煙草番茄斑萎病毒RT-LAMP 檢測體系的建立及優化

摘要：為快速檢測煙草番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV），基于TSWV核外殼蛋白（nucleocapsidprotein，NP）保守序列設計5組引物進行篩選，采用單一變量法對反應溫度、時間及反應體系中dNTPs、Mg2+、甜菜堿的含量和內外引物比等參數進行優化，建立煙草TSWV反轉錄環介導等溫擴增（loop-mediated isothermalamplification，RT-LAMP）檢測體系，并采用RT-PCR（revers transcription-polymerase chain reaction）檢測方法進行平行比對試驗，驗證優化后RT-LAMP的特異性、靈敏性及實用性。結果表明，煙草TSWV RT-LAMP檢測體系最佳引物組為TS-N-4，在25 μL的反應體系中各組分最佳加入量為緩沖液2.5 μL、100 mmol·L-1 MgSO4 0.5 μL、10 mmol·L-1 dNTPs 0.5 μL、10 mmol·L-1 FIP/BIP 1.5 μL、10 mmol·L-1 F3/B3 0.5 μL、10 mmol·L-1 LF/LB 1.5 μL、5 mmol·L-1 Betaine 6 μL、Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase（8 000 U·mL-1） 0.5 μL、M-MLV 酶（10 000 U·mL-1）0.125 μL、RNA （≥64.7 fg）1 μL，DEPC H2O補至25 μL；最佳反應溫度和時間分別為58 ℃、60 min。優化后的RT-LAMP靈敏度是RT-PCR的1 000倍，且田間樣品檢測結果與RT-PCR相符。建立的RT-LAMP方法特異性強、靈敏度高、操作簡單，對于煙草TSWV的檢測及監控有重要意義。

關鍵詞：番茄斑萎病毒；NP基因；反轉錄-環介導等溫擴增；快速檢測

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0238

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）08‐0140‐11