交配對棉鈴蟲嗅覺相關(guān)基因表達的影響

摘要

嗅覺影響著昆蟲取食、交配、產(chǎn)卵等行為，然而嗅覺系統(tǒng)的狀態(tài)并不是一成不變的，會隨著昆蟲狀態(tài)的變化發(fā)生相應(yīng)改變。交配是昆蟲生活史中非常重要的行為，交配前后昆蟲的各項生理狀態(tài)都會發(fā)生明顯變化，已有研究證明交配會影響蛾類昆蟲的嗅覺感受，但其作用機制還不清楚。本研究以重大農(nóng)業(yè)害蟲棉鈴蟲Helicoverpa armigera為研究對象，對交配與未交配雌雄蛾觸角、下唇須和喙的轉(zhuǎn)錄組進行測序、分析和qPCR驗證，探究交配對嗅覺相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果表明，交配與未交配的雌雄蛾的各組織中均有一定數(shù)量的嗅覺相關(guān)基因的表達水平發(fā)生了顯著變化，這些基因的表達變化可能導(dǎo)致了昆蟲交配前后的嗅覺感受和行為的變化。本研究從分子水平上初步探索了交配對棉鈴蟲嗅覺影響的機制，為深入探究嗅覺可塑性以及嗅覺調(diào)控機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞

棉鈴蟲;" 交配;" 轉(zhuǎn)錄組測序;" 嗅覺相關(guān)基因;" 表達模式

中圖分類號：

S 433; Q 966

文獻標(biāo)識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024045

收稿日期：" 20240123""" 修訂日期：" 20240325

基金項目：

國家自然科學(xué)基金（32272540，32072509）; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-CSCB-202302）

致" 謝：" 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

秦秋菊qiujuqin@163.com;劉楊yangliu@ippcaas.cn

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為并列第一作者

Effect of mating on expression of olfaction-related genes

in Helicoverpa armigera

ZHANG Zeen1，2，" WANG Zhiqiang2，" CHEN Qiuyan2，" QIN Qiuju1*，" LIU Yang2*

（1. College of Plant Protection， Hebei Agricultural University， Baoding" 071000， China; 2. State Key

Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese

Academy of Agricultural Sciences， Beijing" 100193， China）

Abstract

Olfaction influences various behaviors of insects， including feeding， mating， and oviposition. However， the state of olfactory system is dynamic and adjusted according to the insect’s physiological state. Mating is a crucial behavior in the life cycle of insects， leading to significant physiological changes. Previous researches have demonstrated that mating can affect olfactory perception in moths， while the underlying mechanisms remain unclear. This study investigated the impact of mating on expression of olfaction-related genes in the agricultural pest Helicoverpa armigera through transcriptome sequencing and qPCR analysis of the gene expression in antennae， labial palp， and proboscis of mated and virgin males and females. The results revealed significant changes in the expression levels of certain numbers of olfactory genes across tissues， indicating that such expression changes may lead to the changes of olfactory perception and behavior associated with mating. This research provides a molecular-level insight into the effects of mating on olfaction in H.armigera， laying a foundation for further exploration of olfactory plasticity and regulatory mechanisms.

Key words

Helicoverpa armigera;" mating;" transcriptome sequencing;" olfaction-related gene;" expression profile

嗅覺在昆蟲識別寄主植物、選擇產(chǎn)卵地點、選擇配偶以及躲避捕食者等行為中發(fā)揮了重要的功能［1］。在復(fù)雜的環(huán)境中， 嗅覺能夠準確地對氣味信號做出反應(yīng)， 進而調(diào)節(jié)昆蟲的行為， 昆蟲的嗅覺系統(tǒng)靈敏且高效， 因此是一個很好的探索昆蟲感受機制的模型系統(tǒng)［2］。針對昆蟲的嗅覺行為， 利用昆蟲性信息素和植物揮發(fā)物等氣味物質(zhì)， 研究者開發(fā)出性誘劑、食誘劑、迷向劑等對昆蟲進行誘殺和行為調(diào)控， 以達到防控害蟲的目的［3］。由于蛾類嗅覺系統(tǒng)具有高度特異性， 目前各類性誘劑和食誘劑已被大規(guī)模使用在蛾類的防治上［4］。

由于昆蟲嗅覺感受的重要性， 學(xué)者對昆蟲的嗅覺感受機制已有深入研究。觸角是昆蟲的主要嗅覺感受器官， 其表面有很多不同種類的嗅覺感受器， 這些嗅覺感受器中都有一個或多個嗅覺感受神經(jīng)元（olfactory sensing neuron， OSN）［5］。當(dāng)昆蟲來到一個富含化學(xué)信號的環(huán)境中時， 環(huán)境中的氣味分子會從觸角嗅覺感受器表面的微孔進入感受器， 隨后被可溶性小分子蛋白，氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein， OBP）和化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein， CSP）結(jié)合， 并傳送到OSN的樹突膜上。膜上的氣味受體（odorant receptor， OR）和離子型受體（ionotropic receptor， IR）與氣味分子結(jié)合后引起樹突膜的電位改變激活OSN［67］。OSN被激活后將電信號傳送至腦部的觸角葉（antennal lobe， AL）中， 信號在AL中進行加工和整合后再傳遞到高級神經(jīng)中樞蘑菇體（mushroom body）和側(cè)角葉（lateral horn）上。隨后高級嗅覺中樞再對投射來的信號進行整合處理后傳至下行神經(jīng)元（descending neuron）， 通過下行神經(jīng)元傳導(dǎo)至腹神經(jīng)索， 使得昆蟲對該化學(xué)信號進行相應(yīng)的行為表達［811］。在整個信號傳導(dǎo)過程中， 昆蟲的神經(jīng)遞質(zhì)（neurotransmitter）和神經(jīng)肽（neuropeptide）作為廣泛分布于昆蟲神經(jīng)組織中的物質(zhì)， 同樣也參與了昆蟲嗅覺信號傳導(dǎo)中的中樞神經(jīng)傳導(dǎo)過程［9，12］。

