蠶豆種質(zhì)資源抗赤斑病鑒定與評價

摘要

蠶豆赤斑病是世界上蠶豆生產(chǎn)區(qū)的重要病害，我國蠶豆赤斑病主要危害東南沿海及長江流域蠶豆產(chǎn)區(qū)，常造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失。本研究對146個蠶豆種質(zhì)資源連續(xù)3年進行了抗赤斑病田間自然發(fā)病鑒定和離體葉片接種鑒定。田間鑒定結(jié)果表明，146個參試材料中有抗病（R）材料8個，分別是‘TC-1’‘YC-1’‘YC-2’‘YC-3’‘YC-4’‘通180501’‘通蠶鮮8號’和‘通20606’，中抗（MR）材料49個，感病（S）材料77個，高感（HS）材料12個。離體接種鑒定結(jié)果表明，146個參試材料中有中抗（MR）材料28個，感病（S）材料80個，高感（HS）材料38個。綜合田間自然發(fā)病和離體葉片人工接種鑒定結(jié)果，表現(xiàn)為中抗及以上水平的材料有24個，可以這些材料為基礎(chǔ)開展蠶豆抗赤斑病育種。

關(guān)鍵詞

蠶豆;" 赤斑病;" 田間鑒定;" 人工接種;" 抗性評價

中圖分類號：

S 436.43

文獻標(biāo)識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024046

收稿日期：" 20240123""" 修訂日期：" 20240322

基金項目：

重慶市自然科學(xué)基金（cstc2021jcyj-msxmX0651）;重慶市級財政項目（cqaas2023sjczqn028）;重慶市作物種質(zhì)資源保護單位（ZWZZ2020012）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-08）

致" 謝：" 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

294143881@qq.com

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為并列第一作者

Identification and evaluation of faba bean germplasm resources for resistance to chocolate spot

LONG Juechen1，" DU Chengzhang1，" WANG Ping1，" WU Yunxia1，" ZHANG Zhiliang1，" DENG Hao2，WANG Qiang1，" LI Yuangen3，" TANG Mingshuang4，" ZHANG Jijun1*

（1. Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing" 402160， China; 2. Tongnan Agricultural Science and

Technology Extension Center， Chongqing" 404000， China; 3. Wushan County Agricultural Technology Extension

Station， Chongqing" 404700， China; 4. Nanchong Academy of Agricultural Sciences， Nanchong" 637000， China）

Abstract

Chocolate spot is an important disease impacting faba bean production in the world， particularly in the main production regions along the southeast coast and the Yangtze River Basin in China， often causing serious yield losses. In this study， a total of 146 faba bean germplasm resources were evaluated for resistance to chocolate spot natural field infection and detached leaf artificial inoculation during 2020 to 2023. Field assessments showed eight resistant （R） germplasms， namely ‘TC-1’ ‘YC-1’ ‘YC-2’ ‘YC-3’ ‘YC-4’ ‘Tong180501’ ‘Tongcanxian 8’ and ‘Tong20606’. Additionally， 49 germplasms were moderately resistant （MR）， 77 were susceptible （S） and 12 were highly susceptible （HS）. The artificial inoculation test indicated 28 germplasms as moderately resistant （MR）， 80 as susceptible （S）， 38 as highly susceptible （HS）. Based on the results from both natural field infection and artificial inoculation， 24 germplasms demonstrated resistance （R） or moderate resistance （MR） and could serve as foundational resources for breeding faba bean varieties resistant to chocolate spot.

Key words

faba bean; chocolate spot; field identification; artificial inoculation; resistance evaluation

蠶豆Vicia faba是世界上廣泛種植的一種豆類作物［1］，其富含蛋白質(zhì)、鋅、錳、鈣等營養(yǎng)成分［2］，是一些國家和地區(qū)人類飲食和動物飼料中的重要組成部分［3］。此外，蠶豆可通過生物固氮提高土壤肥力，從而減少對后茬作物的人工氮肥施用量［4］，在貧困國家或地區(qū)這一優(yōu)勢被尤為看重，通常用于和谷物等作物的輪作或間套作［5］。2021年，我國蠶豆收獲面積為83.17萬hm2，占世界的21.63%，居世界首位。西南地區(qū)、長江流域和西北地區(qū)是我國蠶豆主產(chǎn)區(qū)，但生產(chǎn)中常面臨各種生物與非生物脅迫，導(dǎo)致產(chǎn)量不同程度受損。

蠶豆赤斑病（chocolate spot）最早報道于19世紀(jì)中期，是世界各蠶豆主產(chǎn)區(qū)的重要病害［6］。在我國，蠶豆赤斑病主要危害東南沿海及長江流域的各蠶豆產(chǎn)區(qū)。蠶豆赤斑病由蠶豆葡萄孢Botrytis fabae、灰葡萄孢B.cinerea和擬蠶豆葡萄孢B.fabiopsis 3種葡萄孢屬真菌侵染引起，其中蠶豆葡萄孢是導(dǎo)致蠶豆赤斑病最主要的病原菌［79］。該病的大面積暴發(fā)常出現(xiàn)在花期［10］，植株被侵染后迅速發(fā)病，初期葉片上產(chǎn)生紅褐色小斑點，后擴大成圓形或橢圓形病斑，導(dǎo)致花、莢和葉片枯死并發(fā)生脫落，最終造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，在適宜發(fā)病條件下，產(chǎn)量損失可達50%～100%［11］。

