利用冷凍電子斷層掃描技術探究超聲對紅細胞膜的影響

關鍵詞 紅細胞膜；超聲；冷凍電子斷層掃描

超聲波技術已成為現代生物醫學的強大工具，為臨床診斷和治療提供了一種非侵入性方法，能夠深入組織并與細胞結構相互作用，在成像、靶向藥物輸送、基因治療甚至組織工程領域廣泛應用[1-3]。超聲波對生物組織的影響主要通過機械力介導，例如剪切應力和空化效應[4-6]，這些影響取決于超聲處理的參數，包括頻率、功率和持續時間，因此，了解超聲波對細胞膜的具體影響至關重要[7-8]。

人紅細胞因其簡單的結構與高度專業化的功能，是研究最多的細胞類型之一。紅細胞膜由磷脂雙分子層及膜蛋白組成，并由細胞骨架蛋白網絡支撐，這對于維持細胞的靈活性和結構完整性至關重要[9-12]。超聲治療過程中引起的細胞膜結構破壞會導致細胞膜嚴重的功能障礙，包括變形能力下降和膜通透性改變等[13-16]。因此，研究超聲波對紅細胞膜的影響不僅有助于了解治療性超聲波應用中的潛在風險，而且對于探索操縱細胞膜用于治療目的的新方法非常重要[13]。

除了紅細胞外，脂質體也是超聲研究中的重要模型體系。脂質體作為一種模仿生物膜結構的納米載體，被廣泛用作藥物輸送載體，如作為封裝治療劑的人工囊泡[17-18]。在脂質體表面修飾特定蛋白，可以增強靶向能力。超聲波作用于脂質體會改變其結構和表面特性，特別是脂質體表面蛋白的分布和功能[19-20]，這種作用可被利用以增強脂質體的靶向能力，從而提高藥物輸送的有效性和特異性[21-23]。

近年來，關于超聲技術對細胞和脂質體結構影響的研究取得了一系列進展。已有研究表明，超聲處理可以引發細胞膜結構變化和通透性增加等現象[24-26]。然而，超聲處理對膜蛋白和磷脂雙分子層間的相互作用及細胞膜-骨架的影響機制仍需進一步的探究，這些分子水平的變化對基于超聲的腫瘤療法的探索和診斷工具的開發具有重要影響[27-30]。

對細胞膜及脂質體結構的研究通常使用多種高分辨率成像技術，如熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、原子力顯微鏡和冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）等。近年來， Cryo-ET 技術在生物膜結構研究中展現出獨特優勢，能夠在接近天然狀態下觀察生物膜的高分辨結構，捕捉超聲作用下的細微結構變化。本研究采用Cryo-ET 技術，旨在提供超聲波影響細胞膜精細結構的直接證據，為深入理解膜結構在超聲作用下的變化提供支持[20，31-32]?？疾炝瞬煌某暪β仕胶吞幚沓掷m時間如何影響細胞骨架從紅細胞膜上的分離以及細胞膜蛋白在磷脂雙分子層上的脫落和重組，通過分析這些變化，有助于增強對超聲誘導的膜和細胞骨架結構改變的機制的理解以及優化超聲在基礎研究和臨床實踐中的進一步應用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai G² F20 200 kV 冷凍透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；K2 直接電子探測相機（美國Gatan 公司）；Vitrobot Mark Ⅳ 快速投入式冷凍制樣儀（美國賽默飛世爾科技公司）；SOLARUS-950 等離子體清洗系統（美國Gatan 公司）；TGL-21M 高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；KQ-2200DE型臺式數字超聲波清洗機（昆山舒美超聲儀器有限公司）；R1.2/1.3 300 目多孔碳膜銅網（德國Quantifoil公司）。

NaCl、KCl、KH₂PO₄ 和Na₂HPO₄·12H₂O（分析純，北京化工廠）；多聚L-賴氨酸溶液（質量濃度1 g/L，美國Sigma-Aldrich 公司）；5nm 膠體金顆粒（西安瑞禧生物科技有限公司）。