昆蟲的嗅覺感受并不是一成不變的， 會隨著昆蟲生理狀態(tài)的變化而改變。研究證明， 昆蟲的取食狀態(tài)、日齡、交配狀態(tài)以及節(jié)律狀態(tài)等都會對昆蟲的嗅覺行為和嗅覺感受的靈敏性產(chǎn)生影響［1314］。小地老虎Agrotis ipsilon對性信息素的感受會隨著日齡的改變而改變， 0～2日齡的小地老虎對性信息素幾乎沒有反應(yīng)， 而只有3日齡的雄蛾會在風(fēng)洞中產(chǎn)生逆風(fēng)飛翔等行為［15］。岡比亞按蚊Anopheles gambiae在饑餓狀態(tài)下對寄主氣味更為敏感， 而取食后對寄主氣味的敏感度降低， 并更容易被適合產(chǎn)卵的氣味所吸引［16］。昆蟲的嗅覺感受出現(xiàn)上述改變， 是因為昆蟲的嗅覺感受系統(tǒng)在外周和中樞神經(jīng)水平發(fā)生了相應(yīng)變化。外周神經(jīng)水平上各類嗅覺感受基因的表達水平， 以及中樞神經(jīng)水平上激素、神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)的改變等都會引起昆蟲嗅覺行為的變化［17］。岡比亞按蚊在吸食血液后， AgOR1的表達量下降， 這使得岡比亞按蚊對人類氣味的敏感度下降［18］。在果蠅中， 胰島素受體基因與OR83b基因在嗅覺神經(jīng)中共表達， 當(dāng)果蠅處于飽腹?fàn)顟B(tài)時， 高濃度的胰島素會使胰島素受體抑制短神經(jīng)肽F， 在果蠅饑餓狀態(tài)時， 低濃度的胰島素使得胰島素受體對短神經(jīng)肽F的抑制效果減弱， 短神經(jīng)肽F的表達量上調(diào)， 使得昆蟲的嗅覺神經(jīng)更加靈敏， 從而更加趨向于尋找食物［19］。

交配是昆蟲繁衍最重要的環(huán)節(jié)， 良好的交配狀態(tài)能提高繁衍效率。昆蟲的嗅覺會受到交配狀態(tài)的顯著影響，交配后嗅覺行為出現(xiàn)了明顯的改變已在多種昆蟲中被報道。如葡萄根透翅蛾Vitacea polistiformis雄蛾在交配后對性信息素和性信息素混合物的觸角電位反應(yīng)相比未交配雄蛾顯著下降［20］;

杏仁油揮發(fā)物吸引交配后的臍橙螟蛾Amyelois transitella雌蛾，而對未交配雌蛾沒有吸引效果［21］。關(guān)于交配影響嗅覺感受的機制研究較少，交配后小菜蛾P(guān)lutella xylostella雄蛾的性信息素結(jié)合蛋白1基因（PxylPBP1）表達量顯著上升；馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus雌蛾在交配后， 多個OR和OBP基因表達量上升［2223］。以上研究說明，交配后嗅覺相關(guān)基因的表達發(fā)生變化，導(dǎo)致其與未交配昆蟲嗅覺的差異。

棉鈴蟲Helicoverpa armigera是一種雜食性的世界農(nóng)業(yè)害蟲，其幼蟲可以取食棉花、番茄、玉米等120種植物，造成嚴重經(jīng)濟損失［2425］。本研究團隊前期已對棉鈴蟲識別性信息素、寄主植物揮發(fā)物和產(chǎn)卵信息素的機制進行了深入研究［2628］。本研究通過對交配與未交配棉鈴蟲雌雄蛾觸角、喙和下唇須轉(zhuǎn)錄組進行分析， 發(fā)掘交配前后差異表達的基因，為從分子水平上解析交配對棉鈴蟲嗅覺的影響奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 供試昆蟲

供試棉鈴蟲來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所昆蟲功能基因組， 1996年采集于河南省新鄉(xiāng)市。幼蟲以人工飼料飼養(yǎng)， 成蟲喂食7%的糖水。幼蟲和成蟲飼養(yǎng)環(huán)境均為溫度（27±1）℃， 濕度（60±5）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。從棉鈴蟲蛹期起將雌雄蛹分開飼養(yǎng)， 避免雌雄蛾提前接觸性信息素。

