異色瓢蟲黑化突變體ml在兩種不同食物條件下的抗紫外線能力測定

摘要

紫外線輻射對昆蟲具有重要影響，表皮黑化程度不同的個體對紫外線輻射的抵抗能力不同，而食物是影響昆蟲表皮黑化程度的一個重要因素。本研究以豌豆蚜Acyrthosiphon pisum與人工飼料為食料，通過測定異色瓢蟲Harmonia axyridis黑化突變體（ml）和野生型（wt）各齡幼蟲（1～4齡）經紫外線輻照處理后的存活率、發育歷期及發育至成蟲的體重等，評價不同食物條件下兩種表型的異色瓢蟲抗紫外線能力的差異，以及不同發育階段接受紫外線輻照對其抗紫外線能力的影響。結果表明：1）對兩種食物飼喂的異色瓢蟲1～4齡幼蟲進行紫外線照射，ml在多個發育階段較wt具有更高的存活率，且其總發育歷期大多也明顯縮短，且ml型1齡幼蟲經紫外線照射后發育至成蟲時體重更重。2）低齡幼蟲（1齡和2齡）接受紫外線照射，其后續發育階段的存活率較低，且在1齡幼蟲紫外線處理中ml的適合度表現明顯優于wt;4齡幼蟲接受紫外線照射后后續階段存活率最高，但2種表型間沒有顯著差異。3）2種表型的異色瓢蟲均以取食豌豆蚜的個體抗紫外線能力整體優于取食人工飼料的個體，食物因素對兩種表型存活率的影響存在差異。綜上，異色瓢蟲黑化突變體的抗紫外線能力強于野生型，且受處理幼蟲階段及食物類型的影響。本研究結果為進一步探究異色瓢蟲的抗逆能力及篩選適應不同環境的生防資源奠定了理論基礎。

關鍵詞

異色瓢蟲;" 黑化突變體;" 存活率;" 發育歷期;" 體重

中圖分類號：

S 476.2

文獻標識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024055

收稿日期：" 20240129""" 修訂日期：" 20240415

基金項目：

甘肅省青年科技基金計劃（21JR7RA848）;甘肅農業大學伏羲青年英才培養計劃（Gaufx-03Y05）

致" 謝：" 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

haoya_nan@126.com

#

為并列第一作者

Determination of the UV-resistance of a melanism mutant ml of Harmonia axyridis under two different food conditions

LI Yuan，" QIN Yalong，" SUN Yuanxing，" HAO Yanan*

（College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Biocontrol Engineering Laboratory of Crop

Diseases and Pests of Gansu Province， Lanzhou" 730070， China）

Abstract

UV radiation significantly affects insects， but individuals with different degrees of cuticle melanism vary in their resistance to UV radiation. Food is an important factor affecting the cuticle melanism of insects. In this study， the melanism mutant （ml） and the wild type （wt） of Harmonia axyridis were reared with two different foods， i.e.， pea aphid （Acyrthosiphon pisum） or artificial diet， and the larvae at different stages （1st instar to 4th instar） were exposed to UV. After exposure， the cumulative survival rate in subsequent stages， developmental duration， and adult body weight were measured to evaluate the UV-resistance of the two phenotypes as well as the influences of UV-exposure stage. The results showed that： 1） Under both foods conditions， the ml type versus wt type had a relatively higher survival rate in most development stages and， in most cases， had shortened developmental time after their 1st to 4th instar larvae exposed to UV. Meanwhile， ml had significantly higher body weight when the 1st instar larvae exposed to UV; 2） UV exposure of early-stage larvae （1st instar and 2nd instar） resulted in the lowest subsequent survival rates， but ml had significantly better fitness than wt in UV-exposure treatment of the 1st instar larvae. The highest survival rates were observed in UV-exposure treatment of the 4th instar larvae， but no significant difference was detected between the two phenotypes; 3） For both phenotypes， pea aphid-fed individuals exhibited higher UV-resistance than those feeding on artificial diet. However， food factor exhibited different influences on survivals of the two phenotypes. In conclusion， the melanism mutant demonstrated stronger UV-resistance than wt， and their UV-resistance affected by the UV-exposure stage and the food type. This study provides a theoretical foundation for further research on the stress resistance of H.axyridis and the identification of biocontrol agents adapted to different environments.

