綠原酸對柱花草青貯品質(zhì)、蛋白降解和細(xì)菌群落及相互關(guān)系的影響

摘要：為改善柱花草（Stylosanthes）的青貯發(fā)酵品質(zhì)，將0.2%和0.4%的綠原酸添加到柱花草中，以無添加作為對照（CK）。青貯80 d后，分析柱花草的發(fā)酵特性、蛋白組成以及細(xì)菌群落變化，結(jié)果表明：添加綠原酸不僅顯著降低了柱花草的pH值、非蛋白氮、氨態(tài)氮含量，對干物質(zhì)、乳酸和乙酸含量的變化均有積極的影響。細(xì)菌群落分析表明添加綠原酸對芽孢桿菌、魏斯氏菌，對腸桿菌、泛菌、丁酸梭菌的含量有較好的抑制作用。此外，0.2%綠原酸處理還顯著降低了丙酸含量以及酸性蛋白酶和氨基肽酶的活性。綜上所述，添加綠原酸對柱花草的發(fā)酵品質(zhì)、蛋白組分均有積極的作用。

關(guān)鍵詞：柱花草；綠原酸；蛋白酶；青貯品質(zhì)；細(xì)菌群落

中圖分類號：S816.5+3 " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " "文章編號：1007-0435（2025）01-0317-10

The Effects of Chlorogenic Acid on the Quality，Protein Degradation，Bacterial Community，and Their Interrelationships of Stylosanthes Silage

WANG Yao， GUO Tian-xin， CHEN Dan-dan， LIANG Qiu-yu， ZHANG Qing*

（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University， Guangdong Province Research Center of WoodForage Engineering Tecnology， Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Urilization of Forest Plant Germplasm， Guangzhou，

Guangdong Province 510642， China）

Abstract：To improve the fermentation quality of silage of Stylosanthes，0.2% and 0.4% chlorogenic acid were added to Stylosanthes，with no addition as the control （CK）. After 80 days of ensiling，the fermentation characteristics，protein composition，and bacterial community changes of Stylosanthes were analyzed. The results showed that the addition of chlorogenic acid not only significantly reduced the pH value，non protein nitrogen，and ammonia nitrogen content of Stylosanthes，but also had a positive impact on the changes of lactic acid，dry matter and acetic acid content. Bacterial community analysis showed that the addition of chlorogenic acid had a good inhibitory effect on the content of Bacillus and Weissella，as well as Enterobacterium，Pantobacterium，and Clostridium butyricum. In addition，0.2% chlorogenic acid treatment significantly reduced the content of propionic acid and the activity of acid protease and aminopeptidase. In summary，adding chlorogenic acid had a positive effect on the fermentation quality and protein components of Stylosanthes.

Key words：Stylosanthes；Chlorogenic acid；Protease；Silage quality；Bacterial community

柱花草（Stylosanthes guianensis），一種來自南美洲地區(qū)的多年生暖季型豆科牧草，其自身可以適應(yīng)多種極端環(huán)境，由于其在酸性等瘠薄的土壤中仍然可以保持高產(chǎn)量，因此廣泛種植于我國南方地區(qū)［1］。柱花草生長迅速且營養(yǎng)價值高，一般用來做粗飼料，但種植季節(jié)性強(qiáng)，因此用青貯方式保存可以改善其地域性和冬季無法生長造成的飼料短缺等一系列問題。對柱花草進(jìn)行青貯處理一方面延長了它的營養(yǎng)保藏時間，另一方面對它的適口性有極大的提高［1-4］。然而在柱花草的青貯過程中，一些對青貯有害的細(xì)菌如梭菌以及真菌如酵母菌等會大量繁殖。此外，柱花草自身含有大量的蛋白，這直接導(dǎo)致了柱花草在青貯過程中擁有較高的緩沖能，同時其自身的可溶性碳水化合物含量較低，使得在青貯過程中，柱花草青貯飼料的pH值始終保持一個較高的水平，然而良好青貯的pH值標(biāo)準(zhǔn)為4.2，這便無法滿足青貯過程要求的酸性環(huán)境，導(dǎo)致無法擁有一個好的抑菌效果，同時高水平的pH值還會抑制乳酸菌的大量繁殖，因此，人們急切的尋求適宜的添加劑來改善柱花草的青貯發(fā)酵過程，進(jìn)一步提高柱花草的青貯發(fā)酵品質(zhì)、減少由于青貯帶來的蛋白質(zhì)損失［4-6］。

大量研究表明，在植物被收割后的短暫時間內(nèi)，它們體內(nèi)的各種活性物質(zhì)并不會馬上失活，其中它們體內(nèi)的蛋白酶在植物組織離體的一段時間內(nèi)仍然會發(fā)揮重要的作用［7］。人們通過研究紫花苜蓿青貯過程發(fā)現(xiàn)，在青貯前期，它們體內(nèi)的蛋白酶并沒有失活，反而有極大的提升［8］。然而對于青貯過程而言，蛋白酶的存在會嚴(yán)重影響青貯的發(fā)酵過程，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的大量降解，進(jìn)而降低青貯的發(fā)酵品質(zhì)［9］。雖然人們目前對柱花草青貯的研究已經(jīng)趨于完善，不論是柱花草混合青貯還是柱花草青貯完成后的有氧暴露階段，都有相應(yīng)的理論研究作為指導(dǎo)。同時柱花草青貯過程中溫度的影響以及一些添加劑對其品質(zhì)的影響都有成熟的研究結(jié)果［5，10-16］。但是有關(guān)柱花草青貯過程中蛋白酶的影響至今缺乏研究報道。