1.2" 組織的收集

雌雄蛾羽化后于2日齡暗期進行1∶1配對處理。雌雄蛾各取1頭放入小罐中， 罐中放入一塊吸取7%糖水的脫脂棉， 用紗布將罐口遮蓋， 放置于（27±1）℃， 相對濕度（60±5）%的暗室中進行交配。每隔30 min觀察并記錄1次交配情況， 交配結(jié)束后將雌雄蛾取出分別放入玻璃管中，立即收集雌雄蛾觸角、喙和下唇須， 用液氮冷凍， 放置－80℃冰箱保存。未做交配處理的雌雄蛾也于2日齡進入暗期6 h后， 分別收集觸角、喙和下唇須放至離心管中， 用液氮冷凍， 放置－80℃冰箱保存。

1.3" 總RNA提取

將冷凍保存的雌雄蛾觸角、喙和下唇須放入研缽中， 加入液氮研磨，然后加入1 mL TRIzol試劑， 按照說明書提取總RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）檢測RNA濃度、RNA完整性（RNA integrity number， RIN）， 使用紫外分光光度計NanoDrop測定RNA純度。

1.4" cDNA文庫構(gòu)建與測序

用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片斷化，以打斷后的mRNA為模板合成cDNA第一鏈，然后配制第二鏈合成反應(yīng)體系合成cDNA第二鏈，并使用試劑盒純化回收、黏性末端修復(fù)、cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增;構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢。合格后，使用Illumina NovaSeq 6000平臺測序，測序策略為PE150，所得的原始數(shù)據(jù)為raw reads。文庫構(gòu)建與測序委托北京優(yōu)吉科技有限公司完成。

1.5" 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)過濾和基因表達量分析

使用過濾軟件SOAPnuk過濾掉低質(zhì)量（質(zhì)量值低于15的堿基占該reads總堿基數(shù)的比例大于20%的reads）、接頭污染以及未知堿基N含量過高（含量大于10%）的reads， 得到clean reads， 保存為FASTQ格式［29］。使用 Bowtie2［30］（http：∥bowtie-bio.sourceforge.net/Bowtie2/index.shtml）將clean reads比對到已發(fā)表的棉鈴蟲基因組（基因組版本HaSCD2： GCF 023701775.1）， 之后再使用RSEM［31］ （http：∥deweylab.biostat.wisc.edu/RSEM）計算基因的轉(zhuǎn)錄水平， 得到FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）值。

1.6" 差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）的GO功能注釋

計算所有候選基因的FPKM值， 隨后使用DEseq2， 算法根據(jù)Michael I［32］ 中描述的方法進行，采用差異倍數(shù)在2倍及以上且P校正≤0.05來篩選差異表達基因，得到DEGlist。

得到差異表達基因后，利用GO （gene ontology）數(shù)據(jù)庫， 從細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）方面對上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因進行GO功能注釋［33］。

1.7" 嗅覺相關(guān)基因差異表達分析

從NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載HaSCD2基因組的基因序列構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫。HaSCD2基因組中共有66個OR基因， 19個IR基因， 35個OBP基因， 35個CSP基因， 2個感受神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane protein， SNMP）基因。使用R語言中的pheatmap包對

1.5獲得的全部嗅覺相關(guān)基因在共計12組樣品的表達量信息log2（FPKM+1）

，繪制成熱圖， 并結(jié)合1.6中得到的差異表達嗅覺基因， 對全部差異表達的嗅覺基因在交配與未交配的觸角、喙和下唇須組織中的表達情況進行系統(tǒng)分析。

1.8" 實時熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）檢測1.7中篩選出的差異表達基因在觸角、喙以及下唇須中的相對表達量。采用1.3中的方法提取交配與未交配棉鈴蟲雌雄蛾觸角、喙以及下唇須的RNA， 并使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金， 中國）合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄確保在無RNase的條件下進行。以cDNA作為qPCR的模板。內(nèi)參基因選取HarmActin。利用在線網(wǎng)站NCBI設(shè)計特異性引物， 引物序列見表1。按照5倍稀釋的方法將不同組織的cDNA模板進行梯度稀釋，繪制標(biāo)準曲線， 檢測引物的特異性和擴增效率。使用PerfectStart Green qPCR SuperMix（全式金， 中國）試劑盒并根據(jù)說明書進行熒光定量PCR， 反應(yīng)體系（20 μL）： 10 μL 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix， 10 μmol/L上、下游引物各 0.5 μL， cDNA模板1 μL， 8 μL 無酶水。反應(yīng)程序為：95℃ 2 min;95℃ 10 s， 60℃ 30 s，40個循環(huán)。試驗用3組不同批次的RNA進行生物學(xué)重復(fù)，每次進行3組技術(shù)重復(fù)。相對表達量利用2-ΔΔCT方法計算。使用t測驗對每個嗅覺感受基因在交配前后各組織中的相對表達量進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 9軟件完成。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 轉(zhuǎn)錄組概況

使用Illumina NovaSeq 6000平臺對交配與未交配棉鈴蟲雌雄蛾的觸角、喙和下唇須共計12組樣品（MF-An：交配后雌蛾觸角;MF-LP：交配后雌蛾下唇須;MF-P：交配后雌蛾喙;VF-An：未交配雌蛾觸角;VF-LP：未交配雌蛾下唇須;VF-P：未交配雌蛾喙;MM-An：交配后雄蛾觸角;MM-LP：交配后雄蛾下唇須;MM-P：交配后雄蛾喙;VM-An：未交配雄蛾觸角;VM-LP：未交配雄蛾下唇須;VM-P：未交配雄蛾喙）進行轉(zhuǎn)錄組測序，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)，共計測序36個樣品，每個樣品平均產(chǎn)出66.43 M數(shù)據(jù)。去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，每個樣品平均產(chǎn)出63.57 M clean reads數(shù)據(jù)。Reads質(zhì)量分值為Q20和Q30時，質(zhì)量合格的reads比例分別高于97.85%和93.06%（表2）。

