產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC45958 菌株防控番茄棒孢葉斑病研究

摘要：為明確產(chǎn)褐黃色鏈霉菌HEBRC45958菌株對(duì)番茄棒孢葉斑病的防控效果，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)合光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察確定HEBRC45958離體抑菌活性，并測(cè)定其產(chǎn)鐵載體能力和水解酶活性。同時(shí)采用盆栽試驗(yàn)確定HEBRC45958發(fā)酵液對(duì)番茄棒孢葉斑病防控效果。結(jié)果表明，對(duì)峙培養(yǎng)條件下 HEBRC45958對(duì)多主棒孢的抑菌率為52.65%。掃描電鏡下觀察，與對(duì)照相比，HEBRC45958處理后多主棒孢菌絲發(fā)生扭曲和破裂，透射電鏡下觀察，多主棒孢細(xì)胞膜和細(xì)胞壁距離增加。HEBRC45958菌株能產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，HEBRC45958發(fā)酵液對(duì)番茄棒孢葉斑病的防效為100%，具有較好的生防應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)褐黃色鏈霉菌；番茄；多主棒孢；防效

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0416

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）11013607

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的番茄棒孢葉斑病是番茄的一種重要病害，其寄主廣泛，可侵染380個(gè)屬內(nèi)的500多種植物，包括黃瓜、辣椒、橡膠和一品紅等經(jīng)濟(jì)作物[1]。該病害最早在美國(guó)佛羅里達(dá)地區(qū)爆發(fā)，隨后在日本和韓國(guó)等地也相繼發(fā)生。由于其寄主廣泛、侵染力強(qiáng)、傳播途徑多樣，加之近些年我國(guó)設(shè)施蔬菜面積不斷擴(kuò)大，高溫高濕等環(huán)境為番茄棒孢葉斑病的發(fā)生提供了條件，在我國(guó)山東、海南和北京等地區(qū)大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了番茄生產(chǎn)[23]。目前棒孢葉斑病的防控主要依靠化學(xué)殺菌劑，然而，隨著殺菌劑的大量使用，多主棒孢出現(xiàn)了嚴(yán)重的抗藥性，如對(duì)多菌靈、啶酰菌胺和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性[4-8]；另外，化學(xué)殺菌劑的大量使用會(huì)造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，亟需更為安全有效的防控手段。

由于生物防控更安全，在作物病害防控中得到了廣泛應(yīng)用。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）ZF2 菌株和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZF57菌株對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有良好的防控效果[910]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NBF809菌株和死亡谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）NBIF001菌株對(duì)番茄棒孢葉斑病具有良好的防控效果[1112]。前人關(guān)于棒孢葉斑病的生物防控研究主要集中于芽孢桿菌，而對(duì)鏈霉菌（Streptomycete）防控棒孢葉斑病的報(bào)道較少。鏈霉菌作為重要的生防微生物，可以產(chǎn)生多種抗生素、植物激素、水解酶等抑菌活性物質(zhì)，對(duì)防控病害和提高植物抗病性具有重要作用，是創(chuàng)制新型生物農(nóng)藥的重要資源。本研究從番茄根際土壤中分離出一株對(duì)多種植物病原真菌具有良好抑菌效果的產(chǎn)褐黃色鏈霉菌（Streptomycesphaeoluteichromatogenes）HEBRC45958，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO：M2015768，進(jìn)一步分析其對(duì)番茄棒孢葉斑病的防控效果和抑菌機(jī)理，以期為生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為多主棒孢（Corynespora cassiicola）和產(chǎn)褐黃色鏈霉菌（S. phaeoluteichromatogenes）HEBRC45958，均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保藏。供試藥劑為50%啶酰菌胺水分散粒劑，由巴斯夫歐洲公司生產(chǎn)。供試番茄品種為‘中雜109’，由中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HEBRC45958菌株抑菌譜測(cè)定 HEBRC45958菌株從高氏1號(hào)斜面活化至高氏1號(hào)平板，瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum） 、辣椒疫霉（Phytophthora capsici） 、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、多主棒孢（C. cassiicola）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）共7 種植物病原菌由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離保藏，從馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）斜面活化至PDA 平板備用。用直徑4 mm 打孔器打取HEBRC45958 菌餅，置于PDA 平板上、下、左、右4 個(gè)點(diǎn)，距離中心約30 mm，48 h后打取病原菌菌餅置于平板中央，以不加HEBRC45958 菌株作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率，公式如下。

1.2.2 HEBRC45958菌株對(duì)多主棒孢菌絲作用觀察 從對(duì)峙培養(yǎng)的平板抑菌帶邊緣和對(duì)照菌落邊緣挑取多主棒孢菌絲，掃描電鏡和透射電鏡菌絲處理參考Li等[13]的方法，觀察菌絲形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.3 產(chǎn)嗜鐵素和水解酶活性測(cè)定 產(chǎn)嗜鐵素活性測(cè)定：使用打孔器打取HEBRC45958菌餅接種于CAS培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察是否產(chǎn)生黃色暈圈[14]。產(chǎn)水解酶活性測(cè)定：將HEBRC45958菌株分別接種于幾丁質(zhì)、酪蛋白、羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose，CMC）、淀粉和茯苓粉培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察是否產(chǎn)透明圈[1516]。其中，酪蛋白平板需在培養(yǎng)后加入10%三氯乙酸；CMC平板需加入1 g·L-1剛果紅染1 h后，倒掉染液，再用1 mol·L-1 NaCl溶液浸泡1 h；淀粉平板需加入2.5% 盧氏碘液，浸泡15 min后倒掉，用無(wú)菌水沖洗。

