微生物實驗教學中微波爐對廢菌滅活處理方法的探索

摘"要：高校微生物教學中菌類相關課程較多，為了降低廢菌對實驗室生物安全的威脅，避免其損害學生及教師的生命健康，本文以實驗室常用的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、根霉和黃曲霉為例，利用微波爐對其進行不同時長的照射處理，發現兩種細菌在固體和液體環境中的滅活分別需要3min和2min，三種霉菌在固體和液體環境中的滅活分別需要2min和1.5min。該廢菌滅活方案造價低、易操作、耗時短、效率高，適用于本科微生物教學實驗室中學生的使用。因此可以安排在相關實驗教學課程當中，并推廣至醫學、科研類實驗室。

關鍵詞：高校微生物教學；生物安全；廢菌；微波爐；滅活

中圖分類號：Q933""文獻標識碼：B

1"高校本科微生物教學實驗室生物安全現狀

高校微生物實驗課主要是為了讓學生掌握各類微生物相關的實驗基本操作，其中“細菌革蘭氏染色與形態觀察”“霉菌制片與形態觀察”是微生物實驗課中較為重要的課程，該實驗教學目的是讓學生掌握細菌和霉菌形態觀察的制片方法，并認識其形態結構，從而把理論的、抽象的知識具體化，鍛煉學生動手操作能力，培養學生學習興趣。然而，該課程的開展也引起了以下一些問題。

1.1"實驗室環境復雜

進入實驗室的本科生基數較大，需要的細菌和霉菌的實驗材料較多。微生物隨著實驗操作過程中產生的氣溶膠而擴散［1］，其中霉菌會附著在空氣中的塵埃里［2］，因此實驗結束后，如果這些材料沒有得到及時滅活處理，會造成實驗室的嚴重污染。目前各類呼吸道流行傳染疾病較為高發，實驗室微生物污染不僅會影響學生實驗結果，還會增加教師和學生呼吸道感染、皮膚過敏等疾病的發病概率［3］。

1.2"學生缺乏實驗室經驗

進入高校本科教學實驗室的群體主要是毫無科研實驗經歷的本科生，他們對實驗原理理解不夠深入、儀器使用不熟練、藥品材料性能不了解、缺乏實驗應變能力，加之本科生基數較大，課程時間有限，教師很難做到一對一詳細的實驗指導和監督，這些因素給實驗室的廢菌處理工作增加了一定的難度。

1.3"微生物滅活方法不適用

目前常用的微生物滅活方法較多，物理方法如加熱、紫外線［4］等，然而加熱不徹底會造成二次污染，紫外線照射的范圍有限，效果不定；化學方法如漂白水、酸堿試劑和酒精等，該方法藥品用量較大，并且細菌的細胞壁成分復雜，對消毒劑的敏感程度具有選擇性，更有大量的化學殘留；生物療法如抗生素等，造價太高［56］。

經調研發現，微波的產熱功能能夠殺滅微生物［7］，并且病原微生物的細胞液吸收微波的能力強于周圍其他物質，因此微波可以殺滅細菌、霉菌、病毒和細菌芽孢［8］。微波爐具有熱效率高、耗電量小、方便快捷等特點，現今在普通家庭生活和實驗室中使用非常普遍。實驗設定了固體和液體滅菌環境、不同的微波爐照射時間，從而對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、根霉和黃曲霉進行滅活處理，以確認微波爐對菌類滅活的有效性。

2"基于微波爐的廢菌滅活實驗

2.1"實驗儀器與材料

2.1.1"實驗儀器

微波爐（美的M1231E）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安LDZX50KBS）、培養箱（博迅）等。

2.1.2"菌種

大腸桿菌（ATCC35218）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、青霉（ATCC36839）、根霉（GM10）、黃曲霉（ATCC9643），購自普通微生物菌種保藏中心，本室傳代保存。

2.1.3"培養基制備

牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl"5g、瓊脂10g、水1000mL。土豆PDA培養基：土豆200g、瓊脂10g、葡萄糖20g、水1000mL。

2.2"實驗設計

2.2.1"固體培養基中菌類滅活

將準備好的不同細菌和霉菌玻璃平板（每個平板內帶菌固體培養基10g）置于微波爐托盤中央高火照射至預定時間，取出放涼后，拿至超凈工作臺中分別接種至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固體斜面（已滅菌），培養箱37℃和28℃，逐日觀察是否有對應菌長出。

2.2.2"液體培養基中菌類滅活

取準備好的不同細菌和霉菌菌液（OD600=0.8）10mL于三角瓶中，將其置于微波爐托盤中央高火照射至預定時間，取出放涼后，拿至超凈工作臺中分別接種至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固體斜面（已滅菌），培養箱37℃和28℃，逐日觀察是否有對應菌長出。

