龍眼花色素苷生物合成相關基因DlCHS9的序列與功能分析

摘""要：查爾酮合成酶（chalcone"synthase，"CHS）是植物類黃酮化合物合成途徑的第一個關鍵酶。前期在龍眼（Dimocarpus"longan"Lour.）中鑒定了與花色素苷合成密切相關的DlCHS9，發現與紅皮龍眼相比，其在石硤龍眼果皮中的表達水平較低。為了進一步探究DlCHS9的生物學功能，本研究分別克隆石硤龍眼DlCHS9-SX和紅皮龍眼DlCHS9-HP基因，氨基酸序列比對分析發現，兩二者僅在第328位氨基酸位點有差異，但該位點并不是關鍵酶活性位點。進一步構建植物表達載體，并采用農桿菌介導的葉盤法將DlCHS9-SX轉入煙草。結果表明，轉基因煙草花瓣更紅，花色素苷含量更高，說明DlCHS9-SX超表達能促進煙草花瓣花色素苷的積累。分析DlCHS9的啟動子序列表明，相似度為96.2%，與DlCHS9-HP的啟動子相比，DlCHS9-SX的啟動子有32個SNP、14個堿基插入和12個堿基刪除，多1個脫落酸響應元件（ABRE），少1個光反應元件（Box4）、1個低溫響應元件（LTR）和1個MYC轉錄因子結合元件。綜上所述，DlCHS9-SX是石硤龍眼花色素苷合成的關鍵結構基因之一，而其啟動子序列與紅皮龍眼差異較大，可能是其在石硤果皮中表達較低的重要原因之一。

關鍵詞：龍眼；DlCHS9；煙草；花色素苷中圖分類號：S667.2""""""文獻標志碼：A

Sequence"and"Function"Analysis"of"DlCHS9"rRelated"to"Anthocyanin"Biosynthesis"in"Longan

LI"Yanhong2，"CAI"Qin2，"SHEN"Wei2，"DU"Lina2，"CHEN"Zhe1，"TAN"Fang2，"LAI"Biao2，"HU"Fuchu*1*

1."Institute"of"Tropical"Fruit"Trees，"Hainan"Academy"of"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Genetic"Resources"Evaluation"and"Utilization"of"Tropical"Fruits"and"Vegetables"（Co-construction"by"Ministry"and"Province"and"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs）"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Fruit"Tree"Biology"of"Hainan"Province"/"Haikou"Scientific"Observation"and"Experimental"Station"for"Tropical"Fruit"Trees，"Ministry"of"Agriculture"andnbsp;Rural"Affairs，"Haikou，"Hainan"571100，"China;"2."School"of"Advanced"Agriculture"and"Bioengineering，"Yangtze"Normal"University，"Chongqing"408100，"China

Abstract："Chalcone"synthase"is"a"crucial"enzyme"in"the"initial"stage"of"the"flavonoid"biosynthetic"pathway."To"explore"the"biological"functions"of"our"previously"identified"chalcone"synthase"coding"gene"DlCHS9"from"longan，"which"is"associated"with"anthocyanin"accumulation，"DlCHS9-SX"and"DlCHS9-HP"from"Shixia"and"Hongpi"longan，"were"cloned"respectively."Amino"acid"sequences"of"DlCHS9-SX"and"DlCHS9-HP"were"compared"and"found"to"differ"only"at"position"328，"which"was"not"a"key"active"site."Subsequently，"an"expression"vector"was"created，"and"the"Agrobacterium-mediated"leaf"disc"method"was"used"to"introduce"DlCHS9-SX"into"wild"tobacco."The"anthocyanin"content"in"the"petals"of"transgenic"tobacco"was"notably"higher"than"that"in"the"wild"type，"suggesting"that"the"DlCHS9-SX"gene"enhances"anthocyanin"accumulation"in"tobacco"petals."The"promoter"sequences"of"the"two"DlCHS9"genes"revealed"a"similarity"of"96.2%."Compared"to"the"promoter"of"DlCHS9-HP，"the"promoter"of"DlCHS9-SX"had"32"SNPs，"14"base"insertions，"and"12"base"deletions."Specifically，"the"DlCHS9-SX"promoter"contained"an"additional"abscisic"acid"responsive"element"（ABRE），"one"fewer"light-responsive"element"（Box4），"one"less"low"temperature-responsive"element"（LTR），"and"one"less"MYC"transcription"factor"binding"site."In"conclusion，"DlCHS9-SX"plays"a"pivotal"role"as"a"structural"gene"in"longan"anthocyanin"biosynthesis."The"differences"in"the"DlCHS9"promoter"in"Shixia"longan"may"contribute"to"its"lower"expression"level.

