土壤滅菌與叢枝菌根真菌在緩解連作障礙中的研究進展

關鍵詞：連作障礙；緩解；高溫滅菌；強還原滅菌；叢枝菌根真菌

設施農業在我國農業生產中占有重要地位，它的快速發展使得普遍存在的連作障礙問題愈加凸顯。連作后，土壤環境惡化、植物生長受抑、產量與品質降低，嚴重制約我國設施農業的可持續發展。輪作、嫁接、土壤滅菌等多種措施被用于緩解連作障礙，以改善土壤環境與植物營養狀況。其中，以高溫悶棚與土壤強還原為主的土壤滅菌技術較其他措施更直接，且經濟有效。土壤滅菌可以消殺病原，但滅菌后土壤微生物數量銳減，而土壤養分的有效化與土壤微生物的活動密不可分。因此，適時引入有益微生物以創造健康的微生態環境是關鍵[1]。叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是一類常見的土壤有益微生物，該類真菌可侵染植物根系形成菌根，AM真菌與其他有益微生物或農藝措施表現出良好的協同作用，在緩解連作障礙中具有極大的應用潛力[23]。

1 設施農業與連作障礙概述

近年來，我國設施農業迅猛發展，截至2020年，我國設施栽培面積達400萬 hm2，其中溫室大棚栽培面積突破370 萬 hm2[4]。較高的經濟效益與市場需求助推了設施栽培面積和產量的逐年攀升。在設施農業生產中，往往因追求高產而過度投入肥料與水分，隨著栽培年限的延長，加上對設施的高強度使用，造成了土壤嚴重退化；同時，蔬菜與果實中硝酸鹽含量累積，品質下降，連作現象在設施作物栽培中普遍存在（表1）。

連作障礙是指在同一土壤中連續多年種植同種或同科作物產生的一種使作物長勢變弱、品質和產量下降的現象。我國是農業大國，在現代設施農業高速發展的同時，設施栽培高度集約化和長期單一化的連作趨勢也越來越明顯。隨著栽培年限的延長，普遍出現了土壤質量退化、養分失衡、土傳病害嚴重等連作障礙問題，嚴重阻礙我國設施農業的可持續發展。

1.1 連作障礙成因

連作障礙產生的原因錯綜復雜，主要包括土壤理化性質的改變、土壤中部分營養物質的缺乏、化感自毒物質的產生、土壤中有益微生物的減少及有害微生物的增加、前茬作物種植時殘留在土壤中的病原菌、病蟲害加劇等；另外，設施條件下水肥管理不科學也是引發連作障礙的重要原因之一，生產中為了提高產量，過量施用化肥，尤以氮肥最突出，通常氮肥施用量是作物需求量的3～5倍，隨著連作年限的增加，殘留的氮在土壤中大量積累，不僅降低了土壤的氮素轉化能力和氮肥利用率，影響植物根系對氮素的吸收，同時也降低了其他營養元素的有效性。此外，因濫用農藥及農藥殘留，同樣破壞了土壤微生態與營養元素的平衡，導致一些有益于作物生長的因子過度流失[4， 15]。

1.2 連作的危害

連作后土壤質量明顯惡化，主要表現在土壤理化性質、土壤酶活性、土壤微生物數量及活性等方面，且隨著連作年限的增加惡化程度隨之增加。研究發現，大蒜長期連作后土壤速效鉀、銨態氮、硝態氮及有機質的含量降低；土壤過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性顯著降低；土壤中細菌、放線菌數量減少，而真菌數量增加，使土壤微生物區系從高肥的“細菌型”向低肥的“真菌型”轉化，且連作10年較連作5年的土壤酶活性及土壤細菌與真菌的比值均顯著降低[16]。對連作蕓豆的研究也發現，連作降低了土壤有機質、氮、磷含量和pH，抑制了土壤過氧化氫酶、堿性磷酸酶、多酚氧化酶、脲酶及蔗糖酶活性，且隨著土層深度增加，酶活性逐漸降低[10]。對于作物而言，表現為生長受抑、產量品質下降、抗性減弱、土傳病害加劇[17]。

