枇杷核水提物的體外活性及人體美白功效研究

[摘要]目的：探討枇杷核水提物的體外活性、對人體皮膚美白的功效及安全性。方法：通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）自由基清除實驗、小鼠黑素瘤B16細胞活性、黑色素含量以及酪氨酸酶活性實驗，考察枇杷核水提物的體外抗氧化、美白作用；選取色素沉著斑志愿者30例，隨機選擇一側半臉為枇杷核水提物治療組，另側半臉為陰性對照組。比較治療8周后皮膚個體類型角（Individual type angle，ITA°）、皮膚黑色素（MI）指標。結果：枇杷核水提物可清除DPPH和ABTS自由基，半抑制濃度（IC50）值分別是7.98 mg/ml和1.11 mg/ml，在2.5～100 mg/ml濃度對小鼠B16細胞活力無影響，能減少細胞黑色素生成及抑制酪氨酸酶活性。人體美白功效試驗：治療組治療8周后ITA°[（34.02±7.03）]高于治療前[（27.07±5.89）]，治療8周后MI[（162.7±40.20）]低于治療前[（162.7±40.20）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組治療后ITA°和MI比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：枇杷核水提物有良好的體外抗氧化、抑制黑色素生成、酪氨酸酶活性作用且無明顯細胞毒性。人體試驗顯示有美白作用且無不良反應。

[關鍵詞]枇杷核水提物；體外活性；人體功效；美白；功效研究

[中圖分類號]R285" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）01-0010-05

Study on the in Vitro Activity and Human Whitening Effect of Loquat Seed Water Extract

ZHOU Lanhua1， LI Yihong2， ZHAO Rui1， SUN Yuhan2， ZHANG Meina1， YUAN Zhenshuang2，

ZHU Xichun1， LIU Wei3， HUANG Jianmei2

（ 1.Department of Dermatology， Beijing Jingcheng Dermatology Hospital， Beijing 100101， China; 2.Faculty of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China; 3. Department of Dermatology， Air Force Medical Center， PLA， Beijing 100142， China ）

Abstract： Objective" To investigate the in vitro activity， skin whitening efficacy and safety of loquat seed aqueous extract. Methods" The antioxidant and whitening effects of loquat seed aqueous extract were investigated by 1，1-dipheny l-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH）， 2，2'-diaminobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diamine salt （ABTS） radical scavenging assay， mouse melanoma B16 cell activity， melanin content and tyrosinase activity assay;Thirty volunteers with pigmented spots were enrolled in the study. One side of the face was randomly selected as the loquat seed extract group， and the other side as the negative control group. Skin individual type angle （ITA°） and skin melanin （MI） were compared after 8 weeks of treatment. Results" Aqueous extract of loquat seed could scavenge DPPH and ABTS free radicals with IC50 values of 7.98 mg/ml and 1.11 mg/ml， respectively. It had no effect on the viability of mouse B16 cells， but could inhibit the production of melanin and the activity of tyrosinase.Human body whitening efficacy test： ITA degree [（34.02±7.03）] after 8 weeks of treatment was higher than before [（27.07±5.89）]， MI[（162.7±40.20）] after 8 weeks of treatment was lower than before [（162.7±40.20）]， and the difference was statistically significant（P＜0.05）. ITA° and MI were significantly different between the two groups after treatment （P＜0.05）. Conclusion" The aqueous extract of loquat seed has good effects of antioxidation， melanogenesis inhibition and tyrosinase activity in vitro and has no obvious cytotoxicity. Human trials show that it has whitening effect and no adverse reactions.

Key words： aqueous extract of loquat seed; in vitro activity; human body efficacy; whitening; efficacy study

美白劑的開發成為近年來化妝品行業關注的熱點，而目前常用的美白劑種類有限，如熊果苷、曲酸、氨甲環酸、維生素C等，存在穩定性不足、皮膚刺激性等缺點[1-2]。枇杷屬蕃薇科，枇杷核其種子內含氨基酸、維生素、多酚類、黃酮類和三萜類化合物等成分[3-4]。成分分析表明，枇杷核具有潛在的延緩衰老、抗氧化、抗炎、防止皮膚變黑、保濕以及營養皮膚的功效[3-7]。本研究通過探討枇杷核水提物的體外活性、對人體皮膚美白的功效及安全性。為其作為美白劑的開發應用提供實驗基礎。現報道如下。