Keywords："Dimocarpus"longan"Lour;"DlCHS9;"tobacco;"anthocyanin

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.007

果實顏色是決定果實品質和影響商品價值的重要因素之一。豐富多樣的果實顏色深受消費者的喜愛，也是育種者的重要育種目標。花色素苷是果實重要的呈色黃酮類物質。花色素苷生物合成途徑是植物類黃酮代謝途徑的一個分支，是通過多個基因參與的苯丙氨酸途徑。查爾酮合成酶基因（chalcone"synthase，"CHS）是該途徑核心階段的第一個關鍵結構基因，屬于花色素苷生物合成的早期合成基因[1]。在許多物種如蘿卜[2]、鴛鴦茉莉[3]、小蒼蘭[4]等的研究均表明CHS的表達水平與不同組織花色素苷的積累量密切相關。花色素苷生物合成的結構基因受到MYB、bHLH和WD40這三3類轉錄因子的調控[5]。研究表明，光在MYB轉錄因子對CHS基因調控的過程可能發揮了重要作用[6]。

龍眼（Dimocarpus"longan"Lour）是無患子科龍眼屬植物，是中國南方地區重要的經濟果樹作物。我國主栽的龍眼品種果皮通常呈現黃褐色或者黃灰色，色澤單一，限制了果實生物學特征的多樣性和市場潛力。而在東南亞地區有一個果皮呈紅色的紅皮龍眼野生品種，它的發現增加了龍眼果實顏色類型并為龍眼新品種培育提供了候選材料[7]。YiI等[8]研究表明紅皮龍眼果皮的紅色主要因為花色素苷的積累。本研究前期發現龍眼基因組中DlCHS有8個成員，其中DlCHS9的表達水平與紅皮龍眼和石硤龍眼各組織的花色素苷含量呈正相關，且DlCHS9在紅皮龍眼果皮中的表達水平明顯高于石硤龍眼果皮，因此DlCHS9是龍眼花色素苷的生物合成的關鍵基因[9]。為了進一步探究龍眼DlCHS9的生物學功能，本研究以石硤龍眼（SX）和紅皮龍眼（HP）為材料，分析兩者DlCHS9的推測氨基酸序列差異，進一步轉化煙草分析DlCHS9-SX功能，并比較兩二者的啟動子序列。本研究為探明普通龍眼果皮不積累花色素苷的分子機理奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

石硤龍眼、紅皮龍眼葉片樣品采自重慶市涪陵區長江師范學院校內龍眼基地。樣品采集后使用液氮迅速冷凍，并置于–80"℃冰箱保存備用。

1.2""方法

1.2.1""DNA、RNA提取及反轉錄合成cDNA""利用CTAB法提取石硤龍眼、紅皮龍眼和轉基因煙草植株葉片DNA。使用Magen公司的Hipure"Plant"RNA"Mini"Kit試劑盒分別提取石硤龍眼葉片、紅皮龍眼葉片、煙草W38的RNA。采用TaKaRa的SuperScipt"OneStep"RT-PCR"System試劑盒進行RNA反轉錄合成第一1條鏈cDNA。

1.2.2""DlCHS9基因克隆、超表達載體的構建及其啟動子的克隆""根據實驗室前期獲得的轉錄組序列，設計特異引物DlCHS9-F和DlCHS9-R（表1），分別以石硤龍眼葉片的cDNA和泰國紅皮龍眼葉片的cDNA為模板進行特異PCR擴增，然后將得到的片段通過Gibson組裝的方法分別重組到EcoR"Ⅰ和Xhonbsp;Ⅰ線性化的pSAK277載體上，將連接產物分別轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，經菌落PCR初篩，將陽性質粒送至華大基因進行序列測定。