2 連作障礙緩解措施

目前，緩解連作障礙的措施主要有合理輪作與間套種、合理配比有機與無機肥料并科學施用、噴施藥物、選用抗病品種、土壤消毒等。其中，土壤消毒成本相對較低、操作簡單有效且對環境危害較小，該技術可分為物理消毒、化學消毒以及生物消毒。物理消毒是利用各種熱源使土壤耕層溫度達到50 ℃以上，以達到滅菌的效果，物理消毒的方法有很多，如蒸汽消毒、太陽能消毒、熱水消毒、火焰消毒等[17]，在生產實踐中以太陽能消毒應用最廣泛，即高溫悶棚；化學消毒中最常見的是熏蒸消毒，早期的熏蒸劑主要是環境毒性較高的溴甲烷，后被環境毒性相對較低的氯化苦、棉隆、威百畝等取代，這些新型熏蒸劑在改善土壤性質、促進作物生長方面取得了良好效果[12]。但是，熏蒸劑在土壤中累積對環境造成潛在污染和危害，其安全性和穩定性有待進一步提高。

2.1 物理措施

2.1.1 高溫滅菌 高溫悶棚是指在夏季農閑期間，關閉設施所有通風口，利用強光照射同時覆蓋塑料薄膜使土壤溫度迅速升高，利用高溫殺死土壤中的病、蟲與草等有害生物。高溫悶棚可以有效抑制土壤中的有害真菌，降低真菌豐度和多樣性，有效改善土壤生態環境，且悶棚時間越長抑菌效果越明顯[18]。高溫悶棚起源于1976年以色列學者報道的土壤日曬技術，在國外土壤日曬是一種盛行的土壤消毒方法[19]。高溫悶棚技術在我國的研究起步較晚，是根據我國的種植條件由土壤日曬技術改進而來。研究表明，土壤日曬可有效降低假單胞菌對番茄植株的感染，且植株發病率顯著下降[20]。日曬后辣椒莖腐病的平均發病率由66%降到9%，高溫滅菌超過46.4 ℃是病原體致死的主要原因[21]。隨著相關研究的不斷開展，探究日曬與耕作方式、覆膜材料屬性及施肥類型等相結合對土壤物理性質尤其是熱性質的影響將成為該領域的研究重點[22]。

悶棚時溫度的選擇至關重要，土壤微生物對溫度比較敏感，日曬對一些微生物有利的同時對另一些微生物有害。Ihara 等[23]選取30、40、45、50 ℃對土壤樣品進行0、1、7和28 d的高溫處理，測定高溫處理對硝化活性的影響，這些微生物在45和50 ℃下的活性比在30 ℃下更高，表明較高溫度處理導致微生物種群向硝化微生物轉移，并且隨著處理時間的延長這種轉移更明顯。如果土壤中硝化細菌減少，一方面會導致土壤微生物生物量和土壤有機質釋放的NH+4-N 積累，過量的NH+4-N會產生氨氣，氨氣對植物有一定的毒害作用；另一方面，土壤中硝化細菌減少會影響硝化作用進行，通常在通氣良好的土壤中，NH+4-N在硝化細菌參與下經硝化作用會迅速轉化為NO-3-N，NO-3 -N是大多數植物從土壤中吸收氮的主要形態之一，其含量在一定程度上對植物的正常生長發育起到間接調控作用。

目前，高溫悶棚技術已成功應用于土壤連作障礙緩解，并且效果明顯[24]。研究發現，該技術對致病力強的病毒（如煙草花葉病毒）防控效果甚微，但對致病力弱的病毒具有較好的防控效果[25]，所以高溫悶棚技術在設施農業生產中極具推廣與應用潛力。

