紅豆杉健康與感葉斑病針葉的內生微生物多樣性

摘 要 為探究人工林與天然林東北紅豆杉（Taxus cuspidata）健康葉與感葉斑病的病葉之間內生真菌和細菌群落結構的差異，分別剪取人工林與天然林10棵15 a生健康和感葉斑病紅豆杉的針葉，采用Illumina Miseq高通量測序技術進行測序和生物信息學分析。結果表明：6組紅豆杉葉片中相同的真菌OTU（Operational Taxonomic Units）85個，占 OTU 總數的6.66%，相同的細菌OTU 26個，占 OTU 總數的3.72%。葦河鎮感葉斑病葉片較健康葉片的真菌OTU數增多，細菌OTU數減少；穆棱鎮天然林與人工林感葉斑病葉片較健康葉片的真菌OTU數減少，細菌OTU數增多。同時，天然林比人工林具有更多的真菌和細菌OTU數，細菌量差距較小。通過對紅豆杉針葉在門及屬水平的研究發現，同一地區天然林與人工林感病前后真菌群落結構組成及變化趨勢基本相同。

關鍵詞 高通量測序；紅豆杉；葉斑病；真菌多樣性；細菌多樣性

東北紅豆杉（Taxus cuspidata）作為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物，為中國一級重點保護樹種，是分布于東北地區的第三紀孑遺樹種，具有極高的經濟價值、觀賞價值和生態效益^[1-4]。東北紅豆杉天然種群本身生長緩慢，天然結實率低，且對生長環境要求較嚴，種群競爭力較弱，再加上人為過度開發，東北紅豆杉天然林面積逐步縮小，已瀕臨滅絕^[5-6]。

目前，國內外關于紅豆杉的研究主要在生態分布、扦插栽培以及物質分析等方面，關于病害的研究較少。譙天敏等^[7]鑒定南方紅豆杉（T.wallichiana）根腐病病原為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），范曉龍等^[8]鑒定南方紅豆杉炭疽病病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），喬雨晴等^[9]鑒定曼地亞紅豆杉（T.axus media）枝枯病病原為棒狀新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora），李陽^[10]鑒定紅豆杉葉枯病病原為小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）， Jeon等^[11]確定日本紅豆杉葉枯病病原菌為小孢擬盤多毛孢（P.microspora），近年來，隨著生物防治的逐漸完善，運用植物內生菌拮抗病原菌來防治葉斑病成為一種較為可行的方法^[12-14]。高通量測序能夠更為準確快捷地了解微生物的性質及其在自然界中的生態功能，通過高通量測序技術能夠一次性檢測出樣品中可能感染的多種病原物的基因序列，在病原檢測鑒定中應用廣泛^[15-17]。

2021年在黑龍江省穆棱市穆棱鎮人工林內發現了紅豆杉葉斑病的發生，經調查發現，該病害在染病葉片上發病，病變部位癥狀為：病變初期針葉尖端先變為黃色，病變從針葉尖端朝著針葉基部逐漸擴散，隨后整根枝條徹底枯死。紅豆杉葉斑病對紅豆杉危害較大，植物會多處發病。病害嚴重時隨著病原菌危害加劇，整株植物都會死亡，由此會給東北紅豆杉帶來嚴重的經濟損失。本研究基于高通量測序技術分析人工林與天然林感紅豆杉葉斑病前后內生微生物多樣性以及群落結構的變化，探知優勢微生物的分布，從而可用于指導篩選紅豆杉葉片內生優勢的葉斑病拮抗菌，并探究人工林與天然林以及不同地區人工林內生微生物的差異，以期對東北紅豆杉的生物防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