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA），一種在植物有氧呼吸過程中產(chǎn)生的，由肉桂酸和奎寧酸經(jīng)莽草酸途徑合成的苯丙素類物質(zhì)［17］。國內(nèi)外的多項研究表明，CGA擁有多種有益活性，如：抗菌、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等［17-22］。CGA作為自然界存在的一種天然多酚，來源廣泛，存在于大自然的各種植物當(dāng)中，如蒼耳（Xanthi um sibiricum Patr.）、杜仲（Eucommia ulmoides）、金銀花（Lonicerae japonicae flos）、連翹（Forsythia suspensa）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、枇杷（Eriobotrya japonica）等，甚至咖啡、李子、馬鈴薯、番茄、胡蘿卜和油籽等日常食物中也存在，不僅廣泛易得且副作用可以忽略不計［23-29］。目前多數(shù)關(guān)于CGA的研究大多偏向于它的抗菌特性，但有關(guān)它對蛋白酶活性的抑制作用與蛋白保護(hù)作用的研究和進(jìn)展鮮有報道，本文通過測定添加CGA青貯80 d后的柱花草發(fā)酵指標(biāo)來分析其發(fā)酵品質(zhì)、蛋白變化與細(xì)菌群落的關(guān)系，以此評估CGA在飼料添加劑應(yīng)用中的可行性，進(jìn)一步為優(yōu)質(zhì)的柱花草青貯飼料生產(chǎn)過程提供有力的理論依據(jù)和可靠的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究過程中所用到的青貯原材料：柱花草，采收于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的啟林北學(xué)生科學(xué)試驗田中（中國，廣州，23°19′N，113°34′E）。柱花草采摘于初花期，青貯原料營養(yǎng)成分見表1。青貯真空袋規(guī)格約30 cm×70 cm，塑料材質(zhì)；綠原酸，采購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗處理

在2022年9月5日將新鮮柱花草收獲之后，立刻用鍘刀對其進(jìn)行切割處理，得到長度約為1～2 cm的小段，切割之后將其進(jìn)行混合處理，直到混合均勻，之后對其進(jìn)行如下處理：（1）對照組（Control； CK），即直接取切斷后的小段進(jìn)行青貯處理，不添加任何添加劑；（2）0.2%綠原酸添加的處理組；（3）0.4%綠原酸添加的處理組。其中添加的百分比按照柱花草原材料的鮮物質(zhì)（Fresh matter，F(xiàn)M）的百分比來計算。本試驗進(jìn)行了三個組的不同處理，每一個處理組進(jìn)行了4個同樣的重復(fù)，其中每袋加入了大約100 g的青貯原材料：綠原酸，一共進(jìn)行了12袋裝的處理。混勻分裝完之后使用真空封口機(jī)對青貯材料進(jìn)行密封處理，后放置于常溫條件下，進(jìn)行80 d儲存處理。

1.3 微生物數(shù)目及化學(xué)指標(biāo)的測定

在青貯80 d后對柱花草進(jìn)行開袋取樣，分別取4份10 g的樣品于取樣袋中。

向其中一份10 g柱花草青貯中加入90 mL滅菌處理的濃度為0.9%的生理鹽水，將它們攪拌直至混合均勻，取10 mL原液將其利用梯度稀釋的方法逐步將其稀釋到原液的10-6倍，制備浸提液。分別配置MRS瓊脂培養(yǎng)基，對乳酸菌進(jìn)行涂板以及蓋板處理（厭氧環(huán)境），配置結(jié)晶紫中性紅瓊脂培養(yǎng)基，用相應(yīng)濃度的浸提液直接涂板培養(yǎng)，用來對大腸桿菌進(jìn)行計數(shù)，配置孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以用來同時檢驗霉菌與酵母菌的濃度，最后我們采用平板計數(shù)法來對原液中的菌進(jìn)行計數(shù)處理。本試驗中所用到的所有培養(yǎng)基均從環(huán)凱微生物科技有限公司采購（中國，廣州）［30］。

在另一份10 g柱花草中加入90 mL的滅菌處理之后的蒸餾水，將它們攪拌直至混合均勻，在4℃冰箱將混合均勻后的試驗材料保存24 h，之后將其拿出在常溫條件下用定性濾紙過濾之后得到濾液，對所得到的濾液使用pH計測定得到青貯材料的pH值。將測量完成之后的濾液在-20℃冰箱保存以便進(jìn)行后續(xù)的試驗測定，即氨態(tài)氮以及有機(jī)酸含量的測定；剩下兩份用于后續(xù)微生物多樣性的檢驗以及青貯發(fā)酵中蛋白酶的測定。

從柱花草青貯中隨機(jī)稱量80 g樣品，將選取的樣品放置于65℃的恒溫烘箱中烘干2 d，隨后稱量烘干后的樣品質(zhì)量，進(jìn)而對所選取的青貯材料的干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量進(jìn)行計算。為了對后續(xù)青貯飼料的其他營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，本試驗選用微型植物粉碎機(jī)粉碎烘干后的柱花草青貯樣品，并將粉碎后的樣品過1 mm篩，之后將其裝于樣品袋中，放置于陰涼處密閉保存。