2.1.2 強還原滅菌技術 強還原滅菌（reductivesoil disinfestation，RSD）最初是作為化學熏蒸的替代方法被日本科學家和荷蘭科學家開發應用，在日本該方法主要是基于水稻在水旱輪作條件下對土傳病害耐受性的研究而發展起來的，也被定義為生物土壤滅菌（biological soil disinfestation，BSD），而荷蘭的研究則更注重于土壤厭氧環境的創造，稱為厭氧土壤滅菌（anaerobic soil disinfestation，ASD）。RSD的主要步驟是：先向土壤中添加易分解的有機物料，然后淹水至田間最大持水量，最后用塑料薄膜覆蓋土壤表面2～15周，通過維持土壤厭氧狀態達到滅菌目的。RSD 滅菌的基本原理是：在短時間內創造強烈的厭氧環境使好氧微生物無法生存；有機物料的分解與發酵能夠使氧化還原電位發生變化并產生對病原菌有毒有害的物質，從而抑制病原菌的生長，造成微生物群落結構的改變[2627]。

①有機物料對RSD 滅菌效果的影響。有機物料是影響RSD滅菌效果的關鍵因素之一，不同的有機物料因理化性質和降解的難易程度不同，淹水后所創造的強還原環境存在較大差異，從而直接影響RSD效果[27]。就有機物料的形態而言，多以固態的滅菌效果較好。王寶英等[28]以芥藍為試驗材料，于土壤中分別添加固體與液體有機物料對其進行RSD處理，結果發現，固體有機物料在減少土壤NO-3-N積累、提高土壤細菌與真菌比值、增強微生物活性、降低芥藍根腫病的發病率、提高產量等方面均顯著優于液體有機物料。在以氨水、苜蓿粉、乙醇為有機物料的RSD處理中也發現，固體有機物料對土壤根際微環境的改善效果優于液體有機物料，表現為0—20 cm土層處施加苜蓿粉處理的細菌數量顯著增加121.42%，而施加氨水和乙醇處理的土壤細菌數量與未滅菌處理間無顯著差異；施加苜蓿粉和乙醇處理的真菌數量顯著降低71%和84%，施加氨水處理的真菌數量與未滅菌處理差異不顯著；另外，苜蓿粉、乙醇與氨水處理的尖孢鐮刀菌數量分別降低98%、93% 與74%[29]。

有機物料的碳氮比（C/N）在一定程度上也影響RSD效果，過低的C/N（lt;20～25）使得土壤中的氮不易被固定，過高的C/N會因微生物與作物間競爭氮素從而影響作物對氮營養的吸收[30]。李云龍等[13]在探究三七連作障礙因子的研究中，采用高C/N（94）有機物料和低C/N（19）有機物料進行RSD處理發現，低C/N處理的土壤微生物活性最高，而高C/N處理的細菌和真菌數量顯著低于未滅菌處理和低C/N處理；RSD使尖孢鐮刀菌數量及其與真菌的比例顯著下降，且以低C/N處理殺滅尖孢鐮刀菌效果更佳，但與高C/N處理間差異不顯著，2種處理的殺菌率均高于99.7%；此外，低C/N處理的三七苗存活率高達66.7%。有機物料的添加量對RSD的滅菌效果起決定性作用。在以紫花苜蓿為有機物料修復設施退化土壤的研究中證實，RSD 處理完全消除了土壤中積累的NO-3-N和SO24 -，降低了土壤電導率，且紫花苜蓿施用量越大，NO-3-N和SO24 -去除越快，pH和電導率的變化幅度也隨紫花苜蓿添加量的增加而增大[31]。在番茄上的研究卻發現，添加0.00、2.08、4.16、8.32 g·kg-1的有機物料均能促進番茄根系伸長，增大根表面積，提高番茄地上部生物量，且隨著有機物料添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，其中有機物料添加量為4.16 g·kg-1 時，番茄植株的生長狀況最佳[32]。由此可見，有機物料添加量并不是越多越好，其用量應綜合考慮物料本身的性質、處理土樣的性狀、土傳病原菌對RSD 處理的抗性、處理溫度及時間等因素，以選出適宜的有機物料添加量。