采樣地點位于黑龍江省穆棱市穆棱鎮東北紅豆杉人工林、天然林及尚志市葦河鎮人工林。東北紅豆杉天然林樣地位于穆棱東北紅豆杉國家級自然保護區內（43°49′～44°06′ N，130°00′～" 130°28 E），樣地面積25 hm²。樣地地形走勢西南高，海拔最高781 m，最低658 m，高差123 m；年平均溫度在-2"" ℃，年平均降水量530 mm，土壤為暗棕壤。樣地內森林群落優勢種明顯，垂直層次復雜，是典型的中齡復層異齡林，其主要建群樹種為紫糖（Tilia amurensis）、紅松（Pinus koraiensis）、臭冷杉[JP2]（Abies nephrolepis）和楓樺（Betula costata）等，樣地內共有胸徑（DBH）≥1 cm木本植物57種，隸屬于22科38屬。獨立個體為 63 877株，平均胸徑為7.83 cm，胸高斷面積 26.4 m²/hm²。樣地內現有東北紅豆杉（T.axus cuspidate）成樹169株，天然更新幼苗350 ～ 450株。

穆棱鎮東北紅豆杉人工林（43°45′ N，131°00′ E）約500 hm²，1995年營建，土壤為暗棕壤，東北紅豆杉20 a以上開始結實，40 a以上果實質量高，株行距為2.5 m×3 m，主要建群樹種為落葉松（Larix gmelinii），樣地內現有東北紅豆杉共計100多萬株。

葦河鎮人工林位于葦河鎮林業局青山林木種子園，樣地面積5 000 hm²，其主要建群樹種為紅松（Pinus koraiensis）、紅豆杉（T.axus cuspidate）、樟子松（P.sylvestris）、沙松（A.holophylla）、水曲柳（F.mandschurica）、紫椴（T.amurensis），1994年開始種植東北紅豆杉，樣地內現有東北紅豆杉2 000余株。

1.2 試驗材料

2021年6月18日至20日，分別于黑龍江省穆棱市穆棱鎮人工林、天然林及尚志市葦河鎮人工林采集健康和感葉斑病紅豆杉葉片。采用“S”形十點采樣法，分別剪取10棵15 a生健康及感葉斑病紅豆杉針葉1.0 g，進行表面消毒后得到穆棱鎮人工林、天然林及葦河鎮人工林各10.0 g健康樣品及10.0 g感病樣品。葦河鎮人工林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S1和L1表示；穆棱鎮天然林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S2和L2表示；穆棱鎮人工林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S3和L3表示。將樣品分別置于2 mL的無菌離心管中，并于-80" ℃的超低溫冰箱中保存至DNA提取。

1.3 紅豆杉內生微生物基因組 DNA 的提取及質量檢測

紅豆杉樣品的基因組DNA參照 MP 試劑盒 Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200 的使用說明書進行提取，將所提取到的 DNA 溶于50 μL無菌水中，混合均勻，置于-80 ℃保存，備用。之后使用NanoDrop 2000進行基因組DNA濃度及純度檢測，使用瓊脂糖凝膠電泳進行基因組DNA完整性檢測。待DNA完全溶解后，以TE緩沖液為空白對照，移取2 μL，使用超微量紫外可見分光光度計檢測其濃度。

1.4 16SrDNA 熒光定量 PCR 擴增和高通量測序

利用2%瓊脂糖凝膠檢測提取的 DNA的質量，并將其送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序，之后基于 Miseq平臺進行數據分析。

1.5 數據分析

真菌ITS選擇ITS1 和ITS2R 作為引物，分別為 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；細菌 16S rRNA 選擇 799F 和 1193R 作為引物，引物序列分別為 5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和 5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′; 利用 Illumina MiSeq 平臺進行測序和分析。

