反向點雜交技術聯合血常規檢測對β-地貧基因的診斷價值

摘要：目的 "研究反向點雜交（RDB）技術聯合血常規檢測對β-地貧基因的診斷價值。方法 "選取2021年1月-2023年3月我院收治的60例β-地中海貧血患者為研究組，并選取同期在我院體檢的健康人群60名為對照組，均進行血常規和RDB技術檢測。比較兩組人群血常規指標[紅細胞分布寬度（RDW）、紅細胞體積（MCV）、紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞血紅蛋白量（MCH）]，ROC曲線分析不同檢查方法（血常規、RDB、血常規+RDB）診斷β-地貧基因的效能。結果 "研究組RDW大于對照組，MCV、MCHC、MCH低于對照組（P＜0.05）；ROC曲線顯示，血常規+RDB檢查對β-地貧基因檢出率為97.86%，高于血常規、RDB單獨檢測（P＜0.05），而血常規與RDB檢測對β-地貧基因檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 "RDB技術聯合血常規檢測可提高對β-地貧基因的診斷價值，一定程度減小漏診、誤診情況，為臨床診治β-地中海貧血提供更可靠的參考，可作為臨床篩查診斷β-地貧基因的首選方法。

關鍵詞：反向點雜交技術；血常規檢測；β-地貧基因

中圖分類號：R446 " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.21.034

文章編號：1006-1959（2024）21-0146-04

Diagnostic Value of Reverse Dot Blot Combined with Blood Routine Test

for β-thalassemia Gene

LIN Qing，WEN Xiaojing，LAI Youmei，ZHONG Hongwen

（Laboratory Department of Ganxian District People's Hospital，Ganzhou 341100，Jiangxi，China）

Abstract：Objective "To study the diagnostic value of reverse dot blot （RDB） combined with blood routine test for β-thalassemia gene.Methods "A total of 60 patients with β-thalassemia admitted to our hospital from January 2021 to March 2023 were selected as the study group， and 60 healthy people who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The blood routine indexes [red blood cell distribution width （RDW）， red blood cell volume （MCV）， red blood cell hemoglobin concentration （MCHC）， red blood cell hemoglobin （MCH）] were compared between the two groups. ROC curve was used to analyze the efficacy of different examination methods （blood routine， RDB， blood routine+RDB） in the diagnosis of β-thalassemia gene.Results "RDW in the study group was higher than that in the control group， MCV， MCHC and MCH were lower than those in the control group （Plt;0.05）. ROC curve showed that the detection rate of β-thalassemia gene by blood routine+RDB was 97.86%， which was higher than that of blood routine and RDB alone （Plt;0.05）， while there was no significant difference in the detection rate of β-thalassemia gene between blood routine and RDB （Pgt;0.05）.Conclusion "RDB technology combined with blood routine test can improve the diagnostic value of β-thalassemia gene， reduce missed diagnosis and misdiagnosis to a certain extent， provide a more reliable reference for clinical diagnosis and treatment of β-thalassemia， and can be used as the preferred method for clinical screening and diagnosis of β-thalassemia gene.

Key words：Reverse dot blot;Blood routine test;β-thalassemia gene

β-地中海貧血是β鏈合成部分或完全抑制引起的溶血性貧血，主要是以基因突變為主，少部分是基因缺失，地中海貧血患者不同的基因位點突變引起不同的臨床特點，導致地中海貧血的臨床表現不同，從無貧血癥狀到極重度貧血不等，并引起多種并發癥[1，2]。單獨使用血常規檢測對β-地中海貧血檢測會出現一部分的遺漏，并且不能對β-地中海貧血的基因進行分型[3]。反向點雜交（RDB）技術能夠通過位于寡核苷酸探針中部的基因（或序列）特異性堿基與靶序列DNA的堿基配對和嚴格條件下洗膜來達到檢測基因中少數堿基變化（少至單個堿基）的目的[4，5]。基于此，本研究結合2021年1月-2023年3月我院收治的60例β-地中海貧血患者臨床資料，探究RDB技術聯合血常規聯合檢測對β-地貧基因的診斷價值，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 "選取2021年1月-2023年3月贛縣區人民醫院收治的60例β-地中海貧血患者為研究組，并選取同期在我院體檢健康人群60名為對照組。研究組中男22例，女38例；年齡3～49歲，平均年齡（26.39±9.44）歲。對照組男20名，女40名；年齡4～50歲，平均年齡（27.01±10.20）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），臨床可比。所有納入對象均對研究知情，且自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2納入和排除標準 "納入標準：①研究組患者均符合中華醫學會中對β-地中海貧血的診斷標準[6]；②研究組患者均在我院進行治療。排除標準：①心功能不全，肝、腎功能障礙；②排除其他類型地中海貧血者。