② RSD對土壤肥力的影響。通過添加有機物料和厭氧發酵，RSD能在短時間內顯著改善土壤理化性狀[33]。研究發現，RSD處理能有效提高土壤中全氮、全磷和全鉀含量，并促進堿解氮、速效磷、速效鉀等土壤速效養分在土壤中的轉化積累，顯著降低土壤NO-3-N含量，增加土壤NH+4-N含量[34-37]。土壤有機質是一種穩定、長效的營養源，在礦質化過程中會釋放大量營養為作物所用。以水稻秸稈為有機物料對土壤進行RSD處理，15 d后土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量以及pH都顯著增加，且隨著秸稈量的增加有機質含量和pH隨之增加，作物秸稈含有碳、氮、磷、鉀和其他多種營養物質，分解后可直接增加土壤養分含量特別是有機質含量[36]。

土壤酶活性是評價土壤肥力與質量的重要指標之一，其在土壤新陳代謝、物質循環和能量轉化過程中發揮著重要作用，與土壤理化性質密切相關。以菜粕為有機物料對土壤進行RSD處理時發現，RSD處理顯著提高了土壤過氧化氫酶和脲酶活性，2 種酶活性分別提高64% 和87%[11]。此外，RSD處理也能顯著提高β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、過氧化物酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、土壤多酚氧化酶和纖維素酶的活性，其中碳相關水解酶活性的提高對增加土壤有機碳量至關重要[7， 3839]。

③RSD對土壤致病菌的影響。RSD能有效重組土壤微生物群落，而土壤微生物群落組成的變化是其抑制病原的重要機制[4041]。RSD處理能有效殺滅土壤中的尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和立枯絲核菌等病原真菌，顯著降低鐮刀菌屬在真菌類群中的比例，其殺菌率高達98.8%，且RSD處理后土壤pH的升高對抑制病原菌也起到一定作用[14]。即使在低溫條件下，RSD處理在改善土壤微生物群落結構、減少土壤病原菌數量、降低發病率方面效果依然顯著[41]。RSD處理創造的強還原條件能產生H2S以及有機酸，這些產物也能抑制病原菌，可快速減少土壤中真菌和尖孢鐮刀菌的數量[4243]。還有研究認為，RSD能降低龍牙百合再植土壤田間雜草的密度與頻度，進而使田間雜草的數量與生物量顯著降低[37]。

RSD處理對土壤肥力與土壤環境的改善毋庸置疑，但是土壤在RSD處理過程中，包括重金屬元素、氮及硫在內的其他元素在土壤中的轉化及其對環境造成的潛在風險也是不容忽視的問題[4748]。

2.2 生物措施

生物防治也是解決連作障礙的有效措施之一，其主要優勢是資源豐富、操作便捷、經濟環保。

2.2.1 叢枝菌根 叢枝菌根（AM）真菌廣泛分布于各類生態系統中，為專性活體營養共生真菌，能侵染90%的陸生維管植物根系，形成具有雙膜結構的菌根共生體。菌根共生體可以通過叢枝結構與植物進行雙向營養交換，既能改善植物的營養狀況，也能換取宿主植物的光合產物用于自身的代謝，叢枝雙膜結構的形成，標志著真菌與植物互利共生關系的真正建立。共生關系建成后，互惠型AM真菌能夠有效改善土壤微環境與寄主的水分狀況；通過“菌根方式”促進各種礦質營養元素的吸收，提高作物產量與品質[49-51]。適宜的共生體組合對連作障礙緩解、作物抗病能力提高、抗寒抗旱及耐鹽性改善均具有積極作用[50， 52-56]。此外，全球植物群落每年分配給AM真菌的CO2約3.93億t，相當于目前化石燃料CO2 年排放量的36%，從這個角度來看，菌根在全球碳固定及氣候變化中也發揮著重要作用[57]。與此同時，菌根共生體還可通過根際AM真菌多樣性的增加及根系侵染率的降低來應對CO2含量與溫度的增加[58]。

