血清miRNAs差異性表達與圍術期應激性心肌病的關系

摘要目的：分析血清微小核糖核酸（miRNAs）差異性表達與圍術期應激性心肌?。≒SC）發生的關系。方法：選取2019年3月—2022年3月非心臟手術心肌損傷病人48例，包括24例出現心肌損傷病人（PSC組）與24例匹配病人（非PSC組）。分別在5個時間點（術前、切皮后2、6 h及術后1、2 d）收集血液樣本，采用實時定量熒光聚合酶鏈反應分析miR-122-5p、miR-150-5、miR-126-3p、miR-21-5p、miR-208-3p表達。結果：術前、切皮后2、6 h及術后1 d，PSC組miR-122-5p表達低于非PSC組；術前、切皮后2 h及術后1 d，PSC組miR-21-5p高于非PSC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。受試者工作特征（ROC）曲線顯示，miR-122-5p、miR-21-5p可預測PSC發生。單變量分析顯示，高miR-122-5p水平病人圍術期PSC風險降低，高miR-21-5p水平病人圍術期PSC風險增加。多變量分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p是病人圍術期PSC的獨立影響因素。結論：術前miR-21-5p、miR-122-5p水平可獨立預測圍術期PSC發生；術前miR-21-5p、miR-122-5p可能基于心臟生物標志物進行術前風險評估。

關鍵詞應激性心肌?。晃⑿『颂呛怂幔粐g期；非心臟手術

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.027

根據非心臟手術后血漿肌鈣蛋白升高的定義，約25%的圍術期病人發生應激性心肌?。╬erioperative stress cardiomyopathy，PSC），且先于非心臟疾病發生［1］。有研究顯示，PSC可能與冠狀動脈疾病的嚴重程度無關［2］。圍術期風險評估的臨床實踐指南提倡使用臨床風險指數進行評估，如修訂的心臟風險指數［3］。心臟風險指數在高風險和血管手術病人中表現出較低的鑒別能力［4］。相關圍術期指南提示，高風險病人測定術前相關生物標志物，可識別心血管疾病嚴重程度被低估的病人。急性冠脈綜合征與心肌組織釋放微小核糖核酸（miRNAs）有關，通常在血漿肌鈣蛋白增加前可檢測到［5］。miRNAs是小的非編碼RNA分子（約23個核苷酸），通過信使RNA的降解和/或抑制信使RNA翻譯進而調節基因表達［5］。miRNAs可調節心肌細胞分化和存活、鈣調節、凋亡、傳導、炎癥和壞死［6］，其與急性心肌梗死和急性冠脈綜合征相關［5］。miRNAs變化可能參與PSC的病理生理。本研究對PSC病人非心臟手術前后血清樣本miRNAs表達進行定量分析，并與對照組比較，旨在確定差異性表達的miRNAs與PSC的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2019年3月—2022年3月非心臟手術心肌損傷病人620例。納入標準：PSC定義為肌鈣蛋白I（TnI）＞99th百分位數（＞0.04 ng/mL）［7］。術后TnI＞99th百分位數的病人與術后TnI≤99th百分位數的病人匹配；按照年齡、性別、修訂的心臟風險指數（RCRI）評分和術后時間進行匹配。排除標準：心肌梗死和/或肺栓塞病人；接受腎臟替代治療的病人及術前TnI升高＞99%的病人。最終納入48例病人，包括24例出現心肌損傷病人（PSC組），24例匹配病人（非PSC組）。所有病人均簽署知情同意書。

1.2血清樣品制備

分別在5個時間點（術前、切皮后2、6 h及術后1、2 d）采集血液樣本。收集全血（10 mL）于普通試管中，室溫下凝結后離心，3 500×重力加速度（g）離心10 min，之后將血清等分到2 mL無RNA試管中，將樣品在－70 ℃下冷凍，分別用于TnI定量和miRNA分析。

1.3miRNA分離

使用miReasy血清/血漿高級試劑盒（丹麥Qiagen公司）從200 μL血清樣本分離miRNA。為了進行質量控制，將1 μL含有UniSp2、UniSp4和UniSp5合成的miRNA摻入混合物（RNA Spike-in kit，丹麥Qiagen公司）加入到每個樣品中，使用RNeasy UCP MiniElute色譜柱分離20 μL RNA，儲存在－20 ℃下用于批量分析。

1.4循環miRNAs

參照相關文獻［8］，選擇多數研究中檢測的5種miRNA（miR-122-5p、miR-150-5、miR-126-3p、miR-21-5p、miR-208-3p）。

1.5定量實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）

使用miRcury LNA RT試劑盒（丹麥Qiagen公司）將2 μL RNA逆轉錄成10 μL的最終反應體積。采用Primus 96 plus熱循環儀（德國MWG生物技術公司），在42 ℃條件下反應60 min，之后在95 ℃下孵育（反應失活）5 min，最后在4 ℃下冷卻。將cDNA儲存在－20 ℃條件下。將cDNA稀釋（1∶40）并添加到主混合物中，之后平鋪在miRNA PCR定制板上，該定制板中含有預先設計的miRCURY LNA miRNA PCR測定，一式3份。使用應用生物系統stepone plus RT-PCR系統（美國Applied Biosystem公司）進行擴增。使用Applied Biosystem StepOneplus軟件中的二階導數方法確定循環量化值。miR-122-5p：正向引物5′-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3′，反向引物5′-AACAUCACCUGUGUGAGU-3′；miR-150-5：正向引物5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反向引物5′-UCACCGACAGGUUGAUGUU-3′；miR-126-3p：正向引物5′-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3′，反向引物5′-CGTGCCAGACATGGACCTAT-3′；miR-21-5p：正向引物5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，反向引物5′-CGGGGTAGGTGAGACGAAG-3′；miR-208-3p：正向引物5′-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3′，反向引物5′-TCAGTTTGCTGCTGTTCTGGGTG-3′；U6：正向引物5′-GGGTTGGCTGGAAAGGA-3′，反向引物5′-AACUAGUAUGUGCACCUG-3′。