Key words

Harmonia axyridis;" melanism mutant;" survival rate;" developmental duration;" body weight

紫外線（ultraviolet，UV）是一種電磁輻射，可分為3種不同的波長類型：紫外線A（UVA： 320～400 nm）、紫外線B（UVB： 280～315 nm）和紫外線C（UVC： 200～280 nm），紫外線所攜帶的能量與波長成反比，即波長越短能量越高，對生物體造成的傷害也越嚴重［1］。UVB和UVC對生物的傷害較大，但部分UVB和全部UVC被大氣層中的氧和臭氧吸收，因此進入地表環境的主要是UVA［2］。UVA對環境、植被、昆蟲等產生諸多不良影響。

Rebollar等［3］的研究表明，紫外線能夠引發生物體產生大量超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基和單線態氧等對蛋白質和脂膜造成損傷的活性氧（reactive oxygen species， ROS），破壞昆蟲正常的細胞結構和生理功能，從而帶來存活率下降、發育歷期延長、化蛹推遲及蟲體質量減輕等諸多危害［1，4］。例如，低強度UVA輻射能明顯延長果蠅的發育歷期［5］。昆蟲對紫外線輻射的抵抗能力受多重因素影響。首先，不同發育階段昆蟲對紫外線的抵抗能力不同。其中，一般未發育完全的幼齡昆蟲更易受到紫外線直接或間接的影響［6］。此外，表皮黑色素含量對昆蟲的紫外線抗性具有重要作用［78］，昆蟲黑色表皮相較于淺色表皮能更有效地抵御紫外線，如體色為白色的家蠶幼蟲相比黑色家蠶幼蟲對UVA照射更敏感［9］。在自然條件下，黑化是昆蟲最為常見的體色變異現象［1011］，但有關黑化突變體的抗紫外線能力僅有少量研究。

異色瓢蟲Harmonia axyridis屬鞘翅目Coleoptera瓢甲科Coccinellidae［12］，可捕食多種害蟲，尤其對各類蚜蟲有較強的捕食能力，作為重要生防天敵在全球農業生產中被廣泛應用［13］。異色瓢蟲因其鞘翅的多樣性而著稱，是一種典型的多型性生物，其鞘翅底色大多由紅黃色與黑色組成［14］，其上分布黑色或黃色斑點以形成豐富的斑型變化。本實驗室在室內飼養種群中發現了一體色異常黑化的突變體（ml）。該突變體各發育階段的體色都呈現出明顯的黑化特征，其典型表型如圖1所示［15］。本研究以豌豆蚜Acyrthosiphon pisum與人工飼料為食料探究異色瓢蟲ml各齡幼蟲經紫外線輻照處理后后續階段的存活率、發育歷期及發育至成蟲的體重的變化規律，并分析ml與野生型（wt）響應紫外線輻射的差異。旨在為進一步明確異色瓢蟲的環境適應機制奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 兩種食物及供試蟲源

本試驗所用異色瓢蟲黑化型突變體（ml）為實驗室內長期飼養種群，對照野生型（wt）為黃底型異色瓢蟲，于2022年5月采自蘭州市安寧區黃河北岸（103°34′E-103°47′E， 36°5′N-36°10′N）的黃刺玫Rosa xanthina上，在實驗室長期飼養。2種表型的異色瓢蟲均飼養于直徑為9 cm的培養皿內，每皿4頭，每天提供充足且新鮮的綠色型豌豆蚜Acyrthosiphon pisum，培養皿放置在人工氣候箱［溫度（25±1）℃，濕度60%～65%，光周期L∥D=14 h∥10 h］內。豌豆蚜飼養于盆栽蠶豆幼苗上，并置于人工氣候箱［溫度（20±1）℃，濕度60%～65%，光周期L∥D=14 h∥10 h］內繁殖種群以供后續試驗使用。