1" 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和材料：多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；臺式低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（河南省予華儀器有限公司）。鮮枇杷核（福建省莆田市祥云堂藥業提供）；苯乙基間苯二酚（377，天津市大茂化學試劑廠）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，APEXBIO 公司）；2，2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS，上海易恩化學技術有限公司）；MTT（LABLEAD公司）；酪氨酸酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）

1.1.2 細胞株：小鼠黑素瘤B16細胞（北京北納創聯生物技術研究院提供）。

1.2 方法

1.2.1 枇杷核水提物的制備和成分分析

1.2.1.1 枇杷核水提物的制備：鮮枇杷核100 g，稱取并加入1 000 ml去離子水，80℃加熱回流1 h，重復2次。過濾后合并續濾液，70℃旋蒸濃縮，-80℃冷凍成固體后放入凍干機得枇杷核提取物凍干粉。取凍干粉適量，去離子水充分溶解，得到枇杷核水提液。

1.2.1.2 枇杷核水提物的成分分析：過色譜柱，質譜檢測分析。

1.2.2 枇杷核水提物抗氧化活性實驗

1.2.2.1 DPPH自由基清除實驗：取0.1 mmol/L DPPH與等體積不同質量濃度的枇杷核水提物溶液混合，暗室室溫反應30 min，波長517 nm 處測定其吸光度，記為Ai，空白的吸光值為A0，Aj為無DPPH時枇杷核水提物的吸光值。DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.2.2.2 ABTS自由基清除實驗：取等體積的ABTS和K2S2O8溶液混合，用PBS稀釋至734 nm處吸光度為0.7左右，再與等體積不同質量濃度的枇杷核水提物溶液混合，靜置，于波長734 nm處測吸光度，記為Ai，空白的吸光值為A0，Aj為無ABTS時枇杷核水提物的吸光值。ABTS自由基清除率%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.2.3 基于小鼠B16黑素瘤細胞的美白實驗

1.2.3.1 B16細胞形態學實驗：96孔板接種培養B16細胞，設置空白對照組及不同濃度給藥組。加入不同濃度（9個濃度）的枇杷核水提物培養基溶液。孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察其細胞形態并拍照。

1.2.3.2 B16細胞活力實驗：采用MTT法測定B16細胞活力。96孔板接種培養B16細胞。設置空白對照組及不同濃度給藥組。加入不同濃度（8個濃度）的枇杷核水提物培養基溶液，孵育24 h。先后加入MTT（5 mg/ml）、DMSO溶液，酶標儀于490 nm波長處測各孔的吸光值。A為給藥組的平均吸光度值；B為對照組（不給藥）的平均吸光度值；C為調零組（只含有DMSO）的平均吸光度值。細胞相對存活率=（A-C）/（B-C）×100%。

1.2.3.3 B16細胞黑色素含量實驗：采用NaOH裂解法測定細胞內黑色素含量。12孔板接種培養B16細胞。設置空白對照組、陽性藥組及不同濃度給藥組。孵育后分離細胞，離心，加入NaOH溶液（含10% DMSO），80℃水浴孵育，離心取上清液于酶標儀下檢測405 nm處吸光度。A為給藥組的平均吸光度值；B為對照組的平均吸光度值；C為調零組（只10%DMSO的1 mol/L的NaOH溶液）的平均吸光度值。細胞內黑色素含量（%）=（A-C）/（B-C）×100%。

1.2.3.4 酪氨酸酶活性實驗：選用L-Dopa氧化法測定細胞內酪氨酸酶活性。B16細胞接種孵育、給藥再孵育均與“1.2.3.3”項下相同。96孔板中加入細胞裂解離心后的上清液，加L-Dopa溶液（5 mmol/L），37℃孵育。475 nm波長處測定各孔的吸光度至其穩定。給藥組平均吸光度值為A；對照組為B。細胞內酪氨酸酶活性（%）=A/B×100%。

