序由12個氨基酸組成。其中，擬南芥CLE13與圓齒野鴉椿CLE3具有相同的基序，擬南芥CLE10和CLE9與圓齒野鴉椿CLE4具有相同的基序，圓齒野鴉椿CLE13與擬南芥CLE25具有相同的基序。利用MEGA7.0對圓齒野鴉椿CLE多肽與擬南芥CLE多肽的同源性進行了比較，發現它們與擬南芥CLE多肽的同源性較高（見圖1）。

利用Motif在線預測軟件MEME Suit v5.5.2（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對圓齒野鴉椿和擬南芥的CLE基因進行預測分析，并結合webLogo在線軟件（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制CLE基序圖譜（如圖2）。通過圓齒野鴉椿15個CLE基序圖譜發現，每一個CLE基序都由12個氨基酸組成，不同CLE成員間氨基酸序列相似度較高。圓齒野鴉椿作為CLE蛋白家族的重要代表之一，在其CLE基序圖譜中也顯示出這些成員的一些保守和變異的特征。15個圓齒野鴉椿CLE基序的保守位點包括：第1位的精氨酸（Arg），第4、7、9位的脯氨酸（Pro），第6位的甘氨酸（Gly）及第11位的組氨酸（His）等。這些氨基酸殘基在CLE蛋白成員中起著核心性質或者重要結構性質的作用[21]。結果發現，圓齒野鴉椿CLE多肽與擬南芥CLE多肽同源程度較高（見圖2、圖3），基序序列的偏好性類似。擬南芥CLE基序的保守位點包括：第1位的精氨酸（Arg），第4、7、9位的脯氨酸（Pro），第6位的甘氨酸（Gly），以及第11位的組氨酸（His）。

2.3 "圓齒野鴉椿CLE基因的染色體定位

利用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件的Gene LocATion Visualize from GTF/GEE功能，輸入圓齒野鴉椿的注釋文件，根據位置信息將15個CLE基因定位到圓齒野鴉椿染色體上（圖4，見封三），有15條CLE基因分布在6條染色體上，其中分布在4號染色體上的有6條，分別為CLE4、CLE5、CLE8、CLE10、CLE13、CLE15；2號染色體上分布有CLE2、CLE3、CLE7；7號染色體上分布有CLE7、CLE11；5號染色體上分布有CLE1、CLE6；8號染色體上分布有CLE12；3號染色體上分布有CLE14；1號、6號染色體上無CLE基因分布。

2.4 "圓齒野鴉椿CLE基因結構

采用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件對15個圓齒野鴉椿CLE基因進行基因結構的可視化分析，發現近一半的基因有內含子，其中5個CLE基因有1個內含子，2個CLE基因有2個內含子，僅有1個CLE基因有多個內含子（圖5-A，見封三）。

采用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在線軟件分析15個圓齒野鴉椿CLE蛋白全長序列特征，發現有5個保守基序（圖5-B，見封三），只有CLE5、CLE13、CLE14和CLE15包含Motif5，CLE1和CLE2包含Motif4，且只有CLE11不包含Motif2，所有基因都包含Motif1。Motif1包含了CLE多肽核心功能序列，位于CLE多肽蛋白序列的C端。

2.5 "圓齒野鴉椿CLE系統進化樹的構建

根據以上方法利用MEGA7.0軟件對擬南芥CLE蛋白序列和圓齒野鴉椿CLE蛋白序列構建系統進化樹，根據擬南芥的CLE家族分類關系可以將這些成員分為6個亞組，分別用Group1、Group2、Group3、Group4、Group5、Group6表示（圖6，見封三），此外，15個圓齒野鴉椿CLE基因系統進化樹的分組結果與該結果也比較一致。其中Group1和Group2沒有圓齒野鴉椿CLE基因家族成員，僅有擬南芥CLE基因聚類在一起；Group4中基因家族成員最多，有CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15共6組基因；其次為Group6，有CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7共5組基因；Group3和Group5基因家族成員都為2個，Group3有CLE1和CLE2，Group5有CLE11和CLE12。在這6個亞組中，Group3、Group4和Group5距離較近，Group1、Group2和Group6距離較遠。

2.6 "圓齒野鴉椿CLE基因家族成員表達模式

通過上述方法篩選出15個圓齒野鴉椿CLE基因表達量的FPKM，利用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件繪制熱圖譜（圖7，見封三）。

果實中圓齒野鴉椿CLE基因的表達量普遍較低，其中CLE1、CLE2、CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7、CLE11、CLE13、CLE14的表達量最低，表明這些CLE基因在果實中的調控作用較小，但在果實Ⅰ中圓齒野鴉椿CLE9、CLE10、CLE12表達量較高，果實Ⅱ中圓齒野鴉椿CLE8、CLE15表達量較高。在枝條中圓齒野鴉椿CLE2、CLE6、CLE7、CLE13、CLE14的表達量較果實高很多，表明這些基因主要參與圓齒野鴉椿枝條調控。圓齒野鴉椿在葉片上CLE基因表達量普遍較低，僅有CLE4有較高的表達量，表明圓齒野鴉椿CLE基因在葉片中的調控作用較小。在花瓣和萼片中，圓齒野鴉椿CLE基因表達量普遍較低，表明圓齒野鴉椿CLE基因在花萼和萼片中的調控作用較小。在花瓣Ⅱ中，圓齒野鴉椿CLE1、CLE10、CLE14表達量較高，花瓣Ⅰ中圓齒野鴉椿CLE4、CLE5表達量較高，其余表達量均較低，表明圓齒野鴉椿CLE1、CLE4、CLE5、CLE10、CLE14在花瓣中的調控作用較其他CLE基因大。在雄蕊中僅CLE3表達量較高，雌蕊中僅CLE11表達量較高，表明圓齒野鴉椿CLE3和CLE11在雄蕊和雌蕊中的調控作用較大。