2.2.3"數據統計

周滅活率=（該組總樣品數-周長菌樣品數）/該組總樣品數×100%，本文實驗次數大于等于3，圖表中為平均滅活率。

2.3"實驗結果

2.3.1"微波爐對細菌的滅活效果

如表1所示，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在固體和液體環境中，分別經微波爐照射180s和120s，基本可達到廢菌滅活效果。有研究發現微波爐對革蘭陰性桿菌的作用強于革蘭陽性菌［9］，這與本文的結果也是相符的。然而消毒滅菌的效果與樣本量也有著十分明顯的正相關關系，因此在實際應用過程中，需要根據廢菌重量、體積和濃度設定好微波爐照射時間。

2.3.2"微波爐對霉菌的滅活效果

通過對微波爐照射后接種的青霉斜面觀察，無論固體還是液體環境中，微波爐照射30s滅活率可達到50%，照射60s菌體基本已完全被滅活，照射90s可達到100%；根霉在固體和液體環境中分別照射120s和90s菌體基本已完全被滅活；黃曲霉在固體和液體環境中分別照射120s和90s可達到100%的滅活率（表2）。在實驗過程中發現：（1）三種霉菌經微波爐照射后生長較為緩慢，這說明微波爐的輻射對霉菌產生了較大的損傷；（2）青霉在固體和液體環境中的滅活所需的微波爐照射時間基本相似，且與根霉和黃曲霉相比更容易被滅活；（3）根霉和黃曲霉在液體環境中更容易被滅活。

綜上所述，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌若在固體環境中需要經微波爐照射3min，在液體環境中需要照射2min可達到完全的滅活；青霉無論在液體還是固體環境中，經微波爐照射1.5min可達到完全的滅活；根霉和黃曲霉在液體和固體環境中，分別經微波爐照射1.5min和2min可達到完全的滅活。根據以上數據發現：（1）微波爐對霉菌的滅活比細菌效率高，這可能是由于霉菌的孢子暴露在空氣中，更容易被滅活；（2）液體環境中微波爐的滅菌效率更高。

因此，在“菌類的制片與形態觀察實驗”實驗結束之后，要求學生將廢棄固體廢菌置于玻璃平皿或者燒杯中，液體廢菌置于三角瓶或者燒杯中，按照下圖進行廢菌處理。由于微波爐對細菌和霉菌的滅活率與其種類、質量、體積和濃度有關，因此在應用中要根據實際情況設定好微波爐照射時間，經滅活處理后再丟棄，并清洗相關器具。該方法處理比較集中、造價低、耗時短、使用便捷、易操作，非常適用于實驗技能較薄弱的本科生。

3"實驗教學實施過程及時間安排

在菌類的制片與形態觀察課程中，教師需要在講述實驗原理和操作之后，向學生講述微波爐滅活的細節和方法及生物安全的重要性，讓學生理解接受實驗后對廢菌處理的方法和必要性。表3中的4—7步驟為該課程加入的四個步驟。學生實驗完成后，要求學生按照“三步法”完成實驗室消毒工作，第1步，按照文中實驗得到的結論（上圖）以微波爐法處理固體或者液體廢菌，本文在實驗中每個樣品量較少，如果學生廢棄樣品重量或者體積較大，需要延長微波爐照射時間，以確保滅活的有效性；第2步，用75%的酒精清潔實驗室臺面、地面及空氣；第3步，用75%的酒精處理垃圾桶，并清理垃圾。在實驗室清理消毒過程中，教師做好監督管理，避免學生將活菌直接丟在垃圾桶當中。

4"教學討論及反思

在以往的實驗教學中，實驗人員會在學生實驗下課之后進行廢菌處理，并對教室進行消毒清理，這種方法雖然減輕了課程壓力，但是導致學生忽視病原菌類的危害性、生物安全的緊迫性和實驗室環境安全的重要性，并在實驗過程中過度放松隨意，引起個人及實驗室大面積的廢菌污染。菌類的制片與形態觀察課程實驗較為簡單，學生基本在一個課時之內就能完成實驗及結果觀察分析，將生物安全的講解、廢菌處理、實驗室環境衛生清理納入該課程具有可行性和必要性。這部分課程內容的加入讓學生在實驗操作中保持對微生物的警惕性，在實驗后能夠認真積極地應用微波爐進行廢菌處理和實驗室衛生清理，一方面分擔了實驗室工作強度，維持了良好的實驗室環境，另一方面讓學生在掌握實驗技術的過程中，加強生物安全、實驗室環境安全和生態安全的意識，為自己和他人的生命健康安全負起責任。

目前已有微生物實驗室［10］和臨床細菌檢驗中［11］對常用培養基、相關器具［12］、實驗服［13］等進行微波爐滅菌處理。因此，在微生物教學實驗室中，可以利用微波爐的滅菌功能對相關器具材料進行處理，從而保證學生的實驗順利開展，該方法極大地節約了時間及能源。此外，不同實驗室由于實驗內容和微生物污染的種類不同，其他醫療衛生、食品、科研機構應根據本實驗室的實際情況設定微波爐滅活方案，并結合多種方法來維護實驗室生物安全。

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