1.2 人紅細胞膜的獲取

取健康成年志愿者的末梢血10 μL，在磷酸鹽緩沖液（137 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 1.8 mmol/LKH₂PO₄， 10 mmol/L Na₂HPO₄， pH 7.4）中離心（1000 r/min， 2 min）、清洗5次，棄去上清液，在管底收集干凈的人紅細胞，加入1 mL 低滲磷酸鹽緩沖液，誘導人紅細胞完全溶血10 min，然后在23000 r/min 下離心10 min，用低滲磷酸鹽緩沖液清洗，反復離心、清洗5 次，棄去上清液，收集人紅細胞膜，加入1mL 磷酸鹽緩沖液，備用。整個實驗流程均在4 ℃下進行。

1.3 超聲波處理紅細胞膜

使用泡沫浮漂將包含膜懸浮液的離心管固定在裝滿冰水混合物的燒杯中，放置在超聲波清洗機內。固定超聲頻率為40kHz，設置超聲功率在40～100 W 之間，處理時間在1～5 min 之間。對照組同樣放置在裝滿冰水混合物的燒杯中，未進行超聲處理。

1.4 冷凍樣品的制備

通過等離子清洗系統對載網進行親水化處理，通入H2 和O2 輝光放電10 s，然后將清洗過的載網浸入多聚L-賴氨酸溶液（1 mg/mL）中4 h 后放入去離子水中清洗。將制備好的紅細胞膜樣品沉降在載網上30 min，然后加入蛋白A 包被的膠體金顆粒（3 μL）以作為后續數據處理的對齊標記。準備好的載網在濕度為100%、溫度為8 ℃的冷凍制樣儀腔室中吸干表面多余水分，然后投入液態乙烷中形成無定形冰。將制備好的載網儲存在液氮中直至使用。

1.5 冷凍透射電子顯微鏡進行樣品檢查及數據收集

利用冷凍傳輸架將冷凍好的低溫樣品送入電鏡中。通過Seria EM 軟件在Low dose 功能下檢查樣品，將樣品臺通過角度對稱的旋轉方式以3°的間隔從–60°到+60°的傾斜度獲取目標區域的Cryo-ET 傾斜序列，顯微鏡在200 kV 下運行，目標欠焦值為–4 μm ～ –6 μm。通過K2直接電子探測器收集數據，數據圖像像素大小為0.2668 nm（放大倍數為19000×）。整個傾斜序列的總累積電子劑量約為140 e^–/?²。

1.6 電子斷層掃描圖的三維重構

在冷凍電鏡成像過程中，樣品會受到輻射和其它環境因素的影響，導致圖像出現運動模糊。因此對于收集的傾斜序列，首先通過運動校正軟件MotionCorr 2對每個傾斜序列的每個角度的電子投影圖進行漂移校正，再通過軟件IMOD中的加權反投影算法對傾斜序列進行對齊和三維重建，而后通過同步迭代重建技術進行斷層圖的重建，迭代次數為5或15次[33-34]。

2 結果與討論

2.1 不同超聲功率對人紅細胞膜形態的影響

完整的實驗流程如圖1。紅細胞的完整結構（如雙凹形狀和細胞內部的內容物）可能在超聲作用下產生復雜的響應，從而影響細胞膜單獨的響應行為。先提取出細胞膜可以排除紅細胞內部結構的干擾，確保觀察到的是超聲波直接作用于膜結構的效果，使實驗結果更聚焦于細胞膜的物理和結構變化。因此，首先通過低滲溶血和離心制備純凈的人紅細胞膜，進行超聲處理后沉降在電鏡載網上，利用Vitrobot冷凍制樣儀將樣品快速冷凍，然后將樣品轉移到冷凍透射電子顯微鏡中進行觀察及數據收集。