1） MF-An： 交配后雌蛾觸角;MF-LP： 交配后雌蛾下唇須;MF-P： 交配后雌蛾喙;VF-An： 未交配雌蛾觸角;VF-LP： 未交配雌蛾下唇須;VF-P： 未交配雌蛾喙;MM-An： 交配后雄蛾觸角;MM-LP： 交配后雄蛾下唇須;MM-P： 交配后雄蛾喙;VM-An： 未交配雄蛾觸角;VM-LP： 未交配雄蛾下唇須;VM-P： 未交配雄蛾喙。

MF-An： Antennae of mated female moths; MF-LP： Labial palp of mated female moths; MF-P： Proboscis of mated female moths; VF-An： Antennae of virgin female moths; VF-LP： Labial palp of virgin female moths; VF-P： Proboscis of virgin female moths; MM-An： Antennae of mated male moths; MM-LP： Labial palp of mated male moths; MM-P： Proboscis of mated male moths; VM-An： Antennae of virgin male moths; VM-LP： Labial palp of virgin male moths; VM-P： Proboscis of virgin male moths.

2.2" 差異表達基因數(shù)量分析

對交配與未交配的棉鈴蟲雌雄蛾觸角、下唇須和喙進行差異表達基因分析， 以初步研究交配對這3個組織中基因表達的影響。棉鈴蟲基因組共有18 668個基因， 一共檢測到15 608個基因表達， 占全部基因數(shù)量的83.6%。各個樣品中檢測到的差異表達基因數(shù)量見圖1。分析結(jié)果顯示，雌蛾觸角中差異表達基因共有205個， 其中交配后上調(diào)的基因112個， 交配后下調(diào)的基因93個;在雄蛾觸角中發(fā)現(xiàn)差異表達基因共164個， 其中交配后上調(diào)的基因49個， 交配后下調(diào)的基因115個。在雌蛾下唇須中發(fā)現(xiàn)差異表達基因共348個， 其中交配后上調(diào)的基因163個， 交配后下調(diào)的基因185個;在雄蛾下唇須中發(fā)現(xiàn)差異表達基因共273個， 其中交配后上調(diào)的基因104個， 交配后下調(diào)的基因169個。在雌蛾喙中發(fā)現(xiàn)差異表達基因共290個， 其中交配后上調(diào)的基因162個， 交配后下調(diào)的基因128個;在雄蛾喙中發(fā)現(xiàn)差異表達基因共201個， 其中交配后上調(diào)的基因61個， 交配后下調(diào)的基因140個。

2.3" 差異表達基因的GO功能注釋

對棉鈴蟲雌雄蛾交配前后的觸角、喙和下唇須中得到的差異表達基因進行GO功能分類以及富集分析。在交配與未交配雌蛾觸角差異表達的205個基因的GO注釋中， 生物過程中的代謝過程（18）， 細胞過程（16）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中的膜（39）和膜組分（39）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中的催化活性（53）和結(jié)合（40）注釋到的基因數(shù)量最多。在交配與未交配雄蛾觸角差異表達的164個基因中， 生物過程中的細胞過程（19）， 代謝過程（19）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中的膜（32），膜組分（31）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中的催化活性（31）， 結(jié)合（31）注釋到的基因數(shù)量最多。

在交配與未交配雌蛾下唇須差異表達的348個基因中， 生物過程中的細胞過程（49）和代謝過程（44）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中的膜（69）

和膜組分（66）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中的催化活性（81）和結(jié)合（70）注釋到的

基因數(shù)量

最多。在交配與未交配雄蛾下唇須差異表達的273個基因中， 生物過程中的細胞過程（41）和代謝過程（37）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中的膜（62）和膜組分（60）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中的催化活性（63）和結(jié)合（56）注釋到的基因數(shù)量最多。

在交配與未交配雌蛾喙差異表達的290個基因中，生物過程中，細胞過程（37）以及代謝過程（39）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中，膜（53）以及膜組分（53）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中，催化活性（75）以及結(jié)合（49）注釋到的基因數(shù)量最多。在交配與未交配雄蛾喙差異表達的201個基因中，生物過程中的細胞過程（19）以及代謝過程（25）注釋到的基因數(shù)量最多;細胞組分中膜（42）以及膜組分（40）注釋到的基因數(shù)量最多;分子功能中，催化活性（43）以及結(jié)合（34）注釋到的基因數(shù)量最多。