下機數據經過 QIIME（ v1.8.0） 軟件過濾、拼接和去除嵌合體，去除各樣本中reads 尾部質量值在 20 以下的堿基、切除 reads 中含N 部分序列，并去除數據中的短序列（長度閾值200"" bp），隨后再對低復雜度的序列進行過濾。采用Usearch（ v7.1） 軟件進行數據處理，物種比對注釋使用RDP classifier 軟件，保留置信區間大于0.8 的注釋結果。用R語言工具繪制稀釋性曲線，韋恩（Venn）圖，群落結構圖及主坐標分析圖（Principal Co-ordinates Analysis，PcoA）。利用 Mothur 軟件（version v.1.30.2 http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_diversity）進行 Chao1 （估計物種總數）指數、香農指數（Shannon） 、氣旋能量指數（Accumulated cyclone energy， Ace）、辛普森（Simpson）指數、Coverage（覆蓋度）指數計算分析，并在各分類水平上進行群落結構的統計分析，得到微生物群落結構組成。生境內的多樣性指數 （within-habitat diversity，Alpha）可用來反映生物群落的豐富度和多樣性。其中，Ace、Chao1指數可反映生物物種的豐富度，其數值越大表示該樣品物種豐富度越大，其中Ace指數用來估計樣本中物種組成均勻度的指數，Chao1指數用來估計樣本中所含OTU（Operational Taxonomic Units）數目的指數；Shannon、Simpson指數可以反映生物群落的多樣性，其中Shannon指數用來衡量群落的異質性，其數值越大表示群落多樣性越高，Simpson指數代表隨機取樣的2個體屬于不同種的概率，其數值越大表示群落物種分布越均勻；Coverage指數則可以反映生物群落的覆蓋度，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，該指數反映本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況。生境間多樣性 （between-habitat diversity，Beta）分析通過對不同微生物群落間的物種多樣性進行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

通過對穆棱鎮人工林、天然林及葦河鎮人工林健康紅豆杉及感葉斑病紅豆杉針葉6種樣品進行高通量測序數據統計，S1、L1、S2、L2、S3、L3分別得到102 022、107 001、100 624、68 539、61 652和54 618條有效真菌序列及16 090、17 183、 18 905、15 575、15 207和12 316條有效細菌序列，對測序獲得的序列進行隨機抽樣，以抽到的序列數與其所代表的OTU數構建稀釋曲線（圖1）。從圖1-A和圖1-B可以看出，6種針葉內生微生物的稀釋曲線均趨于平坦，表明測序數據能很好地反映各樣品中真菌及細菌的群落結構和多樣性，更多的測序數據對發現新的OTU貢獻率較小。

將測序所得的有效序列按97%的相似度進行OTU的劃分后整理繪制的韋恩圖（圖2）。由表1可知，在6種樣品中檢測到的真菌總OTU為1 276個，其中S1組有376個、L1組有515個、S2組有709個、L2組有689個、S3組有494個及L3組有357個OTU。由圖2-A可知，6組樣品中共有相同的OTU 85個，占 OTU 總數的6.66%，6組樣品中特有的 OTU分別為34、21、26、24、33及22個；在6組樣品中檢測到的細菌總OTU為699個，其中S1組有274個、L1組有251個、S2組有279個、L2組有219個、S3組有211個及L3組有301個OTU。由圖2-B可知，6組樣品中共有相同的OTU 26個，占 OTU 總數的3.72%，6組樣品中特有的 OTU分別為78、39、28、25、6及69個。以上結果表明：葦河鎮感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數增多，細菌OTU數減少；而穆棱鎮天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數減少，細菌OTU數增多。同時，天然林樣品比人工林樣品具有更多的真菌與細菌OTU數，細菌量差距較小。

2.2 感病前后紅豆杉葉片的微生物群落門類組成

在97%的相似度水平對樣品序列進行OTU聚類，由表1可知，6 組紅豆杉針葉微生物多樣性豐富，共鑒定得出真菌7個門，26個綱，78個目，184個科，354個屬，517個種；細菌25個門，55個綱，132個目，217個科，362個屬，530種。

