關鍵詞：藍莓；柱頭；授粉強度；轉錄組測序；差異表達基因

藍莓（Vaccinium corymbosum L.）是杜鵑花科越橘屬植物，富含花青素、果膠、超氧化物歧化酶等物質，有極高保健功能[12]。由于其獨特的風味和營養價值，藍莓鮮果及加工制品在世界各地廣受青睞，是一種極具發展潛力的功能性食品[3]。隨著人們對藍莓需求的增加，其種植面積越來越大，如何提高藍莓產量和品質已成為主要研究熱點。

授粉對農作物生產至關重要。研究表明，花粉具有群體效應，即在柱頭所能承受的花粉數量范圍內，沉降在柱頭上的花粉數量越多，花粉的萌發和花粉管的伸長速度越快，對受精越有利[4-7]。Dogterom等[8]研究顯示，沉積在柱頭上的花粉粒數與藍莓的種子數量呈正相關，當用于授粉的花粉四分體數量達到125粒時，果實達到最大的坐果和最短的成熟時間，而更多的花粉數量有助于藍莓種子萌發，受精胚珠或發育中種子分泌的生長素會刺激果實的膨大。花粉與柱頭細胞間的信號識別、傳遞是決定植物能否進行受精作用的前提條件，依賴于許多基因的協同激活，以確保果實的發育，但前人對藍莓不同授粉強度的研究大多集中于授粉后期的種子數量、果實質量等方面，而關于藍莓花粉在柱頭沉降后基因水平上發生的變化并不十分清楚。

轉錄組測序技術（RNA-seq）是基于二代高通量測序技術的轉錄組學研究方法，通過RNA-seq可以準確測定特定基因的表達水平，以解決生物學上的相關問題[9]。RNA-seq常用于分析差異基因表達（differential gene expression，DGE），被認為是一種常規的研究工具。Feng等[10]基于RNA-Seq獲得了楊梅的海量序列數據，對成熟過程中與果實質量相關的基因及其在不同組織的表達譜進行了分析，共發現3 600個差異基因的表達模式，為進一步研究該果樹的功能基因組提供了平臺，同時也為研究非模式多年生植物的復雜代謝提供了參考依據。Deng等[11]利用Illumina HiSeqTM平臺對野生蕉果皮紫色和綠色部分的表皮細胞進行RNA-seq，篩選和鑒定出75個與花青素苷合成的相關基因，為后續功能基因驗證奠定了基礎。近年來，對藍莓轉錄組測序的研究日益廣泛。Liu等[12]對藍莓果實的不同發育階段進行了RNAseq，獲得了約40.54 GB 的clean reads 和109 480個unigenes，并對藍莓中與碳水化合物代謝和類黃酮生物合成有關的基因進行了分析，為這些基因的功能研究和相關質量性狀的調控機理提供了依據。

授粉過程是植物進行有性生殖的最初環節，也是最關鍵的環節，它由許多基因協同激活來保證坐果和果實發育，因此尋找在授粉過程中起關鍵作用的基因對提高植物授粉效率、探明授粉增產機理、獲得高產優質果實等具有十分重要的現實意義。Boavida等[13]通過比較擬南芥授粉0.5、3.5、8.0 h后雌蕊的表達譜發現，在花粉與雌蕊相互作用的過程中有1 373 個基因表達存在差異，基因富集表明與代謝產物和激素等保證正常生理和代謝環境密切相關。徐曉輝[14]分析了授粉20 和 180 min 的玉米柱頭表達譜發現，差異基因主要參與細胞骨架重建、DNA復制、轉運、蛋白質降解等過程。但關于藍莓柱頭在不同授粉強度處理下的轉錄組分析尚未見報道。

因此，本研究以‘藍源（M7）’藍莓為研究對象，利用Illumina測序技術對經過不同授粉強度處理的藍莓柱頭進行轉錄組測序，構建轉錄組數據庫，將得到的unigenes與公共數據庫進行比對，再進行GO（gene ontology）功能注釋、分類及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，為探索藍莓柱頭對不同授粉強度的響應機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2022年1月至2023年3月在北京市密云區密西路北京軍興廣達農產品產銷專業合作社的溫室（40°23′43″N，116°47′30″E）進行。溫室類型為標準型塑膜日光溫室，坐北朝南，溫室北、東、西面為磚墻結構，朝陽面由拱形圓形鋼架及2層透明塑料薄膜組成，冬季在塑料薄膜外安裝保溫被。