2.4" 交配與未交配棉鈴蟲各組織中嗅覺相關(guān)的差異表達基因分析

2.4.1" 交配對棉鈴蟲ORs基因表達的影響

對棉鈴蟲基因組中的66個OR基因在交配前后雌雄蛾觸角、喙和下唇須中的表達情況進行了分析。結(jié)果（圖3）顯示， 3個組織中共檢測到65個OR基因的表達。其中大部分OR基因在觸角中高表達，未發(fā)現(xiàn)在下唇須和喙中特異表達或高表達的OR基因。HarmOrco的表達量最高，并且在雌雄蛾觸角中無差異。已報道的性信息素受體基因：HarmOR11、HarmOR13、HarmOR14、HarmOR14.2均在雄蛾觸角中高表達。HarmOR21.2、HarmOR29、HarmOR39、HarmOR45等在雌蛾觸角中表達量較高。對交配與未交配棉鈴蟲觸角中OR基因的表達量進行比較，發(fā)現(xiàn)少數(shù)基因在兩組樣品中表達量有差異。如HarmOR11在未交配雄蛾觸角中FPKM為108.36， 在交配雄蛾觸角中FPKM為79.14;HarmOR21在未交配雄蛾觸角中FPKM為9.2， 在交配雄蛾觸角中FPKM為6.33;HarmOR46在未交配雌蛾觸角中FPKM為6.77， 在交配雌蛾觸角中FPKM為9.62。但這些基因的表達均未達到顯著差異的水平。綜上，我們在雌雄蛾的觸角中均未發(fā)現(xiàn)受交配狀態(tài)顯著影響的OR基因。

2.4.2" 交配對棉鈴蟲IR基因表達的影響

對棉鈴蟲基因組中的19個IR基因在交配前后雌雄蛾觸角、喙和下唇須中的表達情況進行了分析。結(jié)果（圖4）顯示，3個組織中共檢測到17個IR基因的表達，2個IR基因HarmIR8a和HarmIR25a在觸角中均高表達， 并且HarmIR25a在下唇須中表達量也較高。此外， 我們還發(fā)現(xiàn)1個IR基因HarmIR76b在喙中高表達。比較交配與未交配棉鈴蟲下唇須中IR基因的表達量， 發(fā)現(xiàn)大部分IR基因的表達不受交配狀態(tài)影響， 僅在雄蛾的下唇須中發(fā)現(xiàn)1個IR基因HarmIR75q.2表達量在交配后下調(diào)。

2.4.3" 交配對棉鈴蟲OBP基因表達的影響

對棉鈴蟲基因組中的35個OBP基因在交配前后雌雄蛾觸角、喙和下唇須中的表達情況進行了分析。結(jié)果（圖5）表明，3個組織中共檢測到26個OBP基因的表達。在雌蛾觸角中HarmOBP14表達量在交配后下調(diào);在雌蛾下唇須中HarmOBP7.2、HarmOBP13、HarmOBP15的表達量在交配后上調(diào)， HarmOBP14表達量在交配后下調(diào);雌蛾喙中HarmOBP14表達量在交配后上調(diào)， HarmOBP17表達量在交配后下調(diào);在雄蛾觸角中HarmOBP3、HarmOPB4、HarmOBP14、HarmOBP26表達量在交配后下調(diào);在雄蛾下唇須中HarmOBP14表達量在交配后下調(diào)。

2.4.4" 交配對棉鈴蟲CSP基因表達的影響

對棉鈴蟲基因組中的35個CSP基因在交配前后雌雄蛾觸角、喙和下唇須中的表達情況進行了分析。結(jié)果（圖6）顯示，3個組織中共檢測到15個CSP基因的表達，除了HarmCSP18.1和HarmCSP10， 其余13個CSP基因在棉鈴蟲的觸角、喙和下唇須中均高表達， 隨后我們對交配與未交配CSP基因的表達量進行比較， 在雌雄蛾的觸角、喙和下唇須中均未發(fā)現(xiàn)受交配狀態(tài)影響的CSP基因。

2.4.5" 交配對棉鈴蟲SNMP基因表達的影響

對棉鈴蟲基因組中的2個SNMP基因在交配前后雌雄蛾觸角、喙和下唇須中的表達情況進行了分析。結(jié)果（圖7）顯示，與棉鈴蟲嗅覺相關(guān)的HarmSNMP1

在觸角和下唇須中高表達，HarmSNMP2在觸角、喙和下唇須中均為高表達。比較交配與未交配棉鈴蟲SNMP基因的表達量， 我們發(fā)現(xiàn)， 雌蛾喙中HarmSNMP2表達量在交配后上調(diào)， 而參與嗅覺感受的HarmSNMP1并沒有差異表達。

2.5" 交配與未交配棉鈴蟲各組織中嗅覺相關(guān)差異表達基因表達量的qPCR驗證

根據(jù)2.4中得到的差異表達基因， 選擇部分差異表達基因進行了qPCR驗證。結(jié)果表明， HarmOBP3和HarmOBP4在交配后的雄蛾觸角中相對表達量顯著下調(diào);HarmOBP7.2在交配后的雌蛾下唇須中相對表達量顯著上調(diào);HarmOBP13

在交配后的雌蛾下唇須中相對表達量顯著上調(diào)；

HarmOBP14在交配后的雌雄蛾觸角和下唇須中相對表達量均顯著下調(diào)， 在交配后的雌蛾喙中相對表達量顯著上調(diào);HarmOBP15在交配后的雌蛾下唇須中相對表達量顯著上調(diào);HarmOBP17在交配后的雌蛾喙中相對表達量顯著上調(diào);HarmSNMP2在交配后的雌蛾喙中相對表達量顯著上調(diào);HarmIR75q.2在交配后的雄蛾下唇須中相對表達量顯著下調(diào)。HarmOBP14在雌雄蛾觸角、下唇須和喙中均有較高的表達量， 而其他嗅覺基因主要在觸角中高表達， 盡管