2.2.2 叢枝菌根真菌對植物生長與養分吸收的影響 AM真菌能否在植物根系成功定殖是互惠型共生體系中AM真菌發揮作用的基礎，其中，侵染率是反映植物根系與真菌共生程度的重要指標，其大小在一定程度上決定了菌根效應[50]。微區試驗結果表明，接種AM真菌顯著提高了花生的菌根侵染率、植株生物量以及養分含量，接種AM真菌后，花生地上部與根系干重增幅分別為7.9%與18.4%，同時，根長、表面積、根體積則分別提高11.9%、4.9%、29.2%，花生地上部、根系、果殼和籽粒中氮、磷、鉀、鈣、鎂吸收量也顯著增加[59]。以基因突變型與野生型番茄為試驗材料的田間試驗表明，AM真菌對番茄生物量與養分吸收的促進作用與施用磷肥的效果相當，但AM真菌對土壤供磷、土壤水分及細菌群落組成均無顯著影響[60]。玉米育苗時接種Rhizophagus irregularis Schenckamp; Smith BGC AH01，2周后移至田間，結果表明，AM真菌可顯著提高拔節期玉米菌根侵染率，并使籽粒磷、鋅、錳及鎂營養水平明顯改善，產量和百粒重顯著增加，菌根效應與施磷相當[61]。除此之外，AM真菌對寄主植物硫營養的改善作用也得到了證實[62]。AM真菌對宿主植物的促生作用與龐大的菌絲網絡密不可分，AM真菌通過菌絲網絡擴大植物根系與土壤的接觸面積，從而幫助宿主植物汲取更多的水分和養分。

2.2.3 叢枝菌根真菌對根際微生物組成的影響 菌根共生關系的建立不僅會使植物發生一系列生理變化，而且會直接或間接地改變土壤環境，進而影響土壤養分狀況和土壤微生物區系。對花生接種摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）后發現，花生根際土壤蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶和硝酸還原酶活性顯著提高；同時，連作土壤的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量顯著增加；此外，根際土鐮刀菌屬、赤霉屬和曲霉菌屬的多度減少，有益細菌與放線菌屬的多度顯著增加[63]；類似的研究發現，連作土壤上的花生接種AM真菌可明顯提高土壤微生物總量、細菌/真菌，細菌/放線菌，放線菌/真菌的值，且AM真菌與根瘤菌具有協同效應[59]。同樣，通過對滇重樓幼苗接種28種AM真菌的研究發現，接種AM真菌后，根際土壤可培養微生物的數量及多樣性、生物量碳増加，根際土壤磷酸酶與蔗糖酶活性顯著增強[64]。土壤養分轉化相關酶活性的提高有利于土壤與寄主植物營養水平的改善，這也是寄主優質高產的基礎[65]。

2.3 土壤滅菌與AM 真菌配合應用

近年來，土壤滅菌措施在抑制病原菌和改善土壤肥力方面取得了較理想的效果，但土壤滅菌會影響連作土壤微生物區系的修復和重建。同時，AM真菌在促進植物生長與養分吸收、增強植物抗逆性、改善農田生態環境等方面發揮了積極作用，但是，AM真菌與植物根系間共生體的建成及共生效應的發揮都依賴于土壤環境條件。

2.3.1 土壤滅菌與根際微生物區系重建 高溫悶棚對設施內滋生殘留的病原有較好的殺滅效果，但這種殺滅是廣譜性的，在殺死病原的同時棚內害蟲的天敵以及土壤中的有益微生物也無法幸免。因而，悶棚結束后需要增施生物菌肥，重建土壤微生物生態群落環境，為作物健康生長創造條件[66]。土壤質量是影響作物產量與根際微生物組成的重要因素。在核桃上的研究發現，施用有機肥或生物肥的土壤，根際以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬微生物為主，該微生物種群對提升土壤質量是有益的[67]。同樣，在使用棉隆對草莓連作土壤進行熏蒸時，包含AM真菌在內的有益微生物會同時被殺死，添加生物菌肥后根際土壤真菌群落組成逐漸恢復，且益生菌群增加，致病菌群減少，研究認為，經棉隆消毒處理后的土壤處于一種暫時性的“真空”狀態，此時再將生物菌肥施入土壤中可以促進有益微生物在植物根際和土壤中的定殖[68]。