1.2 試驗材料

本研究使用的品種是‘藍源（M7）’藍莓，樹齡10年，其母本為南方高叢品種Misty，父本未知。該品種的酸比和糖酸比較高，可滴定酸含量低，綜合品質優良，是適合中北部地區和大棚栽培的藍莓品種。溫室內種植行距為1.80 m，間距為1.00 m。

1.3 藍莓柱頭可授性測定

采用聯苯胺-過氧化氫溶液法[15]測定柱頭可授性。選取長勢一致的藍莓植株，在藍莓開花前（0 d）套袋140朵，從開花0 d到開花6 d每隔24 h收集藍莓花20朵，用鑷子取下柱頭，在聯苯胺-過氧化氫溶液中浸入藍莓柱頭，觀察并記錄氣泡生成情況，通過氣泡涌出前時間、氣泡涌出速率和氣泡大小，評估藍莓柱頭的可授性。將柱頭的授粉能力評級如下：“ –”表示無授粉能力；“+/–”表示授粉能力弱；“+”表示授粉能力一般；“++”表示著授粉能力較佳；“+++”表示授粉能力最佳。

1.4 人工授粉花粉懸液制備

試驗開始前人工收集熊蜂采集的藍莓花粉團，高溫干燥箱70 ℃、12 h進行滅活處理，采用體外萌發培養方式并顯微鏡檢測確認其全部失活后備用。試驗當日收集熊蜂采集的花粉團，將花粉團置于4～0 ℃條件下備用，并于短時間內使用完畢，以保持其活力。取試驗當日采集的花粉團3粒，加入10%的蔗糖溶液配置成0.4 mL的花粉母液，稀釋為1×106 cell·mL-1 的具活花粉懸液。取滅活花粉團3粒，加入10%的蔗糖溶液配置成0.4 mL的花粉母液，同樣稀釋為1×106 cell·mL-1的滅活花粉懸液。

將上述具活花粉母液和滅活花粉母液分別按照0∶1（F0）、1∶1（F50）和1∶0（F100）的比例配置成花粉懸液用于人工授粉。用直徑1 mm的描線毛筆蘸取花粉懸液授粉，經測定，每次授粉平均在柱頭上沉降花粉粒為133.6粒。

1.5 人工授粉

選取開花0 d的藍莓花進行標記，并用白色尼龍網袋（8目）套花以避免傳粉者授粉。在開花第2天，取下尼龍網袋，用直徑1 mm的描線毛筆分別蘸取上述F0、F50、F100處理的花粉懸液，點涂于藍莓柱頭上，每個處理5次重復，以6朵花為1次重復，共授粉90朵花，用于柱頭轉錄組測序。

在20～25 ℃的設施環境條件下，授粉4.0 h后花粉管在柱頭中大量萌發[1617]。因此在授粉后4.5 h使用鑷子取下授粉柱頭，樣品采集后立即放入液氮中，后置于-80 ℃保存備用。

1.6 花粉懸液活力測定

取上述用于人工授粉的F0、F50、F100處理花粉懸液，通過2種方式測定其花粉活力。

① 氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenytetrazoliumchloride，TTC）染色法。取適量花粉于1.5mL 離心管中，加入200 μL 0.5% TTC 染液，37 ℃避光孵育20 min，隨后在顯微鏡下觀察染色程度。被染成紅色的花粉具有較強活性；淡紅色次之；未染色花粉則無活性。

②體外培養法（培養基萌發法）。配制蔗糖含量10%、硼酸0.01%、瓊脂1%的培養基，取適量花粉用10%的蔗糖溶液混勻，將花粉懸液注入凝固的培養基中，26 ℃培養5 h后，觀察花粉管萌發情況。如果花粉管長度大于花粉直徑，則視作花粉粒萌發[18-20]。

1.7 不同授粉強度下柱頭轉錄差異

1.7.1 RNA提取 采用TRIzol法（Invitrogen，CA，USA）提取柱頭RNA，提取過程中，用RNase-freeDNase I （Takara，Kusatsu，Japan）處理。在1% 瓊脂糖凝膠上監測RNA 降解和污染情況。采用Agilent 2100 生物分析儀（Agilentl Technologies，CA，USA）定量RNA，對RNA片段長度進行檢測。采用NanoDrop分光光度計（Thermo Scientific，DE，USA）檢測RNA純度，評估質量和完整性。