HarmOBP7.2、HarmOBP13、HarmOBP15、和HarmOBP17在下唇須或喙中的表達量出現(xiàn)顯著差異， 但在下唇須和喙中的表達量極低， 這一結(jié)果同樣與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本對應(yīng)， 說明這些嗅覺表達基因主要是在觸角中發(fā)揮作用（圖8）。

3" 結(jié)論與討論

本研究通過對棉鈴蟲雌雄蛾觸角、喙和下唇須的轉(zhuǎn)錄組進行測序， 對交配前后差異表達的基因進行分析并對部分嗅覺相關(guān)的差異表達基因進行qPCR驗證， 發(fā)現(xiàn)交配前后雌雄蛾各組織中， 有很多基因表達量發(fā)生了上調(diào)或者下調(diào)。以往的研究表明， 交配對昆蟲的影響是多樣且豐富的， 荔枝蒂蛀蛾Conopomorpha sinensis雌蛾交配與否會影響到卵巢發(fā)育狀態(tài)［34］;海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis交配與未交配雌蛾的壽命也不相同， 未交配雌蛾的平均壽命比交配過的雌蛾壽命長［35］。交配不僅影響昆蟲的發(fā)育， 也影響神經(jīng)肽與相關(guān)基因的表達水平， 小地老虎雄蟲在交配后， 其觸角葉中與神經(jīng)肽相關(guān)的基因表達量會產(chǎn)生變化［17］。以上研究表明， 交配與否對昆蟲的生理狀態(tài)有著多方面的影響， 本研究也驗證了棉鈴蟲交配前后， 觸角、喙和下唇須中有大量基因的表達量發(fā)生了變化， 這些基因的功能涉及不同的生理過程， 說明交配對棉鈴蟲生理狀態(tài)的改變具有全局性的影響。

本研究分析了交配與未交配兩種狀態(tài)的棉鈴蟲觸角、喙和下唇須中OR、IR、OBP、CSP和SNMP基因的表達差異，并從轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中選取9個差異表達的基因進行qPCR驗證，除HarmOBP17的qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果不同以外，其余8個

基因的qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析

結(jié)果一致，進一步說明棉鈴蟲交配狀態(tài)的改變會影響嗅覺相關(guān)基因的表達。根據(jù)分析結(jié)果我們篩選出10個嗅覺相關(guān)基因在交配前后表達量有明顯差異，其中OBP差異表達基因數(shù)量最多。OBP是昆蟲嗅覺識別過程中的一類重要輔助蛋白，其與脂溶性氣味分子結(jié)合將其運輸至神經(jīng)元膜上的OR上，最終激活OR［36］。已有研究證明，多個OBP在棉鈴蟲性信息素和植物揮發(fā)物的識別過程中發(fā)揮了重要作用［3740］。本研究中HarmOBP14在交配后的雌蛾和雄蛾觸角和下唇須中表達量均出現(xiàn)明顯下降，暗示這個OBP可能直接參與棉鈴蟲的交配過程，交配完成后該基因不再發(fā)揮作用，因此在這2個組織中均表達量下降。其他在交配后表達下降的OBP基因推測也可能發(fā)揮類似的功能。HarmOBP14在交配后雌蛾喙中表達量上升，暗示該基因在喙中發(fā)揮特殊的功能。與雄蛾不同，雌蛾在交配后還要完成產(chǎn)卵行為，我們在雌蛾下唇須中發(fā)現(xiàn)多個OBP基因在交配后表達量上升，暗示這些OBP可能參與交配后雌蛾的覓食、產(chǎn)卵等生命活動。

此外還有1個IR和1個SNMP基因的表達水平在棉鈴蟲交配前后有顯著差異。IR已被證明是昆蟲識別酸胺類物質(zhì)的關(guān)鍵受體，蛾類下唇須是感受酸胺類化合物的主要器官，本研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲雄蛾的下唇須中HarmIR75q.2的表達量在交配后下調(diào)，推測HarmIR75q.2可能參與棉鈴蟲對酸胺類物質(zhì)的感受［4143］。在雌蛾喙中發(fā)現(xiàn)HarmSNMP2的表達量在交配后上調(diào)，與HarmSNMP1參與性信息素感受不同，HarmSNMP2的功能很多，雖然HarmSNMP2未參與棉鈴蟲性信息素識別，但是HarmSNMP2作為跨膜蛋白，能夠協(xié)助運輸親脂性分子［40］，該蛋白的功能及其在交配中的具體功能有待進一步驗證。雖然我們發(fā)現(xiàn)了少量OR基因在觸角中的表達量會在交配后發(fā)生變化，但并沒有顯著差異。OR作為一類膜蛋白表達量變化相應(yīng)較慢，由于我們是在交配完成后立即檢測基因表達變化，如果等待更長時間再進行檢測，有可能發(fā)現(xiàn)OR基因表達量有更顯著的變化。