首先觀察未經過超聲處理的對照組，通過對樣品的低倍成像，可見樣品冰層厚度適中，透光性良好（圖2A）。人紅細胞膜邊界清晰，結構完整，尺寸約為8～10 μm（圖2B）。對細胞膜區域進行高倍數的數據采集，三維重構后的細胞膜光滑且連續，膜蛋白致密（圖2C）。這些膜蛋白通常包括各種重要的功能蛋白如離子通道等，在維持細胞功能和結構完整性方面發揮了關鍵作用。在Cryo-ET 圖像中難以清晰地觀察到磷脂雙分子層，這可能是由于紅細胞膜平鋪在載網上，電子垂直穿過磷脂雙分子層，其吸收程度很低（圖2D）。這些結果與預期一致，表明未經超聲處理的人紅細胞膜保持了其原始結構和功能。

接下來，在40W和60W功率下對紅細胞膜進行超聲處理，每次處理時間為5 min。通過Cryo-ET 觀察發現，經過40W功率超聲處理后的紅細胞膜形態變化不大，膜結構保持相對完整，膜表面僅出現少量的波狀變形（圖3A）。這種波狀變形可能是由于超聲波引起的輕微機械應力所致，但尚不足以破壞膜的整體結構。以60W功率超聲處理后，紅細胞膜結構開始顯示出更明顯的變化，雖然大部分膜仍然保持完整，但在某些區域可以觀察到較大的變形和孔洞（圖3B）。這些孔洞的形成可能是由于超聲波引起的空化效應，導致膜局部結構的破壞。盡管如此，總體而言， 60W功率下超聲處理后的紅細胞膜仍然保持了大部分的結構完整性。當超聲功率提高到80W時，紅細胞膜的結構破壞明顯加劇，膜表面出現了不規則的破裂和較大的孔洞，膜結構的整體完整性受到了嚴重破壞，并出現了光滑的脂質體（圖3C）。這是由于超聲波產生強大空化效應和機械應力，這些力直接作用于膜的磷脂雙分子層和膜蛋白，導致其分離和破裂。在100W功率下，紅細胞膜完全破裂，形成大量的膜碎片及脂質體，膜的連續性完全消失（圖3D）。這種完全破裂的現象表明， 100W功率下的超聲波產生的機械力和空化效應已經超過了膜結構的承受能力，導致其徹底解體。

2.2 超聲持續時間對人紅細胞膜的影響

進一步探討了超聲時間對紅細胞膜形態的影響。固定超聲功率為100W，分別考察了超聲1 min、5 min 和間斷超聲處理對紅細胞膜結構的影響。

在超聲處理1 min 后， Cryo-ET 圖像顯示紅細胞膜的形態變化較小，盡管膜表面出現了一些微小的孔洞和波狀變形，但整體結構仍保持相對完整（圖4A）。這些微小孔洞可能是超聲波產生的局部剪切力形成的。這種現象表明，在短時間的超聲處理時，紅細胞膜具有一定的機械穩定性和修復能力，能夠抵抗超聲波的輕微損傷。隨著超聲時間延長至5 min，紅細胞膜的破壞程度顯著增加。在Cryo-ET 圖像中可以觀察到細胞膜出現大面積的破裂和脫落，膜的連續性被嚴重破壞（圖4B）。為探究更好的保護紅細胞膜的方式，考察了采取超聲1 min、停止1 min 共進行5 min 的間斷超聲處理方式的影響。間斷超聲處理下，雖然膜表面出現了一些孔洞和破裂現象，但膜的整體結構較連續超聲處理下保持更為完整（圖4C）。這可能是由于間斷處理方式給細胞膜留出了緩沖時間，使得膜在受到機械應力后能夠部分恢復，從而減少了持續超聲對膜結構的累積破壞。此外，發現在這些細胞膜的邊緣處，膜卷曲時可以看到邊界清晰的磷脂雙分子層，這可能是因為當電子橫向穿過磷脂雙分子層時，其疏水尾部對電子的吸收率更高（圖4D）。