測定pH值之后的柱花草浸提液存于-20℃的冰箱，分別用許慶方對有機(jī)酸的測量方法對柱花草青貯進(jìn)行［31］乙酸、丁酸、乳酸和丙酸含量的測定。按照Broderick對氨態(tài)氮（Ammoniumnitrogen，NH3-N）的測定方法對其含量進(jìn)行測定［32］。

取粉碎后的柱花草干粉，通過李玲等［33］的方法對柱花草青貯飼料的各種蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定如：真蛋白（True protein，TP）、粗蛋白（Crude protein，CP）的含量，非蛋白氮（Non-protein nitrogen，NPN）的含量通過粗蛋白氮與真蛋白氮之間的差值計算獲得。柱花草青貯飼料中的酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）、則使用Vansoest等［34］的方法進(jìn)行測定，以及中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）。蒽酮比色法則被用來測定柱花草青貯飼料中的可溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）［35］。

1.4 微生物多樣性分析

取10 g柱花草青貯樣品，通過使用HiPureSoil DNA試劑盒，提取原材料DNA，細(xì)菌16SrRNA基因的V3～V4區(qū)域則使用引物806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）與341F（5′-ACT-CCTACGGGAGWGCAGCAG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）來進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物需要進(jìn)行純化處理，之后將其測序，使用的平臺為Illumina（Guangzhou Gene Denovo，Guangzhou，China）［36］。

1.5 蛋白酶實(shí)驗

10 g的柱花草飼料青貯進(jìn)行冷藏，將其取出后，向其中加入0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH值6.0，5 mmol·L-1硫代硫酸鈉）50 mL，并對其進(jìn)行勻漿粉碎處理。利用四層紗布對上一步的勻漿液進(jìn)行過濾，之后對其進(jìn)行離心處理，離心條件轉(zhuǎn)速為：10 000 r·min-1，時長為：15 min，溫度為：4℃。離心后，將在上部的清液取出，作為粗酶提取物并在-80℃條件下保存用于氨基肽酶和酸性蛋白降解酶活的測定。

勻漿時間確定：樣品易破碎程度來確定勻漿時間，時間過長產(chǎn)熱影響酶活性。

四層紗布過濾：可用手?jǐn)D紗布加速過濾，濾液過多可先用1.5 mL離心管搖勻后保存。渦旋，離心取上清放-80℃冰箱。

氨基肽酶的測定：氨基肽酶活性測定所用底物為L-leucinep-p-nitroanilide （Sigma公司）并將底物溶于50 mmol·L-1磷酸-檸檬酸緩沖液中。將0.5 mL離心管放在40℃的水浴中培養(yǎng)2 h。將離心管放入沸水中煮沸5 min終止反應(yīng)。之后用分光光度計（722S可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定其在410 nm處的吸光值。以添加0.5 mL蒸餾水的離心管作為空白。酶活的表示方法為每小時在410 nm處的吸光值［37］。

酸性蛋白降解酶的測定：酸性蛋白降解酶按照Peterson和Huffaker（1975）的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)混合物包括以下物質(zhì)：（1）0.3 mL，10 mg·mL-1的azocasein（Sigma公司）；（2）0.2 mL的酶提取液；（3）0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液0.5 mL，該溶液的pH 值為4.5。將該混合液裝入5 mL的離心管中在40℃的水浴鍋中進(jìn)行培養(yǎng)2 h之久。反應(yīng)結(jié)束后使用2 mL，12%的高氯酸處理達(dá)到中止的效果，將中止后的反應(yīng)液在12 000 r·min-1離心后取上清液用分光光度計測定其在340 nm處的吸光值。酶活的表示方法為每小時在340 nm處的吸光值。空白為用0.2 mL的蒸餾水代替酶提取液，其他處理相同［38］。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗的數(shù)據(jù)處理使用的軟件為SPSS23和Microsoft Office Excel 2016，本試驗還對試驗所得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析，使用的軟件為One-way ANOVA，顯著性差異則采用了Duncan來進(jìn)行。采用Origin 2021、AI以及Graphpad prism 9進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加綠原酸對柱花草發(fā)酵特性和微生物數(shù)量的影響

由表2可知綠原酸（CGA）對柱花草青貯發(fā)酵過程中微生物數(shù)量以及它對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響。添加0.2%綠原酸極顯著增加了柱花草青貯中的乳酸含量，降低了丙酸的含量（Plt;0.05），添加0.4%綠原酸極顯著提高了乙酸含量，減少了氨態(tài)氮的含量（Plt;0.05）。添加綠原酸極顯著降低了pH值、大腸桿菌、霉菌以及酵母菌的數(shù)量（Plt;0.05），同時極顯著提升了柱花草干物質(zhì)含量（Plt;0.05）。

2.2 綠原酸對柱花草中蛋白酶活性的影響

由表3所示綠原酸對柱花草青貯發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，在添加綠原酸之后，柱花草中的粗蛋白、真蛋白含量沒有顯著性影響。添加綠原酸極顯著降低了非蛋白氮的含量（Plt;0.05），氨態(tài)氮的含量隨著綠原酸濃度的增加極顯著地降低（Plt;0.05）。

