殼聚糖接枝慶大霉素綴合物的毒理安全性評價

摘要：對殼聚糖—慶大霉素綴合物（CS-GT）毒理學安全性評價并研究其在動物機體內的毒物代謝動力效果。通過亞急性經口毒性試驗以及CS-GT在小鼠體內吸收及組織分布試驗評價CS-GT的毒理安全性。在亞急性經口毒性試驗中發現大鼠生理機能正常，各劑量組均未見不可逆性毒性損傷。CS-GT在組織中的分布主要集中于腎、小腸中，6～7.5 h間基本可以代謝完畢，隨糞便排除。在該試驗研究劑量與條件下，殼聚糖—慶大霉素綴合物無致死性作用和明顯毒性作用。

關鍵詞：殼聚糖；慶大霉素綴合物；安全性評價

慶大霉素是從放線菌科單孢子屬發酵培養液中提取出的一種氨基糖苷類抗生素，具有良好的水溶性，主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的感染，但慶大霉素在使用過程中有諸多毒副作用，例如耳毒性和腎毒性[1]。單一慶大霉素的使用、治療仍存在許多限制因素，為了避免使用慶大霉素給藥時產生的毒副作用，大量功能化抗生素藥物被開發研究，優化后的慶大霉素既有較好的抗菌性能且有效避免其毒副作用[2]。殼聚糖是一種結構類似于纖維素的天然高分子化合物，具有高密度正電荷且能被動物機體完全吸收的特點[3]。將殼聚糖和慶大霉素通過氧化和席夫堿反應接枝，利用美拉德反應對殼聚糖上的氨基、羥基進行化學修飾，可顯著提高殼聚糖的抗氧化性、抗菌性、溶解性等理化性質[4]。本試驗旨在確定CS-GT在小鼠體內的適宜劑量，通過亞急性經口毒性試驗和毒代動力學研究，初步揭示藥物毒性，為慢性毒性試驗和臨床試驗劑量提供參考，并分析其在體內的吸收、代謝及濃度變化，判斷毒性靶器官，為臨床不良反應預測提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

殼聚糖接枝慶大霉素綴合物（接枝率：16.76%）由廣東海洋大學化學與環境學院李程鵬老師課題組提供；異硫氰酸熒光素FITC購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 亞急性經口毒性試驗

12只100～150 g SPF級SD大鼠隨機分為4組（n=3）：對照組、CS-GT低（250 mg/kg）、中（500 mg/kg）、高（1 000 mg/kg）劑量組。禁食12 h后，分別灌胃CS-GT或蒸餾水，連續5 d監測體重、飼料和飲水消耗，并觀察一般癥狀。

1.3 CS-GT在小鼠體內吸收及組織分布試驗

48只SPF級小鼠分12組，按4.5 h、6 h、7.5 h采樣時間分為3組，每組再分對照組、低（200 mg/kg）、中（400 mg/kg）、高（800 mg/kg）劑量組。禁食12 h后，FITC-CS-GT溶解灌胃。給藥后按設定的采樣時間眼球取血離心制備血清樣品，取肝、脾、腎、胃內容物、腸及腸內容物，勻漿離心制組織樣，檢測熒光強度。

試驗小鼠經口給藥后按設定的采樣時間分別避光收集糞便，按每100 mg糞加入1 mL PBS，充分勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液制備樣品，測定樣品中熒光強度變化。

1.4 統計學分析

所有試驗結果均來自至少3個獨立試驗，試驗數據用平均值±標準差（±s）表示，通過單因素方差分析和T檢驗確定統計學意義。試驗數據采用IBM SPSS Statistics 27軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 亞急性經口毒性試驗

試驗期間，各劑量組大鼠生長行為正常，無死亡，各劑量組大鼠的精神狀態、食量等無異常，未見嗜睡、煩躁、嘔吐、厭食、脫毛及排泄無異常。各組大鼠體重均有不同程度的增長，其中實驗組大鼠體重增長顯著，高劑量組大鼠增重27.3 g，總進食113.41 g，食物利用率24.1%（圖1）。解剖未見明顯病理變化。