1.1.2" 人工飼料的配制

固體人工飼料參照前期研究所述配方及方法［1617］提前配制，并分裝在2 mL離心管中置于-20℃冰箱內保存備用，飼料主要成分及含量見表1。

1.2" 方法

1.2.1" 幼蟲飼養

2種表型的異色瓢蟲成蟲分別飼養在直徑9 cm培養皿內，提供充足豌豆蚜，雌雄交配后將所產卵挑出置于直徑3 cm培養皿內，并放置1個浸滿蒸餾水的棉球用于保濕，2～3 d后卵開始孵化，將黑化型和野生型初孵幼蟲分別置于直徑為3 cm的培養皿內單頭飼養，并分別使用人工飼料（AD）和豌豆蚜（AP）飼喂。用人工飼料喂養時，將人工飼料添加至邊長為0.5 cm左右的硫酸紙上然后放入培養皿，并在培養皿中放入一浸濕蒸餾水的棉球保濕，2 d更換1次人工飼料，及時給棉球添水并更換培養皿以保持飼養環境干凈。用豌豆蚜喂養時，每天提供充足且新鮮的豌豆蚜并及時清理培養皿。所用試驗幼蟲均飼養于人工氣候箱內［溫度（25±1）℃，濕度60%～65%，光周期L∥D=14 h∥10 h］。當幼蟲發育至所需階段后進行抗紫外線能力測定。

1.2.2" 紫外線處理不同齡期幼蟲

本試驗分別對1齡（L1）或2齡（L2）、3齡（L3）和4齡（L4）幼蟲進行紫外線輔照處理，記為UV-L1、UV-L2、UV-L3及UV-L4。每個齡期共計處理25頭幼蟲。準備一方形泡沫塑料盒（28 cm × 16 cm × 18 cm），在其頂部按照手提式紫外線分析儀（365 nm，WFH-204B，杭州齊威儀器有限公司）濾光片的大小裁剪出一長方形開口（16.5 cm × 6.5 cm），并將手提式紫外線分析儀置于泡沫盒上。紫外線處理時，用橡皮筋將紗網固定在每個裝有試驗幼蟲的培養皿（1頭/皿）的外壁上，將培養皿轉移至泡沫盒內，并將紫外線分析儀的光源對準紗網。紫外燈距培養皿8 cm，持續照射4 h后將供試幼蟲挑出并轉移至新的培養皿中繼續單頭飼喂。每天觀察幼蟲的存活及發育情況，統計經紫外線處理的幼蟲發育至后續各階段的累計存活率［發育至各階段的存活數/初始幼蟲數（25）×100%］、后續各階段的發育歷期以及新羽化成蟲的體重（羽化后24 h）。

1.3" 數據分析

采用SPSS 26軟件進行數據分析。其中，紫外線處理不同齡期幼蟲后的累計存活率采用4×2列聯表法進行卡方檢驗，顯著水平均設置為0.05;當檢測到顯著差異時，各處理進一步通過2×2列聯表法依次進行兩兩比較［18］;發育歷期、新羽化成蟲體重采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性比較，顯著水平均設置為0.05。使用Excel作圖。

2" 結果與分析

2.1" 紫外線處理不同齡期幼蟲后后續不同發育階段試蟲的累計存活率

取食豌豆蚜的幼蟲經紫外線處理后，其發育至后續階段的累計存活率均逐漸降低，黑化突變體（ml）幼蟲發育至各階段的累計存活率均稍高于野生型（wt），但無顯著差異（Pgt;0.05）。其中，ml型1齡幼蟲和wt型2齡幼蟲經紫外線照射后發育至成蟲的存活率最低，分別為80%與68%（圖2a，b）;而ml型和wt型的4齡幼蟲接受紫外線照射后發育至成蟲的存活率最高，分別為92%和80%（圖2d）。