根據龍眼基因組數據庫查找選取DlCHS9基因的上游2000"bp當作啟動子序列，設計特異引物proDlCHS9-F和proDlCHS9-R（表1），分別以石硤龍眼的DNA和紅皮龍眼的DNA為模板進行特異PCR擴增，純化后連接到用KpnⅠ"Ⅰ和XhoⅠ"Ⅰ雙酶切線性化的pGreen-0800-luc載體上。同上述將連接產物分別轉化大腸桿菌而后將篩選陽性質粒送至華大基因進行序列測定。

1.2.3""生物信息學分析""使用Clustal"X軟件進行氨基酸序列的比對分析。利用PlantCARE（https：//"bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線預測網站預測啟動子上的順式作用元件。

1.2.4""植物表達載體構建及煙草遺傳轉化""使用EcoR"Ⅰ和Xho"Ⅰ對質粒pSAK277雙酶切獲得線性化pSAK277載體片段，通過Gibson組裝的方法將PEG純化后的DlCHS9-SX基因重組到線性化的pSAK277載體上獲得超表達載體。利用化學農桿菌感受態轉化方法轉化農桿菌感受態細胞GV3101。利用農桿菌介導的葉盤法轉化野生型煙草[10]。

1.2.5""花色素苷含量測定""利用pH差示法測定煙草花瓣中花色素苷的含量，參照WeiEI等[11]的方法進行測定，具體步驟為：分別取3個生物學重復花瓣樣品于1"mL浸提液（甲醇∶水∶濃鹽酸="85∶12∶3）中，室溫避光充分浸提。取0.1"mL浸提液分別加入2支試管中，分別加入0.4"mL"Buffer"1[（0.2"mol/L"KCl∶0.2"mol/L"HCl（25∶67），pH"1]）和Buffer"2[（1"mol/L"NaAc∶0.4"mol/L"HCI（100∶150），pH"5]），用酶標儀分別測定其在530"nm處的吸光值（OD）。根據公式計算，花色素苷含量（mg/g）=DOD530×5×1×445.2×W/（29"600×W）29600/W/W；式中，5為稀釋倍數，1為提取液體積（mL），445.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，29"600為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數，W為樣品質量（g）。

1.23""數據處理

利用Microsoft"Excel"2016軟件計算W38和DlCHS9-SX轉基因植株花瓣花色素苷含量的平均值及標準誤差。利用Sigmaplot"14.0軟件分別對W38和DlCHS9-SX轉基因植株各株系數據點進行T測試，明確是否存在顯著性差異。

2""結果與分析

2.1""龍眼DlCHS9基因克隆及序列分析

根據前期通過全基因組鑒定到的可能參與龍眼花色素苷生物合成的關鍵DlCHS9的序列設計特異引物[9]，分別以石硤和紅皮龍眼葉片的cDNA為模板進行PCR擴增。測序結果分析發現2個DlCHS9基因的開放閱讀框長度均為1182"bp，編碼了393個氨基酸，分別命名為DlCHS9-SX和DlCHS9-HP，兩二者核苷酸序列相似度高達98.82%，在14個核苷酸位點存在差異。

使用Clustal"X軟件，將DlCHS9-SX和DlCHS9-HP推測氨基酸序列與荔枝（Litchi"chinensis）的LcCHS、非洲菊（Gerbera"hybrida）的GhCHS1和、GhCHS3、玉米（Zea"mays）的ZmC2和ZmWhp、擬南蕎（Arabidopsis"ihaliana）的AtTT4的6個CHS同源基因氨基酸序列進行比對分析，保守位點預測分析方法參照考蔣雅欣等[9]的方法，發現8個CHS均含有4個保守的活性位點氨基酸殘基（紅色方框）、典型的13個惰性活性位點（藍色方框）、CHS的特征序列（WGVLFGFGPGLT）（黃色方框）。而DlCHS9-SX和DlCHS9-HP氨基酸序列僅在328位點上存在差異，DlCHS9-SX的氨基酸為谷氨酸（glutamic"acid，"E），DlCHS9-HP的328位氨基酸為天冬氨酸（aspartic"acid，"D）（綠色方框），而該位點不是關鍵活性位點（圖1），因此，初步推測DlCHS9-SX在該位點氨基酸的差異可能對其基因功能沒有無影響（圖1）。