1.3方法 "抽取兩組人群空腹肘靜脈血5 ml，放置于-20 ℃環境下保存待用。血常規檢測：使用全自動細胞分析儀（邁瑞6900、邁瑞5390、邁瑞5180）對人群紅細胞情況進行檢測，其中包括紅細胞分布寬度、紅細胞體積、紅細胞血紅蛋白濃度以及紅細胞血紅蛋白量[7]。RDB技術：首先使用柱式分離法提取DNA[8]，在洗滌液W1中加入5.5 ml無水乙醇，打勾標記之后混勻待用，在洗滌液W2加入19 ml無水乙醇，打勾標記混勻待用，往編好號的1.5 ml離心管之內加入500 μl裂解液LB，隨后加入200 μl抗凝全血進行短暫離心；隨后加入100 ul沉淀液PB，充分振蕩混勻，時間不少于20 s，混勻后進行離心（12 000 rpm離心5 min），離心之后在DNA結合柱套進2 ml收集管，小心轉移上清液至結合柱凹縫下方，再次進行離心（12 000 rpm離心30 s），離心后加入500 μl洗滌劑W1，再進行離心，隨后進行兩遍洗滌劑W2洗滌，洗滌完之后小心取下收集管，丟棄濾液之后結合柱重新套入2 ml收集管進行干燥2 min，干燥之后小心取下結合柱，套進干凈的1.5 ml離心管之中，加入150 μl洗脫液EB至膜中心之后室溫放置1 min，放置后再次進行離心洗脫（12000 rpm離心60 s），1.5 ml離心管內液體即為PCR模板，保存備用。取反應管Ⅰ和Ⅱ（內含-PCR Mix-1，23 μl）各1支，管蓋上編號，隨后進行5000 rpm離心2 s，離心之后將2 μl待測DNA加到PCR管內在5000 rpm條件下離心2 s，離心后放置PCR儀器，按照程序進行擴增。擴增之后進行雜交、顯色，首先進行備膜，膜條進行編號，編號之后依次放入15 ml離心管，隨后進行加液，將6 ml左右的A液以及對應編號的PCR產物加入離心管內（兩管產物），沸水浴10 min，沸水浴之后進行雜交，取出離心管之后放入雜交箱內進行雜交（43 ℃下進行1.5～4 h雜交），結束之后進行孵育，將膜條放入孵育液（A液∶POD=2000：1）室內進行孵育30 min，孵育之后將膜條放入A液，進行搖洗2次（5 min/次），搖洗之后進行洗膜，洗膜之后進行顯色，現配顯色液（19 ml C液+1 ml TMB+2 μl 30%H2O2）/10張膜條，實施觀察3～4 min之后進行判讀，使用純凈水或者離子水漂洗兩次后對實驗結果進行判讀，判讀之后在4 ℃環境下保存膜條。

1.4觀察指標 "比較兩組血常規指標[細胞分布寬度（RDW）、紅細胞體積（MCV）、紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞血紅蛋白量（MCH）]，不同檢查方法（血常規、RDB、血常規+RDB）ROC曲線分析診斷效能。

1.5統計學方法 "采用統計軟件包SPSS 24.0版本對本研究的數據進行統計學處理，采用（x±s）表示符合正態分布的計量資料，組間兩兩比較采用t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，采用？字2檢驗，P＜0.05說明差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組血常規指標比較 "研究組RDW大于對照組，MCV、MCHC、MCH均低于對照組（P＜0.05），見表1。

2.2不同檢測方法對β-地貧基因的診斷效能 "依據ROC曲線分析（見圖1），血常規+RDB檢查對β-地貧基因檢出率為97.86%，高于血常規、RDB單獨檢測（P＜0.05），但血常規單獨檢出率（86.34%）與RDB單獨檢出率（88.91%）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

3討論

β-地貧基因是地中海貧血（Thalassemia）中的一種基因類型，它是一種遺傳性溶血性貧血。這種疾病是由于編碼β珠蛋白的基因發生變異引起的[9，10]。在臨床上，帶有α基因、β基因缺陷的地貧患者的癥狀與其拷貝數丟失程度呈正相關，拷貝數丟失越多，癥狀越嚴重，甚至可能導致死亡[11]。β-地貧基因的檢測對于預防和治療地中海貧血具有重要意義[12]。通過檢測β-地貧基因，可以確定個體是否攜帶該基因，以及基因變異的類型和程度，從而為預防和治療該病提供依據[13]。血常規檢測是近年來臨床常用的檢測β-地中海貧血的手段，亦是對血液檢測的一種手段，但是診斷準確性不高，不能對基因進行檢測[14]。因此，臨床提出RDB技術聯合血常規檢測，以提高對β-地貧基因的診斷。但是血常規+RDB聯合檢測的價值尚未完全明確，還需要臨床進一步探究證實[15]。

本研究結果顯示，研究組RDW大于對照組，MCV、MCHC、MCH均低于對照組（P＜0.05），提示β-地貧基因患者以上血常規指標存在異常，與健康人群存在差異，臨床可將以上指標作為鑒別、診斷、篩查該病的指標。分析認為，可能是因為β-地貧基因患者調控珠蛋白生成的基因突變或缺失，引起組成紅細胞的α珠蛋白鏈和β珠蛋白鏈合成比例失衡，從而造成紅細胞壽命縮短，進而造成MCV、MCHC、MCH降低，RDW增大[16，17]。因此，臨床通過定期檢查、監測以上指標，進行β-地貧基因診斷或監測病情進展[18]。同時顯示，依據ROC曲線分析，血常規+RDB檢查對β-地貧基因檢出率高于血常規、RDB單獨檢測（P＜0.05），但血常規單獨檢出率與RDB單獨檢出率基本一致（P＞0.05），提示RDB檢測對β-地貧基因的診斷價值與血常規基本一致，差異無統計學意義（P＞0.05）。但是從本次研究數據觀察，RDB檢出率略高于血常規。同時，血常規+RDB檢查可提高對β-地貧基因的診斷效能，靈敏度提高至為97.86%。因此，臨床對β-地貧基因診斷，建議采用血常規+RDB檢測，以提高診斷的準確性，以降低漏診或誤診率。究其原因，可能是因為血常規+RDB檢查，互相補充，互相促進，可實現對血液和基因的共同檢測，從而提高檢出率，為臨床診斷和治療提供較好的價值[19]。

綜上所述，RDB技術聯合血常規檢測可提高β-地貧基因的診斷準確性和靈敏度，為此類患者提供可靠的診斷和治療依據，值得臨床加以應用。

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收稿日期：2023-12-25；修回日期：2024-01-06

編輯/成森