結合圓齒野鴉椿CLE基因亞家族分類可知，Group3和Group6的CLE基因在果實中的調控作用較小，Group4和Group5的CLE基因在果實Ⅰ和果實Ⅱ中的表達量較高，Group3、Group4和Group6的CLE基因在枝條、花瓣中的調控作用較大，表明Group3和Group6、Group4和Group5的關系較近，Group3和Group6的CLE基因共同調控圓齒野鴉椿花瓣、枝條的生長發育，Group4和Group5的CLE基因共同調控圓齒野鴉椿果實的生長發育。

3 "討論

擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]的基因結構較簡單，在當今的植物發育學研究中，基于模式植物的生命機理研究越來越多。近年來，文獻數據庫PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）推動了植物分子生物學方面的研究[22]。對于目前已經報道的關于CLE基因多肽的研究，擬南芥CLE多肽系統鑒定及功能研究比較透徹，其蛋白是一類小分子多肽，參與調控植物生長發育過程中的細胞分化、干細胞維持和根系統發育等關鍵生理過程。通過對圓齒野鴉椿基因組數據的分析得知，圓齒野鴉椿基因組中存在多個可能編碼CLE蛋白的基因，這些基因在圓齒野鴉椿不同組織中的表達水平也存在差異，表明它們可能有不同的生物學功能。

擬南芥CLE1、CLE3、CLE4、CLE7與植物固氮相關，同時影響植物側根發生，其在植物的次生根中特異表達[23]。因此推測圓齒野鴉椿CLE11和CLE12可能執行相似的功能，影響側根生長。CLE41、CLE44、CLE45等基因編碼的擬南芥CLE蛋白在擬南芥干細胞的維持和分化中發揮了重要作用，調節根尖中的細胞分裂、分化及芽梢生長方向等生理過程，CLE3和CLE29基因編碼的蛋白則參與了莖尖分生和根伸長等生理過程調控。因此，可以合理推測圓齒野鴉椿CLE蛋白也可能參與植物的干細胞維持和分化、根系和莖的生長發育等關鍵生理過程。

一些研究表明，在莖尖和根尖中，擬南芥CLE多肽激活了WUSCHEL（WUS）和CLAVATA3（CLV3）基因對應的信號通路，這些基因編碼激素受體蛋白和轉錄因子，參與調節莖尖和根尖中植物干細胞的自我更新和身份維持[24-26]。有研究表明，ATCLE40/CLE40信號途徑和CLV2/CRN信號途徑在擬南芥根發育中發揮著重要的調節作用，對了解植物根部組織的形成和調控機制具有重要意義[27-28]，因此推測與ATCLE40聚類在一起的圓齒野鴉椿CLE6也有相似的功能，維持根頂端分生組織干細胞的動態平衡。

維管系統又稱為維管組織系統（Vascular tissue system），包括植物體內所有的維管組織，在植物的生長發育過程中起到物質運輸[29]、機械支持和信號傳導等重要作用[30]。在擬南芥中，CLE45多肽在韌皮部中表達，外源施加ATCLE45多肽能夠抑制根初生韌皮部的分化，并抑制臨近半胞細胞和篩管分子前體細胞的發育，最終起到抑制根初生韌皮部分化的作用[31]。CLE9/10分泌肽也可以通過與BAM受體結合來抑制形成層細胞向木質部的分化[25]。而CLE25多肽則通過與CLERK-CLV2受體復合物結合來促進維管系統中形成層細胞向韌皮部的分化[32]。最新的研究發現，CLE25及其對應受體BAM，能參與長途信號傳導以應對缺水脅迫，產生從根到芽的信號，誘導ABA合成并導致氣孔關閉[33]。因此推測與ATCLE45聚類在一起的CLE8、CLE9和CLE10也有類似的功能，抑制根初生韌皮部的分化；CLE3、CLE4也與擬南芥CLE9/10有類似功能；CLE13、CLE14、CLE15和ATCLE25聚類在一起，推測CLE13、CLE14、CLE15可能執行相似的功能。

本研究使用生物信息學的方法，首次系統分析圓齒野鴉椿CLE多肽基因家族，發現圓齒野鴉椿有15個CLE基因家族成員，這些基因與CLE多肽功能序列高度保守，每個基因都包含Motif1，大部分CLE都有內含子。系統進化分析表明，CLE3、CLE4在根部維管束組織中表達，影響根初生木質部的發育，CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15在根部韌皮部中表達，影響根初生韌皮部細胞的分化。本文為深入研究CLE多肽在圓齒野鴉椿生長中的作用奠定了研究基礎，有助于更好地理解植物生長發育的分子機制。

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（責任編輯：易 "婧）