取食人工飼料的幼蟲經紫外線照射后，其發育至后續階段的累計存活率也均逐漸降低。其中，1齡幼蟲接受紫外線照射后，ml型發育至2齡（χ2=8.000， P=0.005）、3齡（χ2=12.578， Plt;0.001）、4齡（χ2=6.522， P=0.011）、蛹（χ2=6.876， P=0.009）及成蟲（χ2=5.128， P=0.024）的存活率均顯著高于wt型（圖2a）。但2齡幼蟲接受紫外線照射后，ml型發育至3齡的累計存活率顯著低于wt型（χ2=8.140， P=0.004）（圖2b）。3齡及4齡幼蟲接受紫外線處理后，ml型發育至后續各階段的累計存活率均略高于wt，但兩者間無顯著差異（Pgt;0.05）。就發育至成蟲的累計存活率來說，ml型2齡幼蟲及wt型1齡幼蟲接受紫外線照射后存活率最低，分別為56%與36%（圖2a，b）;ml型3齡幼蟲及wt型4齡幼蟲接受紫外線照射后存活率最高，均為76%（圖2c，d）。

比較取食豌豆蚜和人工飼料的異色瓢蟲的抗紫外能力發現，ml型1齡幼蟲接受紫外線照射后發育至后續各階段的累計存活率均沒有顯著差異（Pgt;0.05），但取食豌豆蚜的ml型2齡幼蟲接受紫外線照射后發育至3齡（χ2=8.140， P=0.004）和成蟲的累計存活率（χ2=4.667， P=0.031）及其4齡幼蟲接受紫外線照射后發育至成蟲的累計存活率（χ2=4.500， P=0.034）顯著高于取食人工飼料的個體;取食豌豆蚜的wt型1齡幼蟲接受紫外線照射后發育至2齡幼蟲（χ2=5.711， P=0.017）、3齡幼蟲（χ2=9.921， P=0.002）、4齡幼蟲（χ2=8.681， P=0.003）、蛹（χ2=9.934， P=0.002）及成蟲（χ2=6.522， P=0.011）的累計存活率均顯著高于取食人工飼料的個體（圖2a）。在其他齡期幼蟲接受紫外線照射，同種表型異色瓢蟲經2種食物飼養，個體的存活率均無顯著差異（Pgt;0.05）（圖2b～d）。

2.2" 紫外線處理不同齡期幼蟲后后續發育階段的發育歷期

當紫外線處理1齡幼蟲時，2種食物條件下ml發育至成蟲的總發育歷期均顯著短于wt（Plt;0.05），且取食豌豆蚜時ml型3齡幼蟲與蛹的發育歷期顯著短于wt型（Plt;0.05）;取食人工飼料時ml型1齡與4齡幼蟲的發育歷期也顯著短于wt型（Plt;0.05）。此外，比較取食兩種食物的幼蟲發育歷期，發現取食豌豆蚜的ml型和wt型幼蟲總發育歷期均顯著短于取食人工飼料的個體（Plt;0.05）（表2）。

當紫外線處理2齡幼蟲時，2種食物條件下ml發育至成蟲的總發育歷期與wt型個體均無顯著差異（Pgt;0.05）。取食人工飼料的ml型個體的4齡幼蟲發育歷期顯著短于wt型個體（Plt;0.05），但豌豆蚜飼喂處理的4齡幼蟲歷期以及人工飼料飼喂處理的蛹期顯著長于wt（Plt;0.05）。此外，取食豌豆蚜的ml型和wt型異色瓢蟲總發育歷期顯著短于取食人工飼料的個體（Plt;0.05）。取食2種食物的wt型異色瓢蟲蛹期無顯著差異（Pgt;0.05）（表3）。

當紫外線處理3齡幼蟲時，ml取食豌豆蚜時發育至成蟲的總發育歷期與wt間無顯著差異（Pgt;0.05），而取食豌豆蚜時的4齡及取食人工飼料時的3齡幼蟲發育歷期及發育至成蟲的總歷期均顯著短于wt（Plt;0.05）;而當紫外線處理4齡幼蟲時，ml取食豌豆蚜與人工飼料時各階段的發育歷期及發育至成蟲的總歷期均與wt間無顯著差異（Pgt;0.05）。此外，除UV-L3處理中wt的蛹期外，2種表型異色瓢蟲取食豌豆蚜后各階段發育歷期及總發育歷期均顯著短于取食人工飼料的個體（Plt;0.05）（表4）。