表3表明，綠原酸的加入對蛋白酶有明顯的影響，當(dāng)加入0.2%的CGA時，酸性蛋白酶與氨基肽酶的活性受到了很大程度的抑制，但蛋白酶的活性與CGA含量并未呈現(xiàn)濃度依賴現(xiàn)象。相反當(dāng)CGA濃度達(dá)到0.4%之后，對青貯飼料中的蛋白酶活性并沒有影響。

2.3 柱花草青貯過程中菌落結(jié)構(gòu)分析

如圖1所示，從屬的水平對柱花草青貯過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行相對豐度分析，結(jié)果顯示，屬水平下的細(xì)菌群落中，優(yōu)勢菌屬有腸球菌屬（Enterococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），它們的相對豐度分別為41.4%和29.1%。與對照組相比，添加0.2%CGA處理后，科薩克氏菌屬（Kosakonia）與乳桿菌屬（Lactobacillus）擁有更高的相對豐度，Clostridium_sensu_stricto_11、Clostridium_sensu_stricto_12、孢子乳桿菌（Sporolactobacillus）、Clostridium_sensu_stricto_1、泛菌（Pantoea）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Caproiciproducens的相對豐度較低。然而在0.4%CGA中，相較于0.2%CGA除了科薩克氏菌屬（Kosakonia）與Caproiciproducens與0.2%CGA相對豐度數(shù)量相差不大、孢子乳桿菌（Sporolactobacillus）、孢子乳桿菌（Sporolactobacillus）數(shù)量均比0.2%CGA高。

2.4 菌落結(jié)構(gòu)與青貯品質(zhì)的關(guān)系

如圖2所示，青貯品質(zhì)與菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。其中，科薩克氏菌屬（Kosakonia）與青貯的乳酸含量相關(guān)，Clostridium_sensu_stricto對青貯過程中的蛋白含量與質(zhì)量密切相關(guān)，他們之間的影響均為負(fù)相關(guān)，泛菌（Pantoea）則影響了青貯飼料中的丁酸含量，且表現(xiàn)出了正相關(guān)。Caproiciproducens對青貯品質(zhì)的影響最大，不僅影響了青貯飼料的pH值、丙酸含量，而且對青貯的真蛋白也有很大的影響，除了對真蛋白是正相關(guān)外，其余均為負(fù)相關(guān)。從相關(guān)性分析可以看出，Caproiciproducens對青貯有積極影響，其余菌對青貯飼料有著負(fù)面影響。

2.5 CGA對菌落的抑制作用

如圖3所示在屬水平上，與對照組相比，CGA可以降低Clostridium_sensu_stricto_1、Clostridium_sensu_stricto_11、Clostridium_sensu_stricto_12、Pantoea、Sporolactobacillus，其中對于Pantoea、Clostridium_sensu_stricto_11、Sporolactobacillus而言，0.2%CGA可以降低其含量。從種的水平看，CGA的添加均降低了Bacillus_coagulans、Clostridium_aurantibutyricum、Clostridium_beijerinckii。

3 討論

本研究所使用的柱花草原料的WSC含量（2.39%DM）與以往文章所研究的有所不同，相比于Wang等［11］的研究結(jié)果而言相對較高，NDF含量相比于吳碩等［39］的研究結(jié)果（54.08%DM）較低。本試驗所用材料與他人所研究的柱花草指標(biāo)有不同程度的差異，這一結(jié)果形成的原因有很多，如：柱花草生長區(qū)域不同，生長過程中所經(jīng)歷的氣候不一樣，所選取的柱花草品種不同以及柱花草在生長過程中的生長狀況有所差異，除此之外柱花草青貯原料的收獲期不同也可能導(dǎo)致這一結(jié)果［40-41］。柱花草青貯沒有達(dá)到良好青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)，其原因可能是由柱花草自身的一些生長特性所導(dǎo)致，即新鮮的柱花草原料自身的乳酸菌含量較低，無法滿足青貯的基本要求（gt;5.0 lg cfu·g-1）［42］，除此之外，本次試驗所選的柱花草原料自身攜帶著大量不利于青貯發(fā)酵的微生物，如果選擇不做任何處理直接進(jìn)行青貯活動，將會導(dǎo)致青貯飼料的結(jié)果品質(zhì)較差，進(jìn)一步造成不良的青貯發(fā)酵。