2.2 CS-GT在小鼠體內的組織分布

小鼠單次經口給藥FITC-CS-GT 4.5h后，除血清外，在肝、脾和腎組織有CS-GT分布，在肝中，低中劑量CS-GT在4.5 h～6 h代謝極顯著，其他時間段并無顯著性差異。在脾中，低劑量和中劑量，在4.5 h～6 h代謝極顯著，高劑量在6h～7.5 h代謝顯著，在腎組織中CS-GT隨時間依賴性減少；由于存在吸收過程，在給藥后6 h左右藥物吸收達到高峰，之后迅速從血液中向外周分布（圖2）。

2.3 CS-GT在小鼠體內的吸收及排泄

由圖3可知，小腸內低、中、高劑量CS-GT熒光強度分別在4.5 h、6 h和7.5 h出現顯著增加，并隨時間增長而上升。在大腸中，低、中劑量CS-GT在4.5 h和6 h與對照組差異顯著，7.5 h時極顯著增加，而高劑量CS-GT在所有時間段均極顯著增加。糞便中，6 h的藥物量與其他時間點存在顯著差異，4.5 h至6 h藥物代謝量增多，代謝增強；6 h至7.5 h藥物代謝量減少，呈現下降趨勢。

3 討論

硫酸慶大霉素的腹腔注射半數致死量為294.52 mg/kg[5]，殼聚糖的LD50gt;1 500 mg/kg[6]。在亞急性毒性試驗中，根據試驗大鼠的體重計算出灌胃量約為2～3 mL。試驗組分別選擇了250 mg/kg、500 mg/kg以及1 000 mg/kg劑量的藥物進行試驗。結果顯示與正常對照組相比，大鼠各項生理檢測指標均無統計學差異。

異硫氰酸熒光素（FITC）是熒光免疫測定中常見的熒光探針，并廣泛用于蛋白質的熒光標記，也用于與其他類型的生物材料或生物分子偶聯以進行成像的示蹤劑[7-8]。Onish[9]等將腹腔注射熒光標記水溶性殼聚糖后，殼聚糖迅速分布于小鼠腎臟和尿液中，無體內積累。本試驗結果顯示CS-GT在小鼠體內經口服吸收后主要分布在肝、脾、腎，并在這些組織中代謝。肝、腎中CS-GT低中劑量在4.5～6 h代謝差異顯著，腎中藥物濃度隨時間降低，提示組織特異性分布和腎小管重吸收作用，推測CS-GT由腸道吸收后在腎臟和肝臟中代謝。此外，在腸道中不同時間段均出現顯著性增加，糞便中藥物的濃度在6 h時達到峰值，推測部分CS-GT在腸道中吸收后，剩余部分經腸道隨著糞便排泄。

隨著新型生物材料應用技術的不斷探索，CS-GT作為一種具有較強抑菌性的藥物，在生物用藥領域存在巨大的研究及應用價值，此試驗結果可為進一步藥理實驗提供參考。

結語

本研究結果表明，在該實驗條件下，CS-GT未見亞急性毒性，通過腸道吸收后在8 d后經肝和腎代謝出體外。CS-GT具有較高的食用安全性，殼聚糖接枝有效降低了慶大霉素的毒性，該試驗結果可為進一步開發CS-GT成為飼料添加劑提供理論依據。■

參考文獻：

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[5] 陸風琴，陸藝，張艷奇，李萬倉，婁建石.小諾霉素與慶大霉素在小鼠體內的時間毒性比較[J].中國抗生素雜志，1994，（06）：447-50.

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[9] ONISHI H，MACHIDA Y.Biodegradation and distribution of water-soluble chitosan in mice [J].Biomaterials，1999，20（2）：175-82.

收稿時間：2025-1-10

作者簡介：王玉玲（2000—），女，碩士。研究方向：家畜中病毒與霉菌毒素脫毒劑的研發。

通訊作者：雍艷紅（1977—），女，博士。研究方向：動物應激性致病機制及防控、海洋加工副產物資源化利用的研究。