2.3" 紫外線處理不同齡期幼蟲后新羽化成蟲的體重

取食不同食物情況下，取食豌豆蚜的ml型異色瓢蟲的1齡幼蟲（t=-4.726， Plt;0.001）與4齡幼蟲（t=-3.625， P=0.002），wt型的2齡幼蟲（t=-2.627， P=0.015）、3齡幼蟲（t=-5.676， Plt;0.001）與4齡幼蟲（t=-8.727， Plt;0.001）經紫外線處理后發育至成蟲的雌蟲體重均顯著高于取食人工飼料的個體。當取食豌豆蚜時，1齡幼蟲接受紫外線照射后ml型個體發育至成蟲的體重顯著高于wt（t=4.369， Plt;0.001），但3齡幼蟲接受紫外線照射后ml型發育至成蟲的體重顯著低于wt（t=-2.819， P=0.011）。當取食人工飼料時，ml型4齡幼蟲接受紫外線照射后發育至成蟲的體重顯著高于wt（t=3.120， P=0.005），但其他齡期的幼蟲紫外線處理后2個表型發育至成蟲的體重均無顯著差異（Pgt;0.05）（圖3）。

取食不同食物情況下，取食豌豆蚜的ml型異色瓢蟲的1齡幼蟲（t=-4.390，Plt;0.001）與4齡幼蟲（t=-3.534，P=0.003），wt型1齡幼蟲（t=-5.758，Plt;0.001）、2齡幼蟲（t=-2.584，P=0.017）、3齡幼蟲（t=-5.652，Plt;0.001）與4齡幼蟲（t=-7.503，Plt;0.001）經紫外線照射后發育得到的雄成蟲體重顯著高于取食人工飼料的個體。當取食豌豆蚜時，ml型1齡幼蟲接受紫外線照射的處理中發育至雄成蟲的體重顯著高于wt（t=5.384，Plt;0.001），但在2齡幼蟲（t=-2.587，P=0.019）與3齡幼蟲（t=-3.250，P=0.004）接受紫外線照射的處理中雄成蟲體重顯著低于wt。當取食人工飼料時，ml型1齡幼蟲接受紫外線照射的處理中雄成蟲體重顯著高于wt（t=2.340，P=0.028），但2個表型在其他齡期幼蟲紫外線暴露處理后獲得的雄成蟲體重均無顯著差異（Pgt;0.05）（圖4）。

3" 結論與討論

紫外線處理2種表型幼蟲后，異色瓢蟲黑化突變體（ml）較野生型（wt）的存活率升高，總發育歷期縮短，1齡幼蟲接受紫外線照射后發育至成蟲的體重更高。前期研究發現，ml與wt在正常條件下的主要生物學表現無顯著差異［15］，由此說明，ml抗紫外線的能力強于wt。對不同表型果蠅的研究也獲得了類似的結果，正常型果蠅Drosophila melanogaste相比黃化型果蠅的抗紫外線能力更強［1920］。兩種表型抗紫外線能力差異可能是由于ml型個體體內的黑色素含量較wt高或表皮厚度不同，對其進行了有效保護。紫外線照射通常會引起昆蟲外骨骼黑色素含量增高及角質層增厚［1］，從而提高其免疫力，達到光保護作用。相關功能已在部分昆蟲中證實，如天藍細蟌Coenagrion puella被紫外線照射后體內的黑色素合成能力相對增強［21］，而赤擬谷盜Tribolium castaneum被紫外線照射后外表皮變厚［22］。此外，紫外線輻射會引起昆蟲產生大量氧自由基，但體內的黑色素可通過螯合自由基來抵擋紫外線輻射對昆蟲造成的生理和外部形態上的損傷［2324］。