經(jīng)過大量的試驗數(shù)據(jù)表明，綠原酸不僅具有廣譜的抑菌活性，可以抑制大部分微生物的產(chǎn)生還可以保護(hù)飼料生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)的天然植物添加劑。本試驗結(jié)果表明，在柱花草青貯過程中加入CGA后，青貯的pH值顯著降低，降低至4.76左右，雖然相較于CK組而言有更好的酸性青貯發(fā)酵條件，但仍然沒有達(dá)到青貯飼料良好發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)4.2［43］。這一結(jié)果可能是由于柱花草青貯原材料的自身特性所造成的，研究表明良好的青貯原料對于自身的可溶性碳水化合物有一定的要求，通常含量高于5%DM才符合營養(yǎng)保存條件［44］。而我們當(dāng)前的研究結(jié)果表明，本試驗所采用的柱花草原料的可溶性碳水化合物含量僅僅只有2.39%DM，這并不能滿足正常青貯過程中乳酸菌大量繁殖所需要的生長條件，進(jìn)一步使得青貯過程中的pH值、有機(jī)酸含量等達(dá)不到良好青貯的要求，從而導(dǎo)致本試驗所用的原材料沒有很好的抑菌效果［45］。在對食源性致病菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)，綠原酸對其有著極其顯著的抑制作用。由于綠原酸屬于天然的植物代謝產(chǎn)物，是一種廣泛易得的重要酚酸，所以被人們大量用來做體外抑菌試驗，對它的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究探討，在經(jīng)過研究之后發(fā)現(xiàn)，綠原酸除了具有抗菌活性外，在醫(yī)學(xué)方面也有重要的研究意義，具有很強(qiáng)的消炎、防止氧化、防治高血糖、血脂、癌癥、心血管疾病等一些對人們生命健康有著重大研究意義的藥理作用，而且還有研究表明其對病毒、有害真菌等具有很強(qiáng)的抗性［46］。現(xiàn)有的研究表明，綠原酸對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌以及青貯過程中的關(guān)鍵菌枯草芽孢桿菌等具有很強(qiáng)的抑制效果，經(jīng)過人們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸的抑菌機(jī)理是：破壞這些細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步阻礙這些細(xì)菌的正常生理活動，從而導(dǎo)致細(xì)菌生長受損，進(jìn)一步殺死細(xì)菌［47-48］。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，添加了綠原酸的處理組并未檢測到大腸桿菌的活性，這些結(jié)果顯示，綠原酸可以抑制大腸桿菌的大量繁殖。與此同時在添加了綠原酸之后，試驗結(jié)果表明處理組中的霉菌以及酵母菌的數(shù)量有明顯的下降，由于CK組中的含量也較低，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于青貯過程自身的厭氧環(huán)境導(dǎo)致它們的生長受阻，在此基礎(chǔ)上，加入綠原酸之后抑菌效果得到了進(jìn)一步的提升［49］。

植物在青貯時，通常會面臨長時間的儲藏過程，這便為有害菌的滋生創(chuàng)造了充足的時間條件，由于在這些有害菌的生長過程中需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)，植物中蛋白的降解便變得不可避免，再加上植物體自身攜帶的蛋白酶等活性物質(zhì)，青貯原材料中的蛋白質(zhì)通常會被水解為多肽以及小分子的游離氨基酸，除了被有害菌吸收外，還有部分會被微生物進(jìn)一步降解為氨和胺等小分子物質(zhì)［9］。根據(jù)以往的研究結(jié)果，人們通常會根據(jù)青貯過程中產(chǎn)生的氨態(tài)氮含量與青貯中總氮含量的比值來對青貯過程中氨基酸的分解程度以及蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行初步判斷，通常來講，這一比值可以充分表明青貯蛋白質(zhì)的品質(zhì)，與之呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)［50］。在當(dāng)前的試驗中，對柱花草青貯進(jìn)行綠原酸添加處理后，處理組與對照組的真蛋白含量沒有顯著的變化，而處理組的非蛋白氮含量以及氨態(tài)氮含量被明顯地降低了，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是：綠原酸在加入柱花草青貯之后，柱花草自身的蛋白酶活性得到了抑制，進(jìn)一步阻止了青貯過程中柱花草真蛋白的降解。在人們的研究過程中，制定了優(yōu)質(zhì)青貯飼料中蛋白品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)：氨態(tài)氮與總氮比值小于10%［51］。本試驗結(jié)果表明，在加入綠原酸之后的處理組中，氨態(tài)氮與總氮比值均小于10%。且隨著綠原酸含量的增加，這一比值越來越小，這一結(jié)果表明了綠原酸有助于保護(hù)青貯過程中原材料的蛋白質(zhì)。

如圖3所示，在柱花草青貯過程中，0.2%CGA與0.4%CGA有著不同的效果，可能是因為0.2%CGA可以抑制的一些菌在0.4%CGA條件下反而達(dá)不到相應(yīng)的效果。與此同時只有0.2%CGA可以降低蛋白酶活性，這可能是因為酸濃度對蛋白酶活性具有影響，表明蛋白酶的含量可能與Pantoea、Clostridium_sensu_stricto_11、Sporolactobacillus等菌的生長有關(guān)，如圖2所示對其進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，這三種菌與蛋白質(zhì)品質(zhì)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性。酶與細(xì)菌的生長呈現(xiàn)相輔相成的關(guān)系，有的細(xì)菌可以通過自身合成出多種酶來幫助其進(jìn)行代謝活動。比如，許多細(xì)菌可以合成α-淀粉酶來分解淀粉質(zhì)，或者合成蛋白酶來分解蛋白質(zhì)。此外，一些細(xì)菌也可以通過合成酶來幫助其適應(yīng)特殊的環(huán)境，如低溫酶、高鹽度酶等［52］。這三種細(xì)菌與蛋白質(zhì)品質(zhì)密切相關(guān)，是否它們自身存在合成蛋白酶的能力，有待后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