1.2.4 人體美白功效測試

1.2.4.1 研究對象：選取2022年7月-2023年10月筆者醫院門診的32例年齡18～60歲面部褐色沉著斑患者。知情同意后入選。其中2例因個人原因退出。最終有效數據30例，皆為女性，平均年齡（28.4±8.7）歲。每人半側臉按隨機數字法進行分組，一側半臉為枇杷核水提物治療組（產品A組），另側半臉為對照組（產品B組）。納入標準：①年齡18～60歲；②雙側面部擬受試區域皮膚至少各有一處對稱性的褐色色素沉著斑片，且直徑不小于3 mm（非雀斑、色素痣）；③患者對本研究知情，并簽署知情同意書。排除標準：①有嚴重的系統性疾病或其他皮膚病者；②有嚴重皮膚過敏史者；③近1個月內接受過任何形式的面部皮膚治療、果酸、激光或美容手術者，試驗期間無法避免紫外線曝曬者；④受試部位1個月內有外涂抗炎藥物者；⑤近1個月內參加藥物臨床試驗者或其他化妝品功效評價者；⑥妊娠或哺乳期婦女。

1.2.4.2 試驗樣品：具體如下。①產品A（治療組）：枇杷核水提物溶液（濃度為80 mg/ml）、促滲劑（0.4%N-甲基吡咯烷酮）；②產品B（對照組）：無菌水、促滲劑（0.4%N-甲基吡咯烷酮）、調色劑（0.10 mg/ml焦糖色素）。

1.2.4.3 測試儀器：皮膚色度儀（德國CK公司型號：MPA4，包含Mexameter MX18、Skin Colorimeter CL400探頭）、ViewSkin皮膚圖像分析儀（中國安德公司）。

1.2.4.4 環境條件：測試環境處于恒溫恒濕，溫度20℃～22℃，濕度40%～60%。

1.2.4.5 測試方法：采用隨機、雙盲、半臉對照試驗設計。具體操作如下：產品使用由患者在家中進行。每天早晚各1次，使用前先清潔面部并擦干，按分組分別給予兩側面部1 ml的產品Ａ和產品Ｂ涂抹，涂抹后立即用水溶面膜紙覆蓋15 min。研究者在第0天、第4周、第8周與每位患者約定在醫院對其皮膚生物特性進行評估，測量左右面部的皮膚個體類型角、皮膚黑色素指標，取平均值（重復測定3次）。個體類型角（ITA°）：皮膚色度儀顏色探頭（CL400）測得。ITA°大小與膚色深淺度呈單調遞減關系。黑色素指數（MI）：皮膚色度儀黑色素探頭（MX18）測得。MI值大小與皮膚黑色素含量多少呈單調遞增關系。

1.3 統計學分析：將數據導入Graph prism 8.0、SPSS 25軟件進行數據處理和可視化分析。計量數據表示為：均值±標準差（xˉ±s），并進行正態分布性檢驗和基于均值的方差齊性檢驗（α=0.05），符合正態分布要求和方差齊性，采用單因素方差分析、自身對照前后比較采用配對t檢驗，否則采用兩個相關樣本秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 枇杷核水提物的成分分析：質譜分析共鑒定得到99種化合物。營養成分包括脂肪酸類化合物棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等7種和氨基酸類化合物。功能成分包括糖苷類化合物苦杏仁苷和異柚葡糖苷2種，酚酸類化合物綠原酸、阿魏酸、龍膽酸等12種，揮發油類化合物苯甲酸、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯等16種，黃酮類化合物槲皮素、蘆丁、山柰酚等15種，和三萜類化合物熊果酸、樺木酸、齊墩果酸等26種。

2.2 枇杷核水提物抗氧化活性的測定：枇杷核水提物能清除DPPH（見圖1A）和ABTS（見圖1B）自由基，半抑制濃度（IC50）值分別是7.98 mg/ml和1.11 mg/ml。具有抗氧化活性。見圖1。