本研究進一步發現，2種表型的異色瓢蟲均在紫外線處理低齡幼蟲時（1齡和2齡幼蟲）引起的后續階段存活率最低，而紫外線處理高齡幼蟲（4齡幼蟲）引起的后續階段存活率最高。同時，ml型1齡幼蟲經紫外線處理后，后續階段的適合度表現明顯優于wt（存活率及發育至成蟲的體重顯著增高，而發育歷期顯著縮短）;而4齡幼蟲經紫外線處理，ml與wt間的生物學特性無顯著差異。上述結果表明，紫外線照射處理不同齡期幼蟲對2種表型異色瓢蟲的生物學表現具有不同的影響。通常，紫外線對昆蟲卵的傷害最大，幼蟲次之，成蟲最小［1］。Ali等［25］在東方黏蟲Mythimna separata抗紫外線研究中也發現UVA輻射對低齡幼蟲的危害大于高齡幼蟲。這種差異主要是由于高齡幼蟲體內蛋白質和脂質等含量較高，可在免疫防御紫外線輻射等不利環境中發揮重要作用［2627］。本研究還發現紫外線處理某一齡期幼蟲后，2個表型在該階段的生物學表現無差異，但在后續的某些發育階段表現出明顯差異，如紫外線處理1齡幼蟲后，其1齡幼蟲發育歷期在2種表型間無差異，但在3齡及蛹期卻表現出明顯差異。上述結果表明，紫外線處理造成的不利影響是隨昆蟲生長發育逐漸表現出來的，且可能存在累加效應。Ali等［6］研究發現UVA輻射東方黏蟲后導致其成蟲壽命縮短但產卵率升高。此外，張雅君等［28］發現紫外線輻射雄性果蠅可能會引發基因突變，即親代受到紫外線輻射后造成子代表現異常的現象。因此，后續研究還需測定紫外線輻射處理不同齡期幼蟲對異色瓢蟲黑化突變體ml成蟲生殖力與子代生長發育的影響及與野生型wt的差異。

同時，研究發現喂飼不同食物的異色瓢蟲幼蟲經紫外線輻射后后續階段的生物學特征表現出明顯差異。從整體來看，取食豌豆蚜的ml和wt型個體較取食人工飼料的個體具有更高的存活率，更短的發育歷期。與此同時，當取食人工飼料時，ml型在部分紫外線處理中的表現優于野生型wt（1齡幼蟲處理中的存活率及4齡幼蟲處理中的雌成蟲體重）。造成上述差異的原因可能是與人工飼料相比豌豆蚜營養更為豐富［29］，更有利于異色瓢蟲生長發育［30］。特別是，與抗紫外線有關的黑色素的合成需要從食物中獲取蛋白質等原料［31］，而2種食物中蛋白質的含量可能存在較大差異。同時，本試驗研究結果也表明在人工飼料條件下ml較wt對食物的利用效率更高，以利于其提升保護性酶的含量等［32］。昆蟲體色影響其食物利用效率的研究已有相關報道，如Ethier等［33］發現天幕毛蟲Malacosoma neustria取食相同食物后黑化型較正常型的雄蟲體型變小。

本試驗研究了UVA對2種表型異色瓢蟲幼蟲生長發育的影響，結果表明黑化突變體較野生型具有更強的抗紫外線能力且取食人工飼料可進一步提升黑化突變體的抗紫外線優勢。此外，本實驗室前期已有研究發現，取食豌豆蚜后黑化突變體的抗干旱能力也明顯優于野生型（未發表）。由上可知，黑化突變體已表現出良好的自然環境適應能力，但對其他環境因子如極端溫度［3435］的適應力還有待進一步評價。同時，本試驗也發現黑化突變體對蚜蟲的日捕食量很高（成蟲體重與野生型相當或稍高），且前期研究發現其幼蟲取食人工飼料后的適合度表現優于野生型，具有利用人工飼料飼養的重要優勢［15］。綜上，黑化突變體是具有重要應用潛能的生防資源，可依據不同地區的紫外線輻照、干旱程度等條件合理使用。同時，本文基于食物因子影響抗紫外線能力的結果也可為科學飼養適于不同環境的天敵昆蟲產品提供有益指導。參考文獻

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（責任編輯：楊明麗）