添加不同類型水稻秸稈對植煙連作土壤微生物群落的影響

摘要：為研究添加不同類型水稻秸稈對烤煙連作土壤細菌群落的影響，以無添加土壤為對照（CK），分別添加新鮮水稻秸稈（FS）和腐熟水稻秸稈（RS），利用高通量測序分析3種處理下不同時間（0、7、30、60、90 d）土壤細菌和真菌的群落組成及多樣性。結果表明，新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈能夠顯著提高土壤微生物群落的多樣性和豐富度。FS和RS處理90 d后顯著提高了土壤細菌的Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數及真菌的Chao1 指數。群落結構組成分析表明，FS 和RS 處理提高了變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度；其中FS處理還增加了擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，降低了壺菌門（Chytridiomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）的相對豐度；RS 處理增加了子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，降低了結合菌門（Zygomycota）和壺菌門（Chytridiomycota）的相對豐度。綜上所述，添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈均能改變土壤細菌和真菌的群落構成，改善植煙連作土壤的健康狀態。相較于添加腐熟水稻秸稈處理，添加新鮮水稻秸稈處理會導致致病性真菌豐度的增加。

關鍵詞：水稻秸稈；秸稈還田；微生物群落；植煙連作土壤；Illumina MiSeq測序

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0234

中圖分類號：S154.36

文獻標志碼：A

文章編號：1008?0864（2025）01?0233?08

作物秸稈富含大量的營養元素，如氮、磷、鉀、鐵、錳等，合理利用秸稈可以減少化肥的施用，提高土壤有機質含量[1]，改善土壤質量，保護土壤健康，促進植物健康生長及對養分的吸收利用[2]，有利于農業生產的可持續發展。秸稈的施用可以為土壤提供有效的能源物質，促進土壤微生物的生長[3?4]，秸稈在土壤中的分解速率與病原拮抗微生物群落的豐富度相關[5]。研究秸稈對土壤微生物群落的影響，對于闡明秸稈還田改善土壤狀態具有重要意義。

秸稈還田方式主要為直接還田和間接還田2種[3]。直接還田是將未經腐熟的秸稈通過機械或人工粉碎后直接翻入土壤內的還田方式；間接還田是將秸稈進行腐熟、炭化、焚燒等方式處理后施入土壤的還田方式[6]。研究表明，短時間的秸稈還田會使土壤氮素固定礦化，從而導致植物缺乏氮素，阻礙植物生長[7]。目前秸稈還田中存在的問題已經阻礙了其發展，如秸稈在田間的降解速率在一定程度上影響了土壤肥力，秸稈內纖維物質的分解效率較低，限制了營養物質的轉化[8?9]。土壤微生物是植物-土壤系統中的重要組成部分，是反映土壤微生態環境的重要指標[10-12]。土壤微生物群落在控制土傳病害方面具有很大潛力，如變形桿菌（Proteus）、芽孢桿菌（Bacillus）、根瘤菌（rhizobium）等植物根際促生菌（plant growthpromoting rhinoacteria，PGPR）在生物防治方面被認為是良好的微生物菌劑[13?14]。因此，本研究設置添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈2種處理，探究不同形式秸稈對煙草連作土壤細菌群落的影響，為深入探究水稻秸稈還田方式對湖南長沙煙區連作植煙土壤微生態的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年從湖南省寧鄉市喻家坳煙區（28°17′53.24″N，112°30′62.64″E）選擇連作3 年以上的植煙田，采集0—20 cm 的耕作層土壤，共200 kg。土壤化學性質如下：pH 6.2，有機質30.52 g·kg?1，堿解氮173 mg·kg?1，速效磷15.73 mg·kg?1，速效鉀132.42 mg·kg?1。將采集的土壤帶回湖南農業大學生命科學樓煙草實驗室進行風干，風干后過2 mm篩備用。新鮮水稻秸稈取自當地農田，60 ℃烘72 h，粉碎后過60目篩備用。腐熟秸稈為將新鮮水稻秸稈切碎后，于湖南省寧鄉市喻家坳煙站進行6個月的無氧發酵。

1.2 試驗設計

試驗共設置3個處理：不添加秸稈（CK）；添加4% 新鮮水稻秸稈（FS）；添加4% 腐熟水稻秸稈（RS）。每個處理3次重復。采用恒溫恒濕人工氣候箱進行培養，培養溫度為25 ℃，將500 g土壤與秸稈充分混勻后調節絕對含水量為30%，放置于透氣不透水的組培瓶中培養，保證氣體交換，減少水分散失，每天稱量瓶與土的質量，并添加超純水維持土壤含水量，分別在培養0、7、30、60、90 d時采集土壤樣本。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用DNA抽提試劑盒（天根）提取土壤樣本的微生物基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測DNA含量。以基因組DNA 為模板，使用帶barcode的引物進行PCR，對土壤細菌16S rRNA以及真菌ITS進行高通量測序分析。