前人的研究表明，在青貯的發(fā)酵過程中，青貯原材料自身的含水量直接影響著青貯的發(fā)酵品質(zhì)，其中當(dāng)青貯原料自身的含水量達(dá)到或者超過70%時，便會為大量有害微生物提供一個良好的生存環(huán)境，大大增加青貯過程中的腸桿菌、梭狀芽孢桿菌以及異型發(fā)酵乳酸菌等一系列可以增加青貯過程中乙酸含量的菌［53］。進(jìn)一步導(dǎo)致青貯發(fā)生異型發(fā)酵，在異型發(fā)酵的過程中，乳酸會發(fā)生一系列降解反應(yīng)，生成丙二醇以及對青貯過程不利的丙二醇［54］。本試驗所用的原材料柱花草的含水量高達(dá)65.6%，雖然未到達(dá)70%的標(biāo)準(zhǔn)，但也屬于高含水量，同樣也極易發(fā)生異型發(fā)酵，且經(jīng)過CGA添加處理之后，青貯中的乙酸含量大大地增加，這一事實(shí)進(jìn)一步證明了在本試驗過程中，柱花草青貯時異型發(fā)酵乳酸菌占據(jù)了絕對優(yōu)勢，并且綠原酸含量越高，效果越好。同時，在青貯過程中常常會伴有酵母菌存在，它們會導(dǎo)致青貯過程中原材料的乳酸與可溶性糖被大大降解［55］。本試驗中，在添加了0.2%的綠原酸之后，青貯的乳酸含量大幅度提升，這一結(jié)果可能是添加了0.2%的綠原酸之后，酵母菌的數(shù)量被顯著抑制所導(dǎo)致，因此我們可以推測綠原酸提高青貯品質(zhì)是因為綠原酸的加入降低了酵母菌的數(shù)目所致。

植物蛋白酶作為植物生長過程中的重要物質(zhì)，廣泛存在于大多數(shù)植物體內(nèi)，它通過對肽鏈中的肽鍵進(jìn)行水解，進(jìn)而對植物的形態(tài)、衰老、細(xì)胞程序化死亡過程等發(fā)揮著重要的作用［56］。雖然它對于植物來說是一個必不可少的存在，且對植物的逆境脅迫有著重要的意義，但對于青貯飼料而言，它的存在并不是一個好的現(xiàn)象，它會對飼料中的蛋白進(jìn)行降解，大大降低青貯飼料的品質(zhì)，減少青貯飼料的營養(yǎng)成分。所以青貯飼料中的蛋白酶含量也是青貯品質(zhì)檢測的一項重要的指標(biāo)，在本試驗的過程中，添加了0.2%CGA之后，柱花草飼料中蛋白酶的含量顯著降低。這些蛋白酶中，酸性蛋白酶具有較高的耐酸性，在良好的青貯條件下也可以保持較高的活性，大量降解青貯中的蛋白質(zhì)以及一些肽類物質(zhì)［57］。因此在青貯過程當(dāng)中，它依舊可以保持較高的活性而廣泛存在并產(chǎn)生不良影響，目前已有的研究表明，酸性蛋白酶的潛在宿主是一些腐敗菌，其中可以產(chǎn)生酸性蛋白酶的代表性微生物有黑曲霉、米曲霉以及青貯過程中導(dǎo)致腐敗的關(guān)鍵菌芽孢桿菌等［58］。本試驗中加入綠原酸之后，雖然提供了更好的酸性條件，但是青貯中酸性蛋白酶的活性卻大幅下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是，CGA的加入使得柱花草青貯過程中芽孢桿菌的含量大大降低。氨基肽酶作為一種可以自由降解氨基末端的酶，它可以對環(huán)境中的自由氨基進(jìn)行精準(zhǔn)識別并降解，氨基肽酶的存在對青貯過程中的蛋白質(zhì)也有極大的不良影響，它是由大量霉菌產(chǎn)生，其中具有代表性的是：米曲霉等［59］。在加入0.2%CGA之后，它的活性也大大降低。綜上可以發(fā)現(xiàn)0.2%CGA對蛋白酶的活性有著很大的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，CGA的加入對柱花草青貯飼料有著極大的影響，不僅可以降低有害菌大腸桿菌、霉菌、酵母等以及丙酸、非蛋白氮、氨態(tài)氮含量，除此之外還可以降低青貯過程中的pH值。增加干物質(zhì)、乳酸、乙酸的含量。其中0.2%CGA對蛋白酶的活性有更好的抑制作用，0.4%CGA的添加，可以極大地提高了青貯的品質(zhì)，同時對柱花草的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的保護(hù)。本研究證明了綠原酸含量與青貯品質(zhì)有一定的相關(guān)性，但最適添加量有待進(jìn)一步考究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 張瑜，嚴(yán)琳玲，虞道耿，等. 5個柱花草品種苗期對干旱脅迫的響應(yīng)［J］. 種子，2019，38（2）：100-104

［2］ BRAGA G J，RAMOS A K B，CARVALHO M A，et al. Liveweight gain of beef cattle in Brachiaria brizantha pastures and mixtures with Stylosanthes guianensis in the Brazilian savannah［J］. Grass and Forage Science，2020，75（2）：206-215

［3］ 張亞格，字學(xué)娟，李茂，等. 有機(jī)酸對柱花草青貯品質(zhì)和營養(yǎng)成分的影響［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2016，28（5）：1609-1614

［4］ 劉國道，白昌軍，何華玄，等. ‘熱研5號’柱花草選育研究［J］. 草地學(xué)報，2001（1）：1-7

［5］ 申成利，陳明霞，李國棟，等. 添加乳酸菌和菠蘿皮對柱花草青貯品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2012，21（4）：192-197