RSD在有機廢棄物利用、設施土壤修復、土傳病害防治以及連作障礙緩解等方面具有廣闊的應用前景。研究證實，RSD創造的強還原條件對土著AM真菌同樣具有抑制作用[69]。所以，經過RSD處理后，向土壤及時補充有益微生物有助于根際土壤微生物區系的重建，以便更好地利用RSD處理時添加的有機物料，提高土壤肥力，達到抗病增產的效果。以玉米秸稈為有機物料對土壤進行RSD處理時發現，添加AM真菌可使土壤細菌數量于淹水后第10天明顯增加，尖孢鐮刀菌數量在淹水時大幅減少，落干期間雖有回升，但添加AM真菌處理對番茄枯萎病的防效高達69.2%；同時，RSD處理時添加AM真菌還顯著提高了番茄維生素C、可溶性總糖、可溶性糖和有機酸含量[70]。

2.3.2 土壤環境與菌根效應 AM真菌作為一種生物肥，不僅環保而且對植物生長發育有益，對連作障礙緩解也表現出良好的效果。AM共生體的形成有助于增加土壤生物多樣性，這在很大程度上取決于土壤中AM真菌與根系的共生狀況。在未滅菌土壤上接種AM真菌，共生體發育不完善，AM真菌雖可刺激植物生長，但在這種土壤上生物多樣性并未得到明顯改善，而在滅菌土壤上接種AM真菌更有利于共生體的建成，AM真菌對植物生長的促進作用更明顯，土壤滅菌后，微生物群落分解代謝均勻度和豐富度與AM繁殖體的數量呈正相關，而在未滅菌土壤上則呈負相關，這表明在滅菌土壤上接種AM真菌，不僅可以刺激植物生長，還可以改善土壤分解代謝的均勻性，從而提高微生物群落對壓力和干擾的抵抗[71]。在小麥上的研究證實，在土壤滅菌條件下AM真菌可顯著提高寄主對營養的吸收，尤其是在土壤緊實狀態下，AM真菌的這一作用尤為重要[72]。土壤環境對菌根效應的影響在辣椒上的研究也得到證實，土壤日曬處理的辣椒早期產量、總產量、果實總數以及果實的長度和直徑均優于非日曬處理，且土壤日曬處理可顯著提高菌根侵染率，使辣椒第1季和第2季的菌根侵染率分別高達73% 和81%[73]。由此可見，在滅菌土壤上接種AM真菌不僅為其作用的有效發揮創造了良好的環境條件，同時AM真菌與其他有益微生物間的兼容與協作也是獲得良好菌根效應的基礎。

3 展望

在設施農業快速發展的同時，連作問題日益明顯，土壤滅菌為作物根系生長創造了良好的環境，AM真菌作為一種經濟有效的生物肥料，施入土壤后不僅增加了土壤中有益微生物的種類與數量，而且有助于滅菌后土壤微生物區系的修復與重建；同時，土壤滅菌也為菌根共生體的形成創造了更有利的條件，因此在設施農業生產中，將土壤滅菌與AM真菌配合，對緩解連作障礙極具應用潛力。

作為一種具有廣闊應用前景的連作障礙緩解措施，土壤滅菌與AM真菌配合技術在以下幾方面還有待深入研究：①AM真菌的應用目前仍以室內研究為主，實際生產中還需進一步驗證及推廣普及；②將AM真菌與土壤滅菌技術聯合應用時，應綜合考慮AM真菌、寄主及土壤因素，使菌根效應最大化；③土壤滅菌后，根際微生物與AM真菌間的互作研究；④土壤滅菌與AM真菌結合應用對根際環境及寄主代謝的影響，包括根際微生物群落組成、根際分泌物、根際養分和作物次生代謝物的變化。