在相似水平為97%的條件下，與Gold database數據庫對比，對所得序列進行聚類分析，圖3所示為感病前后人工林與天然林內生真菌和細菌在門水平上的群落結構特征（物種多度占比大于0.1%的門）。由圖3-A可知，從真菌分類門水平看，人工林和天然林6種樣品檢測出3個相對多度較高的真菌類群，即： 子囊菌門 、擔子菌門及未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）。其中S1 與L1 相比 ，子囊菌門的相對多度由82.89%降至 59.40%，擔子菌門的相對多度由16.73%增至39.90%；S2 與L2 相比 ，子囊菌門的相對多度由46.94%增至82.25%，擔子菌門的相對多度由23.16%降至9.45%，unclassified_k__Fungi的相對多度由29.84%降至8.29%；S3 與L3 相比 ，子囊菌門的相對多度由46.38%增至74.20%，擔子菌門的相對多度由37.32%降至24.21%，unclassified_k__Fungi的相對多度由16.30%降至1.57%。結果表明：在門水平下，不同地區真菌群落結構組成差異較大，葦河鎮人工林感病后子囊菌門的相對多度下降，擔子菌門的相對多度升高；穆棱鎮的人工林及天然林感病后子囊菌門的相對多度升高，擔子菌門的相對多度下降。同一地區天然林與人工林感病前后真菌群落結構組成及變化趨勢基本相同，天然林感病后子囊菌門比人工林上升的更多，擔子菌門比人工林下降的更多。

由圖3-B可知，人工林和天然林6種樣品主要檢測出8個相對多度較高的細菌類群，即： 變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteriota），厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidota），粘球菌門 （Myxococcota），酸桿菌門（Acidobacteriota），浮霉菌門（Planctomycetota），裝甲菌門（Armatimonadota）。其中變形菌門與放線菌門為6種針葉共有的優勢細菌，S1 、L1 、S2 、L2 、S3和L3中變形菌門的相對多度分別為67.17%、 76.05%、52.51%、48.31%、64.82%和20.44%，放線菌門的相對多度分別為8.42%、 11.62%、41.38%、34.99%、23.63%和52.41%。厚壁菌門與擬桿菌門為S1 、L1 、S3和L3共有的優勢細菌，厚壁菌門的相對多度分別為11.35%、1.95%、0.75%和18.67%，擬桿菌門的相對多度分別為10.33%、1.44%、8.10%和3.30%；粘球菌門為L1、S2 、L2 及S3共有的優勢細菌，相對多度分別為6.98%、4.49%、1.10%和1.10%；酸桿菌門只在L1和L2中為優勢細菌，相對多度分別為 1.25%和12.58%；浮霉菌門在L3中為優勢細菌，裝甲菌門在L2中為優勢細菌。在門水平下，不同地區細菌群落結構組成差異較大，葦河鎮人工林感病后變形菌門的相對多度升高，放線菌門的相對多度升高；穆棱鎮人工林及天然林感病后變形菌門的相對多度降低；穆棱鎮天然林感病后放線菌門的相對多度降低，穆棱鎮人工林感病后放線菌門的相對多度升高；葦河鎮人工林及穆棱鎮人工林中擬桿菌門的相對多度下降。