［6］ DENEK N，CAN A，AVCI M，et al. The effect of molasses-based pre-fermented juice on the fermentation quality of first-cut lucerne silage［J］. Grass and Forage Science，2011，66（2）：243-250

［7］ 王堅，李雪楓，郇樹乾. 柱花草青貯早期發(fā)酵特性及3種植物蛋白酶活性動態(tài)研究［J］. 家畜生態(tài)學(xué)報，2021，42（10）：64-68

［8］ MCKERSIE B D. Proteinases and peptidases of alfalfa herbage［J］. Canadian Journal of Plant Science，1981，61（1）：53-59

［9］ OHSHIMA M，MCDONALD P. A review of the changes in nitrogenous compounds of herbage during ensilage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1978，29（6）：497-505

［10］ 王堅，李雪楓，周漢林，等. 柱花草菠蘿皮混合青貯發(fā)酵品質(zhì)研究［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2014，38（3）：7-10

［11］ WANG C，HE L W，XING Y Q，et al. Fermentation quality and microbial community of alfalfa and stylo silage mixed with Moringa oleifera leaves［J］. Bioresource Technology，2019，284：240-247

［12］ RIGUEIRA J P S，PEREIRA O G，RIBEIRO K G，et al. Silage of marandu grass with levels of stylo legume treated or not with microbial inoculant［J］. Journal of Agricultural Science，2017，9（9）：36

［13］ LI M，ZHOU H L，ZI X J，et al. Silage fermentation and ruminal degradation of stylo prepared with lactic acid bacteria and cellulase ［J］. Animal Science Journal，2017，88（10）：1531-1537

［14］ 李茂，字學(xué)娟，周漢林，等. 不同添加劑對柱花草青貯品質(zhì)的影響［J］. 熱帶作物學(xué)報，2012，33（4）：726-729

［15］ LIU Q H，ZHANG J G，SHI S L，et al. The effects of wilting and storage temperatures on the fermentation quality and aerobic stability of stylo silage［J］. Animal Science Journal，2011，82（4）：549-553

［16］ LI D X，NI K K，ZHANG Y C，et al. Fermentation characteristics，chemical composition and microbial community of tropical forage silage under different temperatures［J］. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2019，32（5）：665-674

［17］ 陳婭，王安琪，劉聰，等. 灰氈毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表達(dá)模式與綠原酸含量相關(guān)性分析［J］. 中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2020，26（9）：167-175

［18］ P?LSSON-MCDERMOTT E M，O’NEILL L A J. Targeting immunometabolism as an anti-inflammatory strategy［J］. Cell Research，2020，30（4）：300-314

［19］ 隋洪玉，李秀霞，趙永勛，等. 蒲公英總黃酮提取液對D-gal衰老模型小鼠腦組織的抗氧化作用［J］. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2004，27（6）：3-4

［20］ 李月影，王月囡，成娜娜，等. 蒲公英燕麥牛奶復(fù)合保健飲料制作工藝的研究［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工，2018 （8）：38-40

［21］ NWAFOR E O，LU P，ZHANG Y，et al. Chlorogenic acid：Potential source of natural drugs for the therapeutics of fibrosis and cancer［J］. Translational Oncology，2022，15（1）：101294

［22］ HUANG S，WANG L，XUE N，et al. Chlorogenic acid effectively treats cancers through induction of cancer cell differentiation. ［J］. Theranostics，2019，9（23）：6745-6763

［23］ 盛天露，張祖良，陳冠宜，等. 蒼耳草與蒼耳子的研究進(jìn)展［J］. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2021，38（12）：2812-2816

［24］ 馮晗，周宏灝，歐陽冬生. 杜仲的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2015，20（6）：713-720

［25］ 王玉潔，接偉光，郭娜，等. 高效液相色譜法同時檢測金銀花中綠原酸和總黃酮及其提取工藝［J］. 糧食與油脂，2022，35（2）：157-162

［26］ 劉暢，溫靜，閻新佳，等. 連翹中酚酸類成分的研究進(jìn)展［J］. 中國藥房，2020，31（12）：1516-1522

［27］ 施文婷，鄧桂海，文珊，等. 一測多評法同時測定蒲公英配方顆粒中5種成分的含量［J］. 中醫(yī)藥導(dǎo)報，2022，28（5）：70-74

［28］ 李文兵，邢冷，盧君蓉，等. 一測多評法同時測定枇杷葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中3種綠原酸［J］. 中成藥，2022，44（1）：202-205

［29］ MARKOVI? S，TO?OVI? J， DIMITRI? MARKOVI? J M，et al. Synergic application of spectroscopic and theoretical methods to the chlorogenic acid structure elucidation ［J］. Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2016，164：67-75

［30］ 王成，王益，周瑋，等. 植物乳桿菌和含水量對辣木葉青貯品質(zhì)和單寧含量的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2019，28（6）：109-118

［31］ 許慶方，玉柱，韓建國，等. 高效液相色譜法測定紫花苜蓿青貯中的有機(jī)酸［J］. 草原與草坪，2007，（2）：63-65，67

［32］ BRODERICK G A，KANG J J J O D S. Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media ［J］. Journal of Dairy Science，1980，63（1）：64-75