有學(xué)者提出可用栽培措施和化學(xué)防控相結(jié)合的方式來應(yīng)對蠶豆赤斑病的大面積發(fā)生［1213］，但這并不利于農(nóng)業(yè)面源污染的控制，同時化學(xué)防控成本的持續(xù)升高也挫傷了種植者的積極性，特別是在一些欠發(fā)達地區(qū)，將化學(xué)防控作為穩(wěn)產(chǎn)的主要手段是不可行的。提高寄主植物的抗性是最環(huán)保和經(jīng)濟的手段［14］，可作為蠶豆赤斑病綜合治理策略的核心，而培育抗性品種是其中最主要的環(huán)節(jié)。種質(zhì)資源的抗病性鑒定是抗病品種選育的基礎(chǔ)［15］，由于我國并非蠶豆起源中心，現(xiàn)有蠶豆品種的遺傳背景較為狹窄，因此從種質(zhì)資源中篩選抗病材料是對抗蠶豆品種抗性衰減的重要手段。本研究連續(xù)3年采用田間自然發(fā)病及人工接種的方法，對146個蠶豆種質(zhì)資源開展抗性評價，以期為選育抗赤斑病蠶豆品種提供抗源。

1" 材料與方法

1.1" 參試種質(zhì)資源

本研究中參試材料共計146個，包括重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集到的地方品種、自行選育及從國內(nèi)外科研單位引進試種后篩選出的材料。為保證各參試材料的性狀準(zhǔn)確性，所有材料均經(jīng)嚴(yán)格單株選擇、性狀觀察，獲得農(nóng)藝性狀一致植株的種子備用。

1.2" 病原菌的分離及鑒定

用于接種的病原菌為項目組于2019年從重慶地區(qū)分離到的強致病力分離物BF-12。病原菌的分離及致病力測定參照黃燕等［16］的方法，并通過擴增ITS、g3pdh、hsp60和rpb2基因部分序列進行分子鑒定以確定其種屬［17］。

1.3nbsp; 抗病性鑒定

1.3.1" 田間自然發(fā)病鑒定

2020年-2023年連續(xù)3個生產(chǎn)季節(jié)在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院渝西試驗基地（105.9°E，29.2°N）同一固定田塊進行田間鑒定。參試材料于上一年10月中旬播種，各材料順序排列，每材料種植4行為1個重復(fù)，行長3 m，行距70 cm，穴距30 cm，穴留2株苗，每材料3次重復(fù)，以感病品種‘成胡18’為對照。

根據(jù)各參試材料生育期，于各參試材料終花期調(diào)查發(fā)病葉片數(shù)及病斑占葉片面積，各參試材料隨機調(diào)查10株，觀察植株中部10片葉的發(fā)病情況，參考《蠶豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［18］對葉片病級進行劃分（表1，圖1），依據(jù)病葉分級結(jié)果計算病情指數(shù)（DI）。

DI=Σ（各級葉片數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高級代表值）×100。

參照前人的分級標(biāo)準(zhǔn)［19］并進一步細化，將赤斑病抗性分為5級，即DI≤15為高抗（HR），15＜DI≤35為抗（R），35＜DI≤55為中抗（MR），55＜DI≤75感（S），DI＞75為高感（HS）。

1.3.2" 離體葉片接種鑒定

人工接種鑒定試驗于2023年開展，采用菌餅接種法對離體葉片進行人工接種［20］。病原菌分離物在直徑9 cm的PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基平板上于20℃， L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng)3 d。選取各材料植株中上部健康的新鮮葉片為接種材料，接種前先用自來水沖洗葉片表面并晾干。用滅菌的直徑6 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，在超凈工作臺中將菌餅接種到蠶豆葉片上，菌絲面向下。接種后將葉片置于一次性培養(yǎng)皿（9 cm）中的濕潤濾紙上。每個參試材料接種5個葉片（保證葉片形狀、大小、位置基本一致），以接種無菌PDA為對照，于培養(yǎng)箱中，20℃， L∥D=12 h∥12 h，相對濕度90%條件下培養(yǎng)，接種后第5天測量病斑直徑，并參照Bouhassan等的標(biāo)準(zhǔn)［21］進行對抗病等級進行劃分（表2）。

1.4" 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對田間自然發(fā)病鑒定試驗中年度間和材料間的抗性差異進行無重復(fù)雙因素方差分析（Two-way ANOVA），采用一般線性模型對數(shù)據(jù)進行處理，最小顯著差數(shù)法（LSD）對均值進行比較。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 病原菌的鑒定