通過轉(zhuǎn)錄組分析和qPCR驗證試驗，我們發(fā)現(xiàn)OBP、SNMP和IR等嗅覺相關(guān)基因的表達受到交配行為的影響，這些基因的差異表達可能會造成交配后棉鈴蟲行為的改變。據(jù)報道，一些神經(jīng)肽如胰島素相關(guān)肽（insulin related peptide）和能量肽（CAPA）等也參與調(diào)控了小地老虎交配相關(guān)的嗅覺行為變化［17］，小地老虎雄蟲交配后，觸角葉處的神經(jīng)元快速抑制雄蟲對性信息素的敏感性，從而影響昆蟲的嗅覺行為［4445］。棉鈴蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)受交配狀態(tài)影響的具體作用機制還有待進一步研究。

參考文獻

［1］" MUSTAPARTA H. Chemical information processing in the olfactory system of insects ［J］. Physiological Reviews， 1990， 70（1）： 199245.

［2］" LIU Yang， GU Shaohua， ZHANG Yongjun， et al. Candidate olfaction genes identified within the Helicoverpa armigera antennal transcriptome ［J/OL］. PLoS ONE， 2012， 7（10）： e48260. DOI： 10.1371/journal.pone.0048260.

［3］" WITZGALL P， KIRSCH P， CORK A. Sex pheromones and their impact on pest management ［J］. Journal of Chemical Ecology， 2010， 36（1）： 80100.

［4］" DE BRUYNE M， BAKER T C. Odor detection in insects： Volatile codes ［J］. Journal of Chemical Ecology， 2008， 34（7）： 882897.

［5］" LEAL W S. Odorant reception in insects： Roles of receptors， binding proteins， and degrading enzymes ［J］. Annual Review of Entomology， 2013， 58（1）： 373391.

［6］" RTZLER M， ZWIEBEL L. Molecular biology of insect olfaction： Recent progress and conceptual models ［J］. Journal of Comparative Physiology A， 2005， 191（9）： 777790.

［7］" SATO K， TOUHARA K. Insect olfaction： Receptors， signal transduction， and behavior ［M］∥KORSCHING S， MEYERHOF W. Chemosensory systems in mammals， fishes， and insects： vol 47. Berlin， Heidelberg： Springer Berlin Heidelberg， 2008： 203220.

［8］" SU C Y， MENUZ K， CARLSON J R. Olfactory perception： Receptors， cells， and circuits ［J］. Cell， 2009， 139（1）： 4559.

［9］" WILSON R I. Early olfactory processing in Drosophila： Mechanisms and principles ［J］. Annual Review of Neuroscience， 2013， 36（1）： 217241.

［10］RUTA V， DATTA S R， VASCONCELOS M L， et al. A dimorphic pheromone circuit in Drosophila from sensory input to descending output ［J］. Nature， 2010， 468（7324）： 686690.

［11］BATES A S， SCHLEGEL P， ROBERTS R J V， et al. Complete connectomic reconstruction of olfactory projection neurons in the fly brain ［J］. Current Biology， 2020， 30（16）： 31833199.

［12］WILSON R I. Early olfactory processing in Drosophila： Mechanisms and principles ［J］. Annual Review of Neuroscience， 2013， 36： 217241.

［12］VOSSHALL L B. Olfaction in Drosophila ［J］. Current Opinion in Neurobiology， 2000， 10（4）： 498503.

［13］ADDESSO K M， MCAUSLANE H J. Pepper weevil attraction to volatiles from host and nonhost plants ［J］. Environmental Entomology， 2009， 38（1）： 216224.

［14］YADAV P， BORGES R M. Why resource history matters： Age and oviposition history affect oviposition behaviour in exploiters of a mutualism ［J］. Ecological Entomology， 2018， 43（4）： 473482.

［15］GADENNE C， RENOU M， SRENG L. Hormonal control of pheromone responsiveness in the male black cutworm Agrotis ipsilon ［J］. Experientia， 1993， 49（8）： 721724.

［16］KLOWDEN M J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior ［J］. Experientia， 1990， 46（7）： 660670.

［17］DIESNER M， GALLOT A， BINZ H， et al. Mating-induced differential peptidomics of neuropeptides and protein hormones in Agrotis ipsilon moths ［J］. Journal of Proteome Research， 2018， 17（4）： 13971414.

［18］FOX A N， PITTS R J， ROBERTSON H M， et al. Candidate odorant receptors from the malaria vector mosquito Anopheles gambiae and evidence of down-regulation in response to blood feeding ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2001， 98（25）： 1469314697.

［19］ROOT C M， KO K I， JAFARI A， et al. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search ［J］. Cell， 2011， 145（1）： 133144.

［20］PEARSON G A， SCHAL C. Electroantennogram responses of both sexes of grape root borer （Lepidoptera： Sesiidae） to synthetic female sex pheromone ［J］. Environmental Entomology， 1999， 28（6）： 943946.

［21］PHELAN P L， BAKER T C. An attracticide for control of Amyelois transitella （Lepidoptera： Pyralidae） in almonds ［J］. Journal of Economic Entomology， 1987， 80（4）： 779783.

［22］ZHANG Zhichun， WANG Manqun， ZHANG Guoan. Molecular cloning and expression of pheromone-binding protein 1 from the diamondback moth， Plutella xylostella ［J］. Entomologia Experimentalis et Applicata， 2009， 133（2）： 136145.