2.2""DlCHS9-SX超表達載體的構建及煙草遺傳轉化

將利用特異引物擴增得到的DlCHS9-SX基因片段通過Gibson組裝的方法重組到超表達載體pSAK277上，陽性克隆質粒測序分析結果正確，表明超表達載體已成功構建，同時利用SnapGene軟件繪制pSAK277-DlCHS9-SX重組質粒圖譜（圖2）。

紅色框內為聚酮合成酶的4個保守的活性位點；黃色框內為CHS的模式序列（WGVLFGPGLT）；藍色框內為13個塑造活性位點幾何結構的氨基酸殘基；綠色框內為DlCHS9-SX和DlCHS9-HP的氨基酸的差異位點。基因登錄號：荔枝（AtTT4：GU288820.1）、非洲菊（GhCHS1：Z38096.1；GhCHS3：Z38098.1）、擬南芥（AtTT4：，AT5G13930）、玉米（ZmC2：X60205.1；ZmWhp：X60204.1）。

The"four"conserved"active"sites"of"the"polyketide"synthase"are"marked"in"the"red"box;"The"pattern"sequence"（WGVLFGPGLT）"of"CHS"is"highlighted"in"the"yellow"box;"the"amino"acid"residues"that"shape"the"geometry"of"13"the"active"sites"are"highlighted"in"the"blue"box;"The"differences"in"amino"acid"residues"between"DlCHS9-SX"and"DlCHS9-HP"are"highlighted"in"the"green"box."GenBank"register"number："Litchi"chinensis"（AtTT4："GU288820.1），"Gerbera"hybrida"（GhCHS1："Z38096.1;"GhCHS3："Z38098.1），"Arabidopsis"ihaliana"（AtTT4："AT5G13930），"Zea"mays"（ZmC2："X60205.1;"ZmWhp："X60204.1）.

為進一步驗證DlCHS9-SX是否參與龍眼花色素苷生物合成，將重組質粒轉化農桿菌感受態細胞GV3101中，利用農桿菌介導的葉盤法轉化野生型煙草共獲得29株抗性植株，提取轉基因煙草植株葉片DNA并進行目的基因PCR檢測，有陽性植株23株，陽性率為79%。選取3株陽性植株進一步分析。以轉基因煙草花瓣cDNA為模板（重組質粒為陽性對照，野生型煙草為陰性對照，無菌水為空白對照）檢測煙草內參基因（圖3A）和DlCHS9-SX（圖3B）是否表達。結果表明3株轉化植株中的DlCHS9-SX基因在花瓣中成功表達。

2.3""轉基因煙草花瓣表型分析

從圖4A可以看出，轉基因的3個株系煙草花瓣明顯比對照更紅。進一步利用pH差示法測定了野生型W38和轉基因煙草花瓣中花色素苷的含量。結果分析顯示，3個轉基因株系花瓣花色素苷含量均顯著高于野生型。其中10號株系花瓣的花色素苷含量最高（0.074"mg/g），為野生型的4.37倍；3號株系花瓣花色素苷含量為野生型的3.17倍；2237號株系花瓣花色素苷含量為野生型的3.08倍（圖4B）。表明DlCHS9-SX基因在煙草中異源表達促進了花瓣花色素苷的積累。2.4""紅皮龍眼和石硤龍眼DlCHS9基因啟動子分析