1.3.2 原始數據處理

原始數據為FASTQ 格式。使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列進行去雜。去雜參數為：檢測并截去模糊堿基N；并采用滑窗法檢查平均堿基質量，當質量低于20時，截取前面高質序列。去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進行拼接。拼接參數為：最小的overlap 為10 bp、最大的Overlap 為200 bp、最大錯配率為20%。為保證結果的準確性，進行精準去雜，去除含有模糊堿基（ambiguous）、單堿基高重復區（homologous）的序列以及長度過短的序列。同時，利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數據進行預處理生成優質序列之后，采用Vsearch軟件，根據序列的相似性，將相似度≥97% 的歸為1 個操作分類單元（operationaltaxonomic unit，OUT）。使用QIIME軟件包挑選出各個 OTU 的代表序列，并將所有代表序列與Silva（version132）數據庫進行比對注釋。使用RDP classifie 和BLAST 軟件在Unite 數據庫進行物種比對注釋，保留置信區間大于0.7 的注釋結果。

1.4 數據分析

采用IBM SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析。使用R（version 4.1.2）語言vegan包計算細菌和真菌群落的Alpha多樣性，包括Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數。使用Origin進行群落結構柱狀圖可視化。使用R語言中的RandomForest包建立隨機森林模型，將菌群豐度與培養時間相關聯，確定與培養時間相關的關鍵物種。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物群落Alpha 多樣性分析

由表1可知，在培養7 d時，FS、RS處理土壤細菌的Chao 1指數、Shannon指數和Simpson指數均顯著高于CK，而CK處理真菌的Chao1指數顯著低于FS、RS處理；在培養60 d時，FS和RS處理土壤真菌的Chao 1指數、Shannon指數和Simpson指數顯著高于CK；在培養90 d時，FS和RS處理土壤細菌和真菌群落Alpha多樣性指數均較CK顯著增加。因此，添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈均可提高土壤細菌群落的多樣性和豐富度，對土壤真菌群落的多樣性和豐富度影響較小。

2.2 土壤微生物群落結構分析

對不同處理下土壤細菌和真菌在門水平的群落結構進行分析，結果（圖1）表明，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為3種處理的優勢細菌門；子囊菌門（Ascomycota） 和擔子菌門（Basidiomycota）為3種處理的優勢真菌門。對于細菌群落， FS 處理增加了變形菌門、螺旋體門（Spirochaetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度；RS處理增加了變形菌門、螺旋體門、疣微菌門和迷蹤菌門（Elusimicrobia）的相對豐度。對于真菌群落， FS處理增加了擔子菌門的相對豐度，降低了壺菌門（Chytridiomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）的相對豐度； RS處理增加了子囊菌門和擔子菌門的相對豐度，降低了結合菌門（Zygomycota）和壺菌門的相對豐度。

不同處理下土壤細菌和真菌在屬水平的群落結構如圖2所示，可以看出，對于細菌群落，FS處理增加了假秸稈菌屬（Pesudarthrobacter）、苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和腸桿菌屬（Enterobacter）的相對豐度，降低了羅河桿菌（Rhodanobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、楚家菌屬（Chujaibacter）和假橄欖屬（Pseudolabrys）的相對豐度； RS處理增加了苔蘚桿菌屬、鞘脂菌屬（Sphingobium）和卡斯特蘭尼氏菌屬（Castellaniella）的相對豐度，降低了楚家菌屬和假橄欖屬的相對豐度。對于真菌群落， FS處理增加了Apiotrichum、節擔菌屬（Wallemia）和柄孢殼屬（Zopfiella）的相對豐度，降低了脈孢霉屬（Neurospora）、被孢霉屬（Mortierella）和貝克假散囊菌屬（Pseudeurotium）的相對豐度； RS處理增加了毛孢子菌屬（Trichosporon）、周刺座霉屬（Volutella）和柄孢殼（Zopfiella）的相對豐度，降低了假小鬼傘（Copronellus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、脈孢霉屬、被孢霉屬、貝克假散囊菌屬和擬棘殼孢屬（Pyrenochaetopsis）的相對豐度。