根據物種分類結果，由于樣品中所檢測出的真菌及細菌種類繁多，許多物種含量十分少，因此篩選出優勢物種，并對優勢真菌及優勢細菌進行分類統計并將在兩組樣品中含量均小于1%的物種合并至其他類別。由圖4-A可知， Genolevuria屬、unclassified_f__Taphrinaceae及枝孢霉屬（Cladosporium）為6組共有的優勢真菌；外囊菌屬（Taphrina）、尾孢屬（Cercospora）、亞隔孢殼屬（Didymella）及短梗霉屬（Aureobasidium）為S1 、L1 、S3和L3中共有的優勢真菌，unclassified_f__Trichomeriaceae為S2 、L2 、S3和L3中共有的優勢真菌；盤雙端毛孢屬（Seimatosporium）為L1 、L2和L3中共有的優勢真菌；Retiarius屬為S2和L2中共有的優勢真菌，線黑粉酵母屬（Filobasidium）、unclassified_o__Tremellales為S3和L3中共有的優勢真菌，穴殼屬（Dothiora）為L2和L3中共有的優勢真菌。S1中特有的優勢真菌為副孢霉屬（Paramycosphaerella）、柱隔孢屬（Ramularia）、Mycodiella屬、Arthrocatena屬、膜盤菌屬（Pezoloma）、unclassified_f__Hyaloscyphaceae、小莢孢腔菌屬（Sporormiella）及盤單毛孢屬（Monochaetia），L1特有的優勢真菌為彎梗孢屬（Camptophora）、Claussenomyces屬，S2中特有的優勢真菌為unclassified_o__Chaetothyriales、unclassified_f__Didymellaceae、unclassified_o__Erythrobasidiales，L2中特有的優勢真菌為毛葡孢屬（Bradymyces）、Pectenia屬、unclassified_oCapnodiales、赤霉菌屬（Gibberella）、Capronia屬、Phylliscum屬、unclassified_o__Pleosporales、Udeniomyces屬及Sugitazyma屬，S3中特有的優勢真菌為彎擔菌屬（Curvibasidium）、銀耳屬（Tremella）、鐮孢屬（Fusarium）及帚枝霉屬（Sarocladium），L3中特有的優勢真菌為假蕉孢殼屬（Diatrypella）。結果表明：外囊菌屬、尾孢屬、亞隔孢殼屬及短梗霉屬為人工林特有的優勢真菌；Retiarius屬為天然林特有的優勢真菌；盤雙端毛孢屬為感葉斑病樣品中共有的優勢真菌；穴殼屬為穆棱人工林和天然林感葉斑病樣品中共有的優勢真菌。

由圖4-B可知，6種樣品中的細菌群落結構組成不盡相同，且相對多度的差異也較大。馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）及unclassified_f__Microbacteriaceae為6組共有的優勢細菌；勞爾氏菌屬（Ralstonia）為S1 、L1 、S3和L3中共有的優勢細菌；中村氏菌屬（Nakamurella）、弗萊德門菌屬（Friedmanniella）為S2 、L2 、S3和L3中共有的優勢細菌，泛菌屬（Pantoea）、克雷伯菌屬（Klebsiella）為S1和L1中共有的優勢細菌，從毛單胞菌屬（Comamonas）為S3和L3中共有的優勢細菌，貪噬菌屬（Variovorax）為S1和S2中共有的優勢細菌，動球菌屬（Kineococcus）為S2和S3中共有的優勢細菌，嗜酸菌屬（Acidiphilium）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）為L1和L2中共有的優勢細菌。S1中特有的優勢細菌為擬桿菌屬（Bacteroides）、地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、湖沉積桿菌屬（Limnobacter）、代爾夫特菌屬（Delftia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、大腸埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、噬氫菌屬（Ottowia）、亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）及Clostridium_sensu_stricto_8，S2中特有的優勢細菌為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）、湖沼菌屬（Limnohabitans）、諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Klenkia屬，L2中特有的優勢細菌為Jatrophihabitans屬、unclassified_f__Acidobacteriaceae_Subgroup_1、norank_f__Caulobacteraceae、布氏菌屬（Bryocella）、norank_f__Acetobacteraceae、顆粒菌屬（Granulicella）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、大理石雕菌屬（Marmoricola）、四折疊球菌屬（Quadrisphaera）及放線孢菌屬（Actinomycetospora），S3中特有的優勢細菌為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）及寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），L3中特有的優勢細菌為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、SM1A02、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、裂孢菌屬（Thermobifida）。結果表明：勞爾氏菌屬為紅豆杉人工林特有的優勢細菌；貪噬菌屬為紅豆杉健康樣品中共有的優勢細菌，動球菌屬為穆棱紅豆杉樣品中共有的優勢細菌，嗜酸菌屬、根瘤菌屬為感葉斑病樣品中共有的優勢細菌。