通過對菌株BF-12的ITS、g3pdh、hsp60和rpb2基因部分序列進行擴增，獲得了其序列，并上傳至NCBI獲得登錄號 （ITS： OR647512;g3pdh： OR659436;hsp60： OR659435;rpb2： OR659437）。使用MEGA 11軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，BF-12與蠶豆葡萄孢Botrytis fabae菌株CBS109.57的相似性最高，支持率為97%，因此確定BF-12為蠶豆葡萄孢，可用于后續(xù)接種鑒定（圖2）。

2.2" 田間抗病性鑒定

2021年-2023年的田間鑒定結(jié)果表明，146個參試材料中，感病對照‘成胡18’ 3年均表現(xiàn)為高感（HS）。另外145個材料中有8個材料表現(xiàn)抗病（R），占鑒定材料的5.5%，分別是‘TC-1’‘YC-1’‘YC-2’‘YC-3’‘YC-4’‘通180501’‘通蠶鮮8號’和‘通20606’， 3年平均病情指數(shù)（DI）分別是29.6、30.2、28.6、25.2、26.7、30.4、30.0和35.0。其中‘YC-3’的病情指數(shù)最低，抗性水平居首位（表3）。此外還篩選到49個中抗（MR）材料，感病（S）材料77個，高感（HS）材料11個，分別占材料總數(shù)的33.6%、52.7%和7.5% （表3）。方差分析結(jié)果顯示，年度間和參試材料間均存在顯著差異（表4）。

2.3" 人工接種抗病性鑒定

2023年的人工接種鑒定結(jié)果表明，146個參試材料中未篩選到高抗（HR）和抗病（R）材料，而中抗（MR）材料也僅篩選到28個，占材料總數(shù)的19.2%，其中病斑直徑最小的是‘YC-3’， 5個離體葉片的病斑直徑平均為（15.2±1.53）mm。其余118個材料中，感病（S）材料80個，占材料總數(shù)的54.8%，高感（HS）材料38個，占材料總數(shù)的26.0%（表3）。

3" 結(jié)論與討論

有學(xué)者認(rèn)為田間自然發(fā)病對種質(zhì)資源進行抗性鑒定的效果雖然最直觀，但鑒定結(jié)果存在準(zhǔn)確性差、針對性不強、環(huán)境難以調(diào)控等不足［15］。本研究在相同田塊采用自然發(fā)病法，連續(xù)3年對蠶豆種質(zhì)資源進行田間鑒定，方差分析結(jié)果表明，相同材料在年度間的病情指數(shù)存在顯著差異，這表明年度間的發(fā)病程度受外界條件的影響較大，這與之相印證。然而材料間的病情指數(shù)同樣存在顯著差異，這表明，雖然外界條件對試驗總體的發(fā)病嚴(yán)重程度產(chǎn)生了顯著影響，但各材料間的抗性水平依然保持顯著差異，因此，在固定田塊連續(xù)多年開展蠶豆種質(zhì)資源的赤斑病抗性田間鑒定是可行的，其結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。

在種質(zhì)資源的抗性鑒定方面，人工接種鑒定方法較多，針對葉部發(fā)生的病害主要采用菌塊接種法［22］、分生孢子接種法［21，2326］。本研究采用菌塊接種法進行人工鑒定，其結(jié)果與田間鑒定相比，除‘YC-5’‘HDZY-1’‘HDZY-38’外，其余材料的發(fā)病等級均相同或更高，這表明人工接種的發(fā)病進程更快，更重，由此可見采用菌塊接種法可快速鑒定出蠶豆種質(zhì)資源對赤斑病的抗性等級，因此在今后的抗病種質(zhì)資源篩選工作中，應(yīng)當(dāng)結(jié)合自然發(fā)病和人工接種兩種鑒定方法。

1992年梁訓(xùn)義等［19］從938個國內(nèi)外的種質(zhì)資源中篩選獲得中抗（MR）赤斑病的蠶豆種質(zhì)資源96個，占參試材料的10.23%。本研究通過田間鑒定篩選獲得抗病（R）材料8個，中抗（MR）材料49個，占參試材料的39.0%，通過人工接種鑒定獲得中抗（MR）材料28個，占19.2%，結(jié)合田間鑒定的結(jié)果，共計24個材料表現(xiàn)出了穩(wěn)定的赤斑病抗性，這為今后的抗病育種提供了良好的種質(zhì)基礎(chǔ)。此外，本研究中參試材料中抗（MR）水平的種質(zhì)資源比例明顯增加，這表明經(jīng)過長時間的抗病育種，我國蠶豆品種的赤斑病抗性水平獲得大幅度提高。但遺憾的是，目前仍未見免疫材料的報道，因此不斷從種質(zhì)資源中篩選獲得抗病材料，從而以優(yōu)質(zhì)抗病材料為親本開展種質(zhì)資源創(chuàng)制成為了蠶豆種業(yè)突破赤斑病瓶頸的最佳途徑。

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（責(zé)任編輯：田" 喆）