［33］ 李玲，趙秀芬，趙鋼. 青貯處理對飼料蛋白質(zhì)組分的影響［J］. 中國草地學(xué)報，2010，32（6）：110-112

［34］ VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A. Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］. Journal of Dairy Science，1991，74（10）：3583-3597

［35］ PLAYNE M，MCDONALD P. The buffering constituents of herbage and of silage ［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1966，17（6）：264-268

［36］ CHEN D D，ZHENG M Y，ZHOU Y X，et al. Improving the quality of Napier grass silage with pyroligneous acid： Fermentation，aerobic stability，and microbial communities［J］. Frontiers in Microbiology，2022，13：1034198

［37］ FELLER U K，SOONG T S，HAGEMAN R H. Leaf proteolytic activities and senescence during grain development of field-grown corn （Zea mays L.）［J］. Plant Physiology，1977，59（2）：290-294

［38］ PETERSON L W，HUFFAKER R C. Loss of ribulose 1，5-diphosphate carboxylase and increase in proteolytic activity during senescence of detached primary barley leaves［J］. Plant Physiology，1975，55（6）：1009-1015

［39］ 吳碩，鄒璇，王明亞，等. 陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報，2021，29（7）：1565-1570

［40］ 丁浩，吳永杰，邵濤，等. 纖維素酶和木聚糖酶對象草青貯發(fā)酵品質(zhì)及體外消化率的影響［J］. 草地學(xué)報，2021，29（11）：2600-2608

［41］ 鄒璇，王成，陳曉陽，等. 桉葉油和迷迭香油對柱花草青貯品質(zhì)的影響［J］. 中國草地學(xué)報，2022，44（2）：89-97

［42］ CAI Y，BENNO Y，OGAWA M，et al. Influence of Lactobacillus spp. from an inoculant and of Weissella and Leuconostoc spp. from forage crops on silage fermentation［J］. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（8）：2982-2987

［43］ HE L W，LYU H J，WANG C，et al. Dynamics of fermentation quality，physiochemical property and enzymatic hydrolysis of high-moisture corn stover ensiled with sulfuric acid or sodium hydroxide［J］. Bioresource Technology，2020，298：122510

［44］ KUNG L，STOUGH E C，MCDONELL E E，et al. The effect of wide swathing on wilting times and nutritive value of alfalfa haylage ［J］. Journal of Dairy Science，2010，93（4）：1770-1773

［45］ HEINRITZ S N，MARTENS S D，AVILA P，et al. The effect of inoculant and sucrose addition on the silage quality of tropical forage legumes with varying ensilability［J］. Animal Feed Science and Technology，2012，174（3/4）：201-210

［46］ MIAO M S，XIANG L. Pharmacological action and potential targets of chlorogenic acid［J］. Advances in Pharmacology，2020，87：71-88

［47］ ZHANG Y X，WEI J P，QIU Y，et al. Structure-dependent inhibition of Stenotrophomonas maltophilia by polyphenol and its impact on cell membrane［J］. Frontiers in Microbiology，2019，10：2646

［48］ MAURY M M，BRACQ-DIEYE H，HUANG L，et al. Hypervirulent Listeria monocytogenes clones’ adaption to mammalian gut accounts for their association with dairy products［J］. Nature Communications，2019，10（1）：2488

［49］ 張適，常杰，胡宗福，等. 青貯飼料有害微生物及其抑制措施［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2017，29（12）：4308-4314

［50］ LI X J，TIAN J P，ZHANG Q，et al. Effects of mixing red clover with alfalfa at different ratios on dynamics of proteolysis and protease activities during ensiling［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（10）：8954-8964

［51］ ZHANG H，CHENG X，ELSABAGH M，et al. Effects of formic acid and corn flour supplementation of banana pseudostem silages on nutritional quality of silage，growth，digestion，rumen fermentation and cellulolytic bacterial community of Nubian black goats［J］. Journal of Integrative Agriculture，2021，20（8）：2214-2226

［52］ 吳云昭，李向廣，尚元賀. 幾株芽孢桿菌生長及產(chǎn)酶特性研究［J］. 云南化工，2024，51（7）：76-80

［53］ 冀紅芹，孟令楠，于明，等. 青貯飼料的質(zhì)量評價［J］. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（6）：92-96

［54］ 郭旭生，丁武蓉，玉柱. 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)評定體系及其新進(jìn)展［J］. 中國草地學(xué)報，2008，30（4）：100-106

［55］ 張鳴珠，黃媛，吳長榮，等. 青貯原料表面微生物研究進(jìn)展［J］. 中國飼料，2022（19）：1-8

［56］ VANDERSTOCKEN G，WOOLF N L，TRIGIANTE G，et al. Harnessing the potential of enzymes as inhaled therapeutics in respiratory tract diseases： a review of the literature［J］. Biomedicines，2022，10（6）：1440

［57］ 張帥，陳栩民，黃海瀟. 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)酸性蛋白酶［J］.食品工程，2023（2）：44-47

［58］ 謝必峰，曹治云，鄭騰，等. 黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所產(chǎn)酸性蛋白酶的分離純化及酶學(xué)特性［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2005，（5）：618-622

［59］ TAYLOR A. Aminopeptidases：structure and function［J］. The FASEB Journal，1993，7（2）：290-298

（責(zé)任編輯 "劉婷婷）