2.3 土壤微生物標志性菌屬篩選

為了探索添加不同秸稈對土壤細菌群落標志性物種的影響，根據完全隨機森林模型Gini值的平均降幅，篩選出前30個重要的菌屬，如圖3 所示。對于細菌，CK 處理中最具代表性的菌屬是Ellin6067（圖3A）；FS 處理中最具代表性的菌屬是Devosia 和Candidatus_Koribacter（圖3B）；RS 處理中最具代表性的菌屬是黃桿菌屬（Flavobacterium）和戴氏菌屬（Dyella）（圖3C）。對于真菌，CK 處理中最具代表性的菌屬是毛孢子菌屬和油瓶霉（Lecythophora）（圖3D）； FS處理中最具代表性的菌屬是赤殼屬（Cosmospora）、周刺座霉屬（Volutella） 、Cutaneotrichosporon、Westerdykella、煙草鐮刀菌（Monographella）和霍特曼尼菌屬（Holtermanniella）（圖3E）；RS處理中最具代表性的菌屬是內養囊霉屬（Entrophospora）（圖3F）。

2.4 土壤微生物屬水平LEfSe 分析

LEfSe 分析結果（圖4）表明，在細菌屬水平，CK處理有11種菌屬與秸稈處理存在顯著差異；FS處理有3種菌屬與其他處理存在顯著差異；RS處理有3種菌屬與其他處理存在顯著差異；在真菌屬水平，CK處理有24種菌屬與秸稈處理存在顯著差異；FS處理有12種菌屬與其他處理存在顯著差異；RS處理有9種菌屬與其他處理存在顯著差異。

3 討論

土壤微生物群落是衡量土壤健康狀態的重要指標之一，其活力和數量與土壤理化特性直接相關[15]。在農田生態系統中，秸稈還田是一種有效改善土壤微生態、保證生產可持續發展的措施，可為土壤微生物提供有益于生存的環境和營養條件，提高土壤細菌和真菌的多樣性和豐富度[16?17]。研究表明，土壤中真菌數量的增加會提高作物病害發生的幾率，因此在關注細菌群落變化的同時也要關注真菌群落[18]。本研究表明，相較于CK處理，FS處理培養30 d后顯著增加了土壤細菌群落的Alpha多樣性指數，而RS處理在培養7 d后即可顯著增加土壤細菌群落的Alpha多樣性指數。秸稈還田是項長期的農業措施，秸稈腐解需要微生物的作用，而腐解的秸稈又會給微生物提供營養，促進微生物群落的發展[19]。因此，本研究中腐熟秸稈處理能更早地影響土壤微生物群落。

細菌和真菌可以分解秸稈，在秸稈木質素分解過程中起重要作用，如放線菌（Actinomycetes）可分泌纖維素酶來分解秸稈木質素[20]。研究表明，秸稈還田后Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Ascomycota 的豐度在土壤中快速增長[21?22]。本研究也表明， FS和RS處理均增加了細菌群落中變形菌門、螺旋體菌門和疣微菌門的相對豐度，螺旋體菌門和疣微菌門可能與水稻秸稈的分解有關。添加秸稈可增加土壤中有益菌的豐度，有利于作物的生長，如鞘磷脂單胞菌屬是氮固定與降解污染物的一類有益菌屬[23]。通過隨機森林模型可探索添加新鮮水稻秸稈或腐熟水稻秸稈后標志性的微生物類群[24]。Devosia 和黃桿菌屬作為一種在受污染土壤中經常被檢測到的菌屬，具有良好的生物修復能力[25?26]；周刺座霉屬被證實可能導致黃楊干枯病[27]；內養囊霉屬可以提高木瓜植物生長和品質[28]。本研究表明，Devosia 和黃桿菌屬分別為FS和RS處理的標志性菌屬，表明添加新鮮秸稈和腐熟秸稈對植煙連作土壤有修復作用，且RS處理中有益真菌占主導地位；LEfSe分析顯示，FS和RS處理間的差異更多在真菌上，而FS處理較RS處理具有更多的致病菌。

添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈能顯著提高土壤細菌與真菌的多樣性和豐富度，其中腐熟水稻秸稈能更早地對土壤微生物群落產生影響。添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈處理提高了微生物群落中變形菌門、螺旋體門和疣微菌門等與秸稈分解相關的種群豐度。添加新鮮水稻秸稈和腐熟水稻秸稈均能影響細菌和真菌的群落構成，增加能夠改善植煙連作土壤健康狀態的微生物類群，且腐熟水稻秸稈處理下土壤中致病性真菌的相對豐度較低。

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基金項目：湖南省煙草公司長沙市公司科技項目（20-22A07）；湖南省教育廳資助科研項目（ 20A230）；湖南省教育廳優秀青年科學研究項目（21B0185）。