1.7.2 轉錄組測序及數據分析 RNA 提取完成后，樣品由北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000平臺進行轉錄組測序。測序獲得的原始數據（raw reads）含有少量低質量數據，為了保證數據分析的質量及可靠性，過濾帶有測序接頭（adapter）的reads、N（不確定堿基）含量比例大于10%的reads以及低質量堿基（Q≤20）含量大于50%的reads，獲得clean reads。分別使用Star 和Cufflinks 軟件完成比對和轉錄本拼接，然后利用FPKM（fragments per kilobase of exon modelper million mapped reads）量化基因的表達水平。使用DESeq R軟件包（1.10.1）進行差異表達分析，使用Benjamini和Hochberg控制錯誤發現率，調整P 值，將Padjlt; 0.05 的基因定義為差異表達基因。使用基于Wallenius non-central非中心超幾何分布的GOseq R軟件進行差異表達基因的GO富集分析，利用KOBAS軟件進行差異表達基因在KEGG通路上的富集分析。

2 結果與分析

2.1 柱頭可授性分析

由表1 可知，隨著花齡的不斷延長，‘藍源M7’柱頭可授性表現為先升高后逐漸降低的趨勢。‘藍源M7’在開花前就具備可授性，開花1～2 d可授性較強，持續至4 d左右。由此表明，‘藍源（M7）’柱頭可授性在開花2 d時最強，據此，選擇開花第2天的藍莓花進行試驗。

2.2 花粉懸液活力分析

人工授粉的花粉懸液經TTC染色與體外培養后的結果如圖1所示。F0處理未被染色，不具備活力；F50處理約有47.1%的花粉被染色，花粉活力較高；F100處理約有92.3% 的花粉被染色，花粉活力最高。

將3個處理組的花粉懸液在26 ℃培養5 h后發現，F0處理的花粉管均不萌發；F50處理的花粉管萌發率約為41.6%；F100處理的花粉管萌發率約為96.8%。上述結果與TTC染色法所得結果基本一致，表明試驗可行。

2.3 轉錄組學分析

基于Illumina Novaseq 6000 測序平臺對3 個處理進行轉錄組測序，共測得264 425 618條原始序列，經過質控，得到256 715 064 條質控序列。對DEGs進行鑒定，共鑒定出4 325個DEGs，樣本的Q30 范圍為93.70%～94.59%。由此表明，測序結果可以覆蓋大部分表達基因，文庫構建質量較高，可進行數據分析。

2.3.1 mRNA的差異表達分析 以Padjlt;0.05為閾值選擇DEGs，F100 和F50 處理間檢測到793 個DEGs，其中上調754個，下調39個；F50和F0處理間檢測到458個DEGs，其中上調411個，下調47個；F100和F0處理間檢測到4 237個DEGs，其中上調3 843個，下調394個。有143個基因在3個處理中均表達（圖2）。

2.3.2 GO功能注釋和富集分析 F50與F0處理相比，共202個DEGs得到注釋， 其功能包括生物過程、細胞組分和分子功能3大類。從排名前30位的統計結果（圖3）來看，在生物過程類中，與碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolicprocess）相關的最多（23），其次碳水化合物分解代謝過程（carbohydrate catabolic process）（7），占比分別為11.4% 和3.5%；在分子功能類中，與催化活性（catalytic activity）相關的最多（124），作用于糖基鍵（hydrolase activity，acting on glycosyl bonds）的水解酶活性次之（16），占比分別為61.4%和7.9%。

F100 與F0 處理相比，有1 850 個DEGs 被注釋到，其功能包括3大類：生物過程、細胞組分和分子功能。從排名前30的統計結果（圖4）看，在生物過程類中，28 個與細胞壁結構（cell wallorganization）有關，28 個與外部封裝結構組織（external encapsulating structure organization）有關，占比均為1.5%；在分子功能類中，84個與作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity，actingon glycosyl bonds）有關，76個與水解酶活性、水解O 糖基化合物（hydrolase activity，hydrolyzing Oglycosylcompounds）有關，76 個與酶調節劑活性（enzyme regulator activity）有關，占比分別為4.5%、4.1%和4.1%。