2.3 群落結構多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性 [HT]如表2所示，本研究將相似度為97%的序列劃分為1個 OTU進行多樣性指數計算，并以五個衡量指數詳細列出了6種樣品中微生物的豐富度和多樣性分布情況。所有樣品真菌及細菌的覆蓋度（Coverage）均超過99%，表明真菌及細菌的測序深度已達到較高水平，數據可靠。

感病前后人工林與天然林6種紅豆杉針葉樣品中真菌與細菌群落的 Alpha 多樣性指數部分有差異。6種樣品的真菌群落中S2（穆棱鎮天然林健康樣品）的 Chao1指數最高，即測得OTU數最高，其次分別為 L2、L1、S3、L3、S1；6種樣品的細菌群落中L3的 Chao1指數最高，其次分別為S2、S1、L1、L2、S3。

6種樣品的真菌群落中L2的 Shannon指數最高，即群落多樣性最高，其次分別為S1、S3、S2、L3、L1，6種樣品的細菌群落中L2的 Shannon指數最高，其次分別為S1、S2、S3、L1、L3。6種樣品的真菌與細菌群落中Shannon指數均差異較大，Simpson多樣性指數所表現的多樣性規律與Shannon多樣性指數結果相反。結果表明：穆棱鎮天然林健康樣品的物種豐富度最高，Chao1指數的變化與OTU數的趨勢相同；葦河鎮人工林及穆棱鎮人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌與細菌群落多樣性降低；而穆棱鎮天然林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌與細菌群落多樣性 升高。

2.3.2 Beta多樣性 [HT]主坐標分析（PCoA分析）可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性，此分析以點的形式將多組數據的差異性反映在二維坐標圖上，點與點之間距離的遠近代表樣品中群落的差異程度。由圖5-A可以看出，S1與L1，S3[CM（21]與L3分別在同一區域且S2與L2的距離最短；由圖5-B可以看出，S1與L1，S2與L2，S3與L3分別在同一區域且兩者之間的距離最短。結果表明：感病前后樣品中的真菌、細菌群落結構組成及相對多度都發生了變化；不同地區樣品的微生物群落結構組成差距較大；同地區天然林與人工林的微生物群落結構組成差距較大。

3 討" 論

本研究通過Illumina MiSeq測序平臺，分別對葦河鎮人工林、穆棱鎮天然林及人工林的紅豆杉健康葉和感葉斑病葉片內生微生物的群落結構進行了分析，結果表明：葦河鎮感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數增多，細菌OTU數減少；而穆棱鎮天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數減少，細菌OTU數增多。同時，天然林樣品比人工林樣品具有更多的真菌與細菌OTU數，細菌量差距較小；穆棱鎮天然林樣品相較人工林樣品具有更多的真菌OTU數及較少的細菌OTU數。

通過對6種紅豆杉針葉樣品在門及屬水平上差異的研究發現，門水平下，不同地區真菌及細菌群落結構組成差異較大，葦河鎮人工林感病后子囊菌門的相對多度下降，擔子菌門的相對多度升高；穆棱鎮的人工林和天然林感病后子囊菌門的相對多度升高，擔子菌門的相對多度下降；葦河鎮人工林感病后變形菌門的相對多度升高，放線菌門的相對多度升高；穆棱鎮人工林及天然林感病后變形菌門的相對多度降低；穆棱鎮天然林感病后放線菌門的相對多度降低，穆棱鎮人工林感病后放線菌門的相對多度升高；葦河鎮人工林及穆棱鎮人工林中擬桿菌門的相對多度下降。在屬水平下，外囊菌屬、尾孢屬、亞隔孢殼屬及短梗霉屬為人工林特有的優勢真菌；Retiarius屬為天然林特有的優勢真菌；盤雙端毛孢屬為感葉斑病樣品中共有的優勢真菌；穴殼屬為穆棱感葉斑病樣品中共有的優勢真菌。勞爾氏菌屬為紅豆杉人工林特有的優勢細菌；貪噬菌屬為紅豆杉健康樣品中共有的優勢細菌，動球菌屬為穆棱紅豆杉樣品中共有的優勢細菌，嗜酸菌屬、根瘤菌屬為感葉斑病樣品中共有的優勢細菌。