［23］ZHANG Sufang， ZHANG Zhen， KONG Xiangbo， et al. Dynamic changes in chemosensory gene expression during the Dendrolimus punctatus mating process ［J/OL］. Frontiers in Physiology， 2018， 8： 1127. DOI：10.3389/fphys.2017.01127.

［24］FIREMPONG S， ZALUCKI M. Host plant preferences of populations of Helicoverpa armigera （Hübner） （Lepidoptera， Noctuidae） from different geographic locations ［J/OL］. Australian Journal of Zoology， 1989， 37（6）： 665. DOI：10.1071/ZO9890665.

［25］郭予元. 棉鈴蟲的研究［M］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

［26］LIU Yang， LIU Chengcheng， LIN Kejian， et al. Functional specificity of sex pheromone receptors in the cotton bollworm Helicoverpa armigera ［J/OL］. PLoS ONE， 2013， 8（4）： e62094. DOI： 10.1371/journal.pone.0062094.

［27］GUO Mengbo， DU Lixiao， CHEN Qiuyan， et al. Odorant receptors for detecting flowering plant cues are functionally conserved across moths and butterflies ［J］. Molecular Biology and Evolution， 2021， 38（4）： 14131427.

［28］ZHANG Xiaxuan， LIU Yang， GUO Mengbo， et al. A female-specific odorant receptor mediates oviposition deterrence in the moth Helicoverpa armigera ［J］. Current Biology， 2024， 34（1）： 111.

［29］COCK P J A， FIELDS C J， GOTO N， et al. The sanger FASTQ file format for sequences with quality scores， and the Solexa/Illumina FASTQ variants ［J］. Nucleic Acids Research， 2010， 38（6）： 17671771.

［30］LANGMEAD B， SALZBERG S L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 ［J］. Nature Methods， 2012， 9（4）： 357359.

［31］LI Bo， DEWEY C N. RSEM： Accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome ［J/OL］. BMC Bioinformatics， 2011， 12（1）： 323. DOI：10.1186/1471-2105-12-323.

［32］LOVE M I， HUBER W， ANDERS S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 ［J/OL］. Genome Biology， 2014， 15（12）： 550. DOI：10.1186/s13059-014-0550-8.

［33］GENE ONTOLOGY CONSORTIUM. Gene ontology consortium： Going forward ［J］. Nucleic Acids Research， 2015， 43： D1049D1056.

［34］李文景， 董易之， 姚瓊， 等. 荔枝蒂蛀蟲交配對卵巢發(fā)育及繁殖力的影響［J］. 昆蟲學(xué)報， 2023， 66（7）： 925933.

［35］ELLIS P E， STEELE G. The effects of delayed mating on the fecundity of females of Spodoptera littoralis （Boisduval） （Lepidoptera： Noctuidae） ［J］. Bulletin of Entomological Research， 1982， 72（2）： 295302.

［36］游靈， 王廣利， 魏洪義. 昆蟲嗅覺信號神經(jīng)傳遞途徑的研究進展［J］. 生物災(zāi)害科學(xué)， 2012， 35（1）： 711.

［37］ZHANG Tiantao， MEI Xiangdong， FENG Jinian， et al. Characterization of three pheromone-binding proteins （PBPs） of Helicoverpa armigera （Hübner） and their binding properties ［J］. Journal of Insect Physiology， 2012， 58（7）： 941948.

［38］DONG Kun， DUAN Hongxia， LIU Jingtao， et al. Key site residues of pheromone-binding protein 1 involved in interacting with sex pheromone components of Helicoverpa armigera ［J/OL］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 16859. DOI：10.1038/s41598-017-17050-5.

［39］YE Zhanfeng， LIU Xiaolong， HAN Qi， et al. Functional characterization of PBP1 gene in Helicoverpa armigera （Lepidoptera： Noctuidae） by using the CRISPR/Cas9 system ［J/OL］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 8470. DOI：10.1038/s41598-017-08769-2.

［40］DONG Kun， SUN Liang， LIU Jingtao， et al. RNAi-induced electrophysiological and behavioral changes reveal two pheromone binding proteins of Helicoverpa armigera involved in the perception of the main sex pheromone component Z11-16：Ald ［J］. Journal of Chemical Ecology， 2017， 43（2）： 207214.

［41］YAO C A， IGNELL R， CARLSON J R. Chemosensory coding by neurons in the coeloconic sensilla of the Drosophila antenna ［J］. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2005， 25（37）： 83598367.

［42］BENTON R， VANNICE K S， GOMEZ-DIAZ C， et al. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila ［J］. Cell， 2009， 136（1）： 149162.

［43］AI M， MIN S， GROSJEAN Y， et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system ［J］. Nature， 2010， 468（7324）： 691695.

［44］BARROZO R B， GADENNE C， ANTON S. Switching attraction to inhibition： Mating-induced reversed role of sex pheromone in an insect ［J］. Journal of Experimental Biology， 2010， 213（17）： 29332939.

［45］GADENNE C， DUFOUR M C， ANTON S. Transient post-mating inhibition of behavioural and central nervous responses to sex pheromone in an insect ［J］. Proceedings of the Royal Society of London. Series B： Biological Sciences， 2001， 268（1476）： 16311635.

（責(zé)任編輯：楊明麗）