F100 與F50 處理相比，共注釋到316 個DEGs，其功能包括生物過程、細胞組分和分子功能3大類。從排名前30的統計結果（圖5）看，在生物過程類中，13個與細胞碳水化合物代謝過程（cellular carbohydrate metabolic process）有關，12個與有機羥基化合物代謝過程（organic hydroxycompound metabolic process）有關，12個與碳水化合物分解代謝過程（carbohydrate catabolicprocess）有關，占比分別為4.1%、3.8%和3.8%；在分子功能類中，有8個與肌醇加氧酶活性（inositoloxygenase activity）有關，有3個與乙酰乳酸脫羧酶活性（acetolactate decarboxylase activity）有關，有3個與甲狀腺素5-脫碘酶活性（thyroxine 5-deiodinaseactivity）有關，占比分別為2.5%、0.9%和0.9%。

2.3.3 KEGG代謝通路和富集分析 對兩兩處理間的DEGs進行KEGG通路富集分析，其中F50和F0處理間的DEGs富集到60條KEGG通路，如表2所示。Padjlt;0.05的通路有1條，為戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化（pentose and glucuronate interconversions），其P值最小，表明富集程度較高。

F100 和F0 處理間的DEGs 富集到115 條KEGG通路，進一步對Padjlt;0.05的結果（表3）統計表明，涉及代謝途徑（metabolic pathways）最多，為454個，其中404個基因上調表達；其次是戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化（61個）和植物?病原體互作（plant-pathogen interaction）（55 個），其中52 個基因上調表達。富集通路中，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化的Padj值最小，表明富集程度較高。

F100 和F50 處理間的DEGs 富集到55 條KEGG通路，進一步對Padjlt;0.05的結果統計（表4）表明，涉及代謝途徑（metabolic pathways）的DEGs最多，為68個，其中67個基因上調表達；其次是植物病原體互作，為15個，其中13個基因上調表達。在富集通路中，肌醇膦酸代謝通路（inositolphosphate metabolism）的Padj 值最小，表明富集程度較高。

綜上所述，肌醇膦酸代謝、植物?病原體互作、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化等通路在3個處理均有差異基因富集，且隨著授粉強度的增加DEGs中多數為上調表達。其中，參與花粉管生長調節的鈣依賴蛋白激酶17（Cpk17）、涉及肌醇含量的肌醇加氧酶（MIOX1）、參與果膠分解代謝過程的果膠甲基酯酶抑制劑（AT5G49180）等的基因表達量均隨著授粉強度的增加顯著提高。由此推測，授粉強度的增加會影響植物體內的內肌醇含量，進而對花粉管生長起調控作用。

2.3.4 差異基因在不同授粉強度下的轉錄表達水平 從差異基因富集程度較高的肌醇膦酸代謝通路、植物?病原體互作、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化等通路中選取5個基因，比較在不同組間的表達水平，結果（圖6）表明，表達量隨授粉強度的增加而升高。

3 討論

本研究通過不同授粉強度處理下藍莓柱頭的轉錄組學分析發現，柱頭對授粉強度增加的響應基因顯著富集于肌醇膦酸代謝通路、植物?病原體互作等通路，除此之外，色氨酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化等通路的富集程度也較高，且在不同處理中表現出顯著差異。

研究表明，花粉和柱頭的識別機制類似于植物體區分損傷和外來病原體入侵的機制[21]，且有研究者推測植物自交不親和是由病原防御進化而來[17]。藍莓存在自交不親和現象，因此柱頭和花粉間的識別至關重要。KEGG 富集分析結果表明，隨著授粉強度的增加，環境適應分類中的植物-病原體互作通路上富集的DEGs 較多，其中LOC103636213、PC1 等涉及Ca2+結合的基因隨授粉強度的增加顯著上調，這與前人的研究結果相似[2224]。研究表明，植物?病原互作通路在龍葵、番茄、梨等作物的柱頭識別花粉的過程中發揮重要作用[22， 25-27]，由此推測授粉強度的增加可直接或者間接影響柱頭對花粉的識別過程。