2.3 超聲導致人紅細胞膜骨架的脫落

在對照組中， Cryo-ET 圖像顯示細胞膜與細胞骨架關系緊密。在Z 軸截面圖中可以清楚地看到細胞膜磷脂層與骨架層相隔約12 nm（圖5A）。經過超聲處理后，尤其是在高功率和長時間處理條件下，細胞膜骨架明顯脫落。隨著超聲功率和時間的增加，膜骨架蛋白從膜上解離，形成散落的蛋白質顆粒。這些散落的骨架蛋白顆粒呈現細長的絲狀結構（圖5B）。進一步統計這些散落的細絲狀骨架蛋白質顆粒的尺寸，發現長度分布在200～260 nm 間，寬度約2～5 nm（圖5C 和5D）。這表明細胞骨架雖然脫落，但其尺寸大小得到了較好的保持，未發生明顯的斷裂或變性。這可能是由于細胞骨架通過連接蛋白與細胞膜磷脂雙分子層相互作用，在機械應力作用下，細胞骨架與連接蛋白在細胞膜上的分布狀態發生改變，超聲處理作用于細胞膜與膜骨架連接處的蛋白，破壞了細胞骨架與膜的連接，從而導致其脫落[35-37]。

2.4 細胞膜形成表面覆蓋膜蛋白的脂質體

經高強度的連續超聲處理（100W， 5 min）后，觀察到細胞膜形成的脂質體表面存在膜蛋白（圖6A）。這些膜蛋白顆粒在脂質體表面分布較為均勻，形成了一層覆蓋膜，呈現出不同于原始細胞膜的分布模式（圖6B）。進一步統計這些膜蛋白顆粒的直徑，發現其尺寸與未超聲處理的細胞膜蛋白顆粒相似，長度集中在8 nm 左右，寬度主要分布在5～7 nm（圖6C 和6D），這表明超聲處理過程中膜蛋白較好地保持了其整體結構。然而，這些蛋白顆粒顯示出明顯的突出結構，表明它們從脂質雙層中伸出很遠。這可能是由于在超聲過程中，膜蛋白與細胞膜的連接受到了破壞，導致膜蛋白從磷脂雙分子層中脫落。超聲的剪切力和空化效應會在細胞膜上產生局部高壓和微小氣泡，這些氣泡的形成與破裂會進一步擾動膜結構，從而促使膜蛋白分離。超聲處理后，當脂質體重新形成時，脫落的膜蛋白因其疏水區域的親脂性傾向，自發地嵌入脂質體的磷脂雙分子層，并重新附著在脂質體表面。這種自發附著可能受到疏水相互作用和靜電吸引的驅動，使得膜蛋白在脂質體表面均勻分布，形成類似于原始細胞膜的覆蓋層[27，38-39]。在圖3C 中出現的光滑的脂質體也驗證了這一推測。這種重新附著現象表明，超聲波處理不僅影響細胞膜的磷脂雙層結構，還可能改變膜蛋白的分布和功能。

3 結論

超聲波對紅細胞膜的影響主要源于其產生的機械力和空化效應。本研究結果顯示，功率較低或處理時間較短時，這些效應較為溫和，僅會導致膜的輕微變形和局部孔洞的形成。隨著超聲功率的增加和處理時間的延長，超聲波的空化效應和剪切力顯著增強，導致膜結構的嚴重破壞。而間斷超聲處理可以有效減少細胞膜的損傷，使膜結構保存更加完整。這一規律在藥物遞送、細胞工程及超聲治療等領域具有重要意義。在藥物遞送方面，通過優化超聲處理的方式，可以在保持細胞活性的同時增加膜的通透性，為藥物分子的有效遞送提供新的途徑。在細胞工程方面，通過精確控制超聲處理條件，可以研究細胞膜的機械性質和其對外界應力的響應機制。超聲處理引起的人紅細胞骨架脫離現象凸顯了進一步探究超聲對細胞穩定性影響的必要性。膜蛋白在脂質體上重新附著的現象不僅為設計更有效的藥物遞送系統提供了更多的可能性，也為膜蛋白功能的研究提供了新的手段。例如，通過調整超聲處理條件，可以研究膜蛋白的重新分布規律及其對細胞功能的影響。在超聲治療領域，通過超聲波處理模擬細胞在生理和病理條件下的膜損傷，可以研究膜損傷對細胞功能的影響和細胞膜的修復機制。在后續實驗中，將深入研究超聲對細胞膜結構和功能的長期影響，并開發更加靈活的超聲調控技術，以進一步提升其在醫學應用中的安全性和有效性。