2.3 枇杷核水提物對小鼠B16黑素瘤細胞的美白實驗

2.3.1 B16細胞形態學實驗：對照組B16細胞生長良好，形態正常。主要為兩極的貼壁生長的上皮型細胞。加入不同濃度的枇杷核水提物后，細胞形態均未出現明顯變化。見圖2。

2.3.2 B16細胞活力測定：經不同濃度枇杷核水提物（2.5～100 mg/ml）處理24 h，與空白組相比，B16細胞活性差異無統計學意義（P＞0.05）。此濃度范圍對B16細胞無毒性。見圖3。

2.3.3 B16細胞黑色素含量抑制實驗：枇杷核水提物抑制B16細胞黑色素生成，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

2.3.4 B16細胞酪氨酸酶活性抑制實驗：枇杷核水提物明顯抑制B16細胞的酪氨酸酶活性，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.4 人體美白功效測試結果

2.4.1 患者基本情況及不良反應：30例色斑患者完成試驗，未發生不良反應。

2.4.2 皮膚個體類型角和黑色素客觀指標比較：治療前枇杷核治療組（產品A）與對照組（產品B）ITA°和MI平均值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療8周后治療組ITA°平均值均較治療前上升，MI平均值均較治療前下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組ITA°和MI平均值較治療前差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后治療組和對照組ITA°和MI比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1～2。

3" 討論

本研究采用加熱回流提取法獲得枇杷核水提物，液質聯用初步分析水提物的主要成分為三萜類、黃酮類、多酚類、脂肪酸類等物質。本研究選用了DPPH、ABTS自由基清除實驗來測定枇杷核水提取物的抗氧化活性，實驗結果顯示清除效果明顯。其原因可能與枇杷核中黃酮、多酚類還原類物質可與自由基的單電子配對而清除自由基相關[5-8]。基于氧化應激在色斑的形成中起到重要作用[14]，提示有體外抗氧化功能的枇杷核水提物具有潛在的美白功效。

黑色素的多少和皮膚顏色深淺呈單調遞增關系，過多的黑色素會導致膚色變黑、出現色斑，甚至會引起皮膚癌變。酪氨酸酶起到了調控皮膚黑色素生成的速度及數量的關鍵作用。本研究采用與人體黑素細胞生理上較為接近的小鼠黑素瘤B16細胞作為研究模型，通過測定細胞增殖率、黑色素含量以及酪氨酸酶活性，在細胞水平檢測了枇杷核水提物的體外美白活性，對枇杷核水提物的細胞安全性和美白作用機制進行了初步研究，結果顯示，枇杷核水提物在濃度為2.5～80 mg/ml時，對細胞無明顯毒性作用。為枇杷核水提物應用安全性提供了依據。并發現枇杷核水提物能抑制小鼠B16黑素瘤細胞黑色素的生成及酪氨酸酶的活性。其作用機制可能與其成分中含有不飽和脂肪酸α-亞麻酸和亞油酸能加速酪氨酸酶蛋白降解、含多酚類物質可與酪氨酸轉化酶結合，抑制酪氨酸酶的活性，從而阻止黑色素的生成，防止皮膚變黑或出現色斑[8-13]。皮膚氧自由基激發的氧化損傷及酪氨酸酶活性增強是誘導皮膚黑色素增多的主要因素[14]。體外實驗顯示了枇杷核水提物的美白活性。在體外抗氧化實驗和細胞黑色素含量、酪氨酸活性實驗中都選取了苯乙基間苯二酚（377）作為陽性對照物，源于377作為公認的美白劑收錄于2015版化妝品準用目錄，可強效抑制酪氨酸酶并具抗氧化功效[15]。

本研究還通過人體美白功效試驗驗證了枇杷核水提物的人體皮膚美白功效。試驗采用隨機、雙盲、半臉對照的設計方案，結果評估采用了客觀指標表示皮膚顏色的ITA°和黑色素含量的MI值，避免了主觀評價的缺點，增加了結果可靠性。半臉對照的試驗方法有效減小了個體誤差。試驗中30例患者均無不良反應，也初步驗證了枇杷核提取物原料使用的安全性。但本研究樣本量較少，僅30例，結果有一定局限性。如樣本量進一步擴大，可進一步驗證枇杷核水提物的人體美白功效性及安全性，為新美白劑的開發應用提供更多的依據。

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[收稿日期]2023-12-19

本文引用格式：周瀾華，李憶紅，趙蕊，等.枇杷核水提物的體外活性及人體美白功效研究[J].中國美容醫學，2025，34（1）：10-14.