1.2.4 HEBRC45958菌株對(duì)番茄棒孢葉斑病的防效測(cè)定 將番茄種子催芽后播種于32孔穴盤中，溫室常規(guī)管理30 d。按照Miyamoto等[17]方法制備多主棒孢病原菌孢子。將斜面病原菌活化至PDA平板，在25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d，用無(wú)菌手術(shù)刀片刮去表面氣生菌絲，隨后在BLB（black lightblue）燈下繼續(xù)培養(yǎng)3 d使其產(chǎn)孢。刷取孢子并用無(wú)菌水調(diào)至104 CFU·mL-1備用。

將HEBRC45958菌株孢子從斜面培養(yǎng)基劃線至高氏1號(hào)平板培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后用4 mm打孔器打取菌餅至ISP2液體培養(yǎng)基，500 mL三角瓶裝入100 mL ISP2 液體，搖床180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d作為種子液，隨后按5%體積接入ISP2 液體培養(yǎng)基，500 mL 三角瓶裝入100 mLISP2液體，搖床180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d備用。將發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液均勻噴施番茄葉面至飽和，以有效成分333.3 μg·mL-1啶酰菌胺作為對(duì)照藥劑，無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)16棵番茄。24 h后噴霧接種病原菌孢子懸浮液，28 ℃保濕培養(yǎng)4 d后統(tǒng)計(jì)各處理病情指數(shù)并計(jì)算防效。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照Ishii等[18]方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEBRC45958 菌株對(duì)植物病原菌離體抑菌效果

在供試的幾種病原菌中，HEBRC45958菌株對(duì)灰葡萄孢、多主棒孢和核盤菌的抑菌活性較好，抑菌率分別達(dá)到59.63%、52.65%和53.33%；對(duì)辣椒疫霉及尖孢鐮刀菌無(wú)抑菌活性（表1）。HEBRC45958菌株對(duì)峙的多主棒孢菌落邊緣氣生菌絲稀疏（圖1）。

2.2 HEBRC45958 菌株對(duì)多主棒孢菌絲作用分析

在掃描電鏡下觀察，與對(duì)照相比，經(jīng)HEBRC45958處理后多主棒孢菌絲出現(xiàn)扭曲和破裂（圖2）。透射電鏡下觀察，與對(duì)照相比，經(jīng)HEBRC45958 處理后多主棒孢菌細(xì)胞壁外層加厚，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間距變大（圖3）。

2.3 HEBRC45958 菌株的嗜鐵素和水解酶活性分析

對(duì)HEBRC45958菌株分泌的嗜鐵素和5種細(xì)胞水解酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖4）表明，HEBRC45958菌株能夠在淀粉、幾丁質(zhì)、茯苓粉和CMC平板上產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明該菌株能產(chǎn)生淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、和纖維素酶；且能夠在CAS平板產(chǎn)生黃色暈圈，說(shuō)明菌株能夠產(chǎn)生嗜鐵素。

2.4 HEBRC45958 菌株發(fā)酵液防控番茄棒孢葉斑病

盆栽試驗(yàn)（表2和圖2）表明，HEBRC45958菌株發(fā)酵液對(duì)番茄棒孢葉斑病具有良好的防控效果，經(jīng)HEBRC45958菌株發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液處理后，番茄病情指數(shù)顯著降低，由對(duì)照的96.88分別降為0.00、6.90和11.11。HEBRC45958菌株發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液的防效分別為100.00%、92.88% 和88.53%，均高于對(duì)照藥劑啶酰菌胺。

3 討論

關(guān)于棒孢葉斑病的生物防控研究多集中于芽孢桿菌，而鏈霉菌的報(bào)道較少。金麗穎[19]報(bào)道了Streptomyces inhibens NEAU-D10 發(fā)酵液對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有良好的防控效果，本研究首次報(bào)道了S. phaeoluteichromatogenes HEBRC45958防控棒孢葉斑病。

經(jīng)HEBRC45958處理后，在掃描電鏡下觀察，多主棒孢的菌絲出現(xiàn)扭曲和破裂；透射電鏡下觀察，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間距離變大。由此推斷破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可能是HEBRC45958 的一種抑菌機(jī)理。這與Xiong 等[20] 報(bào)道Streptomyces padanusJAU4234 的代謝產(chǎn)物多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素Antifungalmycin 702對(duì)立枯絲核菌菌絲作用的結(jié)果相似。

HEBRC45958能產(chǎn)生嗜鐵素、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶等抑菌物質(zhì)。其中淀粉酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶作為細(xì)胞壁水解酶，能夠水解病原菌細(xì)胞壁[2021]，該結(jié)果與掃描電鏡觀察結(jié)果一致。Fe3+是微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，嗜鐵素具有與病原菌競(jìng)爭(zhēng)Fe3+ 能力，從而達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)[2223]。因此HEBRC45958菌株代謝產(chǎn)生嗜鐵素也是防控棒孢葉斑病的一種抑菌機(jī)制。

鏈霉菌能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，除了水解酶外，還能產(chǎn)生多種類型的抗生素。Ma等[24]報(bào)道，不吸水鏈霉菌梧州亞種（Streptomyces ahygroscopicussubsp. wuzhouensis）11371菌株能產(chǎn)生的一種26環(huán)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素四霉素，其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病盆栽防效達(dá)到79.70%。HEBRC45958 菌株產(chǎn)生的抗生素種類還需要進(jìn)一步鑒定。本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)了HEBRC45958菌株對(duì)多主棒孢的防效，后續(xù)需要進(jìn)一步進(jìn)行田間防控效果的評(píng)價(jià)。

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