1.6統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，不符合正態分布的定量資料以中位數、四分位數［M（P25，P75）］表示，采用t檢驗或非參數Mann-Whitney U檢驗。定性資料以例數、百分比（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。不同時間量化的miRNA表達比較采用重復測量方差分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估術前miR-122-5p、miR-21-5p水平預測PSC的臨床價值，計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）及95%置信區間（confidence interval，CI）。應用基線特征的單變量邏輯回歸模型，計算相應的比值比（odds ratio，OR）。單變量分析中顯示P＜0.1的因素包括在多變量邏輯回歸模型。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組臨床資料比較（見表1）

2.2兩組不同時間循環miRNA表達比較

術前、切皮后2、6 h及術后1 d，PSC組miR-122-5p表達低于非PSC組；術前、切皮后2 h及術后1 d，PSC組miR-21-5p高于非PSC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3術前miR-122-5p、miR-21-5p水平預測PSC的臨床價值

ROC曲線分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p預測PSC有較高的區分度（P＜0.001），詳見圖2。單變量分析顯示，高miR-122-5p水平病人圍術期PSC風險降低，高miR-21-5p水平病人圍術期PSC風險增加；多變量分析顯示，miR-122-5p、miR-21-5p是圍術期PSC的獨立影響因素。詳見表2。

3討論

PSC約占圍術期死亡的33.3%，導致住院時間延長，增加醫療費用［9］。手術、麻醉與高凝狀態、交感神經系統和炎癥的激活有關，這些可能觸發PSC［10］。準確的術前PSC風險評估可告知病人手術的益處和風險，指導手術或麻醉類型，決定術后護理的強度［11］。本研究評估了5種循環miRNAs，確定了miR-122-5p、miR-21-5p預測PSC具有較高的區分度。本研究數據受到樣本量的限制，但定量密切匹配的接受非心臟手術病人樣本中連續獲得的循環miRNA，確保了分析數據的可靠性，接受非心臟手術的病人血清較易檢測到miRNA。使用技術方面質量控制和標準化的可重復取樣方案，分析心臟特異性miRNA的循環在非心臟手術后發生了變化［3］。miRNA表達水平不依賴于肌鈣蛋白的濃度，表明急性冠脈綜合征病人miRNA水平反映了普遍的應激/損傷反應。

由于miRNAs與病理生理學密切相關，具有高度的特異性，miRNAs已成為有研究價值的生物標志物［5］。miRNAs對冠心病、急性冠脈綜合征或急性心肌梗死病人有預后價值［12］。本研究結果顯示，miR-21-5p、miR-122-5p是圍術期PSC的獨立影響因素，可預測PSC發生。有研究顯示，miR-21-5p與疾病嚴重程度相關［13］。Hnninen等［14］研究顯示，miR-21-5p水平升高的病人90 d后死亡風險增加1.8倍。本研究結果顯示，PSC組術前miR-21-5p表達高于非PSC組，且高miR-21-5p水平病人圍術期PSC風險增加5.23倍。因此，miR-21-5p表達變化可能參與多數PSC病人的病理生理過程。雖然miR-21-5p的預后價值在今后的研究中得到證實，與其他miRNAs相比，miR-21-5p幾乎在每個組織中均有表達，是一種非特異性生物標志物［15］。

miR-122通過靶基因調節心血管炎癥、自噬、凋亡、氧化應激、纖維化和功能障礙，對心血管系統產生多種影響，是診斷心血管疾病的生物標志物［16］。有研究表明，miR-122可預測心房顫動發生風險［17］。心房顫動小鼠miR-122水平顯著降低，且高表達miR-122通過調節抗凋亡蛋白（如Bcl-2和Caspase-3）表達參與心肌細胞的增殖和凋亡，表明miR-122水平變化可能預測并涉及PSC的發展［18］。本研究結果顯示，術前，PSC組術前miR-122-5p表達低于非PSC組，且高miR-122-5p水平病人圍術期PSC風險降低。Cortez-Dias等［19］報道了ST段抬高型心肌梗死病人的死亡率和再發急性心肌梗死率較高，取決于miR-122-5p/miR-122-133b比值。miR-122-5p靶基因富集分析表明，miR-122-5p主要調節Toll樣受體信號通路；先天免疫因子在多數心臟疾病中發揮著重要作用，尤其是Toll樣受體，其參與了冠狀動脈疾病的病理生理進展［20］。由于炎癥與PSC的發展密切相關，術前miR-122-5p表達減少可能不利于術后炎癥反應，導致心肌損傷。

綜上所述，術前miR-21-5p、miR-122-5p水平可獨立預測圍術期PSC發生；術前miR-21-5p、miR-122-5p可能基于心臟生物標志物進行術前風險評估。

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（收稿日期：2023-03-17）

（本文編輯薛妮）