進一步分別克隆了石硤DlCHS9-SX的啟動子序列與紅皮龍眼DlCHS9-HP的啟動子序列，比對發現它們的相似度高達96.2%，與DlCHS9-HP的啟動子序列相比，DlCHS9-SX的啟動子有32個SNP、14個堿基插入和12個堿基刪除（圖5）。利用PlantCARE植物啟動子在線預測網站對DlCHS9-SX的啟動子和DlCHS9-HP的啟動子進行分析，結果發現，2條啟動子序列除含有核心啟動子元件（TATA-Box、CAAT-Box）之外，還存在一些其他重要順式作用元件。這些元件的功能包括參與脫落酸響應（ABRE）、光反應（G-box、ACE、GA-motif、Box"4）、脫氧誘導（ARE）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應（CGTCA-motif、TGACG-motif）和種子特異性調控（RY-element）等。與DlCHS9-HP的啟動子相比，DlCHS9-SX的啟動子多1個脫落酸響應的順式作用元件（ABRE）（紫色底紋），缺少1個光照響應（Box"4）（淺綠色底紋）、1個低溫響應（LTR）（綠色底紋）和1個MYC轉錄因子結合位點（藍色底紋）順式元件，但均含有與查爾酮合成酶調控功能相關的順式作用元件，包括MYB轉錄因子結合位點順式元件，MYC轉錄因子結合位點順式元件等（圖5）。推測DlCHS9基因的啟動子序列差異可能是引起石硤DlCHS9表達水平低的原因之一。

3""討論

CHS負責催化3分子的丙二酰-CoA和1分子的對香豆酰-CoA結合形成查爾酮，這該反應是類黃酮合成途徑的關鍵限速步驟[12]。CHS基因在植物中通常以多基因家族的形式存在，但其中只有少數成員與植物花色素苷合成密切相關。非洲菊（Gerbera"hybrida）中GCHS1和GCHS4與花色素苷合成有關，當沉默GCHS1時花瓣變為白色[13]。李文飛等[14]從紅皮香蕉和天寶香蕉中發現了4個差異表達的MaCHS可能是紅皮香蕉花色素苷積累的重要原因。本研究前期從龍眼中鑒定到8個DlCHS家族成員，通過基因表達分析篩選出了與花色素苷合成緊密相關的DlCHS9[9]。本研究發現石硤龍眼DlCHS9-SX和紅皮龍眼DlCHS9-HP的核苷酸相似度達98.82%，僅有14個位點存在差異。王志彬等[15]的研究中也發現CHS在不同種質的柑橘中的核苷酸序列高度保守，相似性達98%以上。而氨基酸序列分析發現兩二者均僅在328位氨基酸位點有差異，且該位點不在關鍵活性位點。有研究發現CHS關鍵位點的差異會導致其功能差異，例如，紫羅蘭（Matthiola"incana）白花突變體是由于CHS其中一個編碼精氨酸的AGG變成了編碼絲氨酸的AGT，從而導致CHS失去生理活性而影響花色素的形成[16]。本研究轉DlCHS9-SX基因煙草的花冠花色素苷含量明顯更高，顏色更紅。可見，石硤和紅皮龍眼中CHS單個氨基酸的差異并沒有未影響其誘導花色素苷的積累的功能。

花色素苷生物合成受到轉錄因子的調控、激素信號（乙烯、赤霉素和脫落酸等）和環境脅迫（光照、溫度、水分及機械損傷等）的影響[17]。作為包含花色素苷在內的類黃酮物質合成的第一個關鍵酶基因，CHS屬于誘導表達型，其在轉錄水平也受到轉錄因子、激素、光等因素的影響[18]。

方框內為DlCHS9啟動子相同順式作用元件；有顏色底紋部分為石峽或紅皮龍眼DlCHS9啟動子單獨含有順式作用元件。

在多種植物的CHS啟動子的研究中發現MYB和MYC（bHLH）轉錄因子可以與CHS啟動子直接結合從而調控其表達[19-21]。本研究DlCHS9-SX和DlCHS9-HP的啟動子順式作用元件均含有MYB轉錄因子結合位點順式元件，MYC轉錄因子結合位點等順式元件，但也存在多個差異的與激素、光、溫度等響應的順式作用元件及轉錄因子結合位點元件，而這些差異可能會引起DlCHS9-SX的表達差異。因此，DlCHS9基因的啟動子序列差異可能是引起石硤和紅皮龍眼果實顏色差異的重要原因之一。

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