花粉與柱頭的相互作用是植物完成授粉與受精過程的首要步驟，當花粉到達雌蕊的柱頭時，首先進行花粉與柱頭的識別，隨后花粉管導向生長，進而完成授粉受精過程。能夠完成受精作用的關鍵要素之一是信號能否被有效轉導[28]。Ca2+作為植物進行各項生物過程中的關鍵信號分子，能夠與調控花粉管生長的其他信號系統共同參與花粉管定向生長，啟動花粉正常萌發和花粉管生長[29-31]。花粉管頂端Ca2+梯度的形成和保持一般認為來自于兩方面：一是胞外Ca2+內流；二是胞內Ca2+庫的調控。胞內Ca2+庫中的Ca2+主要由三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）信號系統調節釋放，IP3作為重要的二級信使被釋放到細胞質中，誘導內源Ca2+的釋放，進而調節Ca2+水平，對花粉管的導向生長起著重要作用[32-34]。本研究基于KEGG富集分析發現，隨著授粉強度的增加，肌醇膦酸代謝通路的富集程度較高，其中F100和F50處理間的DEGs有14個富集到該通路；F100和F0處理間有29個富集到該通路；F50和F0處理間有5 個富集到該通路。其中肌醇加氧酶基因（MIOX1）在不同處理間的表達量存在顯著差異，且隨著授粉強度的增加表達量顯著提高。磷酸肌醇是生物體內一類重要的信使分子，花粉管生長過程中受到多種磷酸肌醇信號的調控，這些信號與Ca2+等信號分子共同作用，通過改變花粉內的囊泡運輸、調控微絲骨架排布及胞質環流，進而影響花粉管生長[35-37]。隨著授粉強度的增加，MIOX1基因在藍莓柱頭中上調表達，肌醇含量受肌醇加氧酶調控[38]，而肌醇是IP3 的前體物質。因此，MIOX1 基因上調表達可能是受精信號轉導的先決條件。

在細胞壁的生物合成中，肌醇加氧酶具有重要作用[39]。植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠及少量結構蛋白等組成的網狀結構，與植物生長發育密切相關[40]。植物細胞形態是由細胞壁的形成空間來定義的，花粉管的生長限定在頂端部位，在花粉管生長過程中，頂端細胞壁不斷更新，花粉管細胞壁的更新對花粉管生長十分重要。高爾基體分泌含細胞壁前體物質的囊泡，通過將細胞壁組分以及相關信號分子內化，形成新的細胞壁，進而協調花粉管生長[4142]。MIOX1 是肌醇分解代謝途徑的關鍵酶，肌醇通過MIOX1 氧合裂解轉化為游離的D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，D-GlcA），隨后生成不同的代謝物參與植物細胞壁合成[39]。由此推測，MIOX1 參與細胞壁多糖生物合成，其上調表達有助于花粉管快速生長，從而完成受精作用。同時，KEGG分析結果發現，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化途徑顯著富集，且主要集中于果膠的降解。花粉粒外層具有特殊的細胞壁組織（花粉壁），主要成分為纖維素、果膠和結構蛋白，研究發現，參與果膠降解的基因如VDG1 和PPM1 對花粉管生長至關重要[43]。進一步對富集到的DEGs分析發現，果膠裂解酶家族蛋白基因的表達顯著上調，有助于花粉發育[4445]，其上調表達可能與細胞壁形成的生物學功能是一致的。

隨著授粉強度的增大，柱頭內包括TAR2、TAA1、CYP79B2 在內的基因顯著上調，它們與生長素合成密切相關。TAA1 參與生長素前體吲哚-3- 丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPA）的生成[46]；TAR2 和CYP79B2 基因參與色氨酸代謝，在生長素的生物合成中發揮作用[4748]。本研究結果表明，TAR2、TAA1、CYP79B2 顯著富集到色氨酸代謝通路。色氨酸是植物合成生長素的前體物質，雖然植物體內內源激素含量很少，但其作用廣泛，生長素作為一種重要的植物激素，能調節花粉萌發和花粉管伸長[4950]。因此推測，授粉強度的增大可能會影響植物生長素的生物合成，進而影響受精過程。

綜上，授粉強度的增加可能對柱頭和花粉的識別過程產生影響，通過參與柱頭和花粉間的信號轉導、激素合成等過程對花粉管生長起促進作用，這將是今后研究的重點。