通過紅豆杉感病樣品中特有的優勢屬推測紅豆杉葉斑病的病原菌。盤雙端毛孢屬（Seimatosporium）為L1 、L2和L3中共有的優勢真菌，穴殼屬（Dothiora）為L2和L3中共有的優勢真菌。Seimatosporium為土壤中的常見菌屬，Dothiora的無性階段為瘍殼孢屬（Dothichiza）^[18]，是引起樹木潰瘍病的主要病原真菌類群之一，而其他植物葉斑病的病原菌多為鏈格孢菌（Alternaria），如商娜等^[19]確定白三葉草葉斑病病原菌為喬木鏈格孢（Alternaria arborescens），楊志英等^[20]確定茶葉斑病病原菌為長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes），劉俏等^[21]確定櫻桃葉斑病病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata），張建強等^[22]確定芹菜葉斑病病原菌為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima），魯海菊等^[23]確定云南萬壽菊葉斑病病原菌為蕓苔生鏈格孢（Alternaria brassicicola）。通過分析發現Dothiora極有可能為紅豆杉葉斑病的病原菌。本研究通過高通量測序分析紅豆杉葉斑病的發生對紅豆杉葉片內生微生物的種類及數量的影響，為紅豆杉葉斑病的發病機制及防控技術提供理論依據。

4 結" 論

紅豆杉葉斑病發生后，感葉斑病病葉與健康葉相比，葦河鎮感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數增多，細菌OTU數減少；而穆棱鎮天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數減少，細菌OTU數增多。天然林比人工林具有更多的真菌與細菌物種且細菌物種數差距較小。

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Endophytic Microbial Diversityin Healthy and Leaf Spot Sensitive Needles of Taxus cuspidata

LIU Zheng and DONG Airong

（College of Forestry， Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

Abstract To investigate the differences of endophytic fungal and bacterial community structure between healthy and spot-sensitive leaves of Taxus cuspidata in planted and natural forests， the needles of ten 15-year old healthy and spot-sensitive Taxus cuspidata were selected for Illumina Miseq high-throughput sequencing and subsequent bioinformatic analysis.The results showed 85 identical fungal operational taxonomic units （OTUs， accounting for 6.66% of the total OTUs） and 26 identical bacterial OTUs （3.72% of the total OTUs） across six groups of Taxus leaves. In the leaf spot of Weihe Town， the number of fungal OTU increased， while the number of bacterial OTU decreased compared with the healthy leaves.However，" in leaf spot of natural forest and planted forest in Muling Tow， the number of fungal OTU decreased， and the number of bacterial OTU increased compared with the healthy leaves.Additionally， the natural forest exhibited a higher number of fungal and bacterial OTUs than those in planted forest samples， respectively， with a marginal difference in bacterial quantity between natural and planted forests.Based on the difference of Taxus conifer samples at phylum and genus level， the composition and change trend of fungal community are similar before and after infection in both natural and planted forests within the same area.

Key words High-throughput sequencing; Taxus cuspidata; Leaf spot; Fungal diversity; Bacterial diversity

Received" 2023-05-30""" Returned 2023-10-04

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No.31670494）.

First author LIU Zheng， female， master student.Research area：forest pathology.E-mail：liuzheng1266@163.com

Corresponding"" author DONG Airong， male， associate professor.Research area：forest pathology. E-mail：darlmy@tom.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

基金項目：國家自然科學基金（31670494）。

第一作者：劉 崢，女，碩士研究生，研究方向為森林病理學。E-mail：liuzheng1266@163.com

通信作者：董愛榮，男，副教授，研究方向為森林病理學。E-mail：darlmy@tom.com