超高效液相色譜法測定北沙參中花椒毒素含量

摘" 要：為建立北沙參中花椒毒素含量的測定方法，采用超高效液相色譜，色譜柱為ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm），流動相為50%甲醇乙腈-0.1%磷酸溶液，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長323 nm，進(jìn)樣量為1 μL。在該色譜條件下，在2.005～80.217 μg/mL范圍內(nèi)，北沙參中花椒毒素濃度與峰面積線性關(guān)系良好（R=0.999 8）。方法精密度RSD為0.23%、重復(fù)性RSD為0.87%、穩(wěn)定性RSD為0.91%、加樣回收率在97.0%～105.5%（RSD=2.6%）。該方法快速、準(zhǔn)確、便捷，可應(yīng)用于北沙參中花椒毒素含量的測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜；北沙參；花椒毒素；含量測定；現(xiàn)狀研究

中圖分類號：R282" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2024）24-0074-05

Abstract： To establish a method for the determination of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix. Ultra-performance liquid chromatography was used. The column was ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8μm （2.1×100 mm×1.8 μm）， the mobile phase was 50% methanol acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution， the flow rate was 0.3 mL/min， the column temperature was 30 ℃， the detection wavelength was 323 nm， and the injection volume was 1μL. Under the chromatographic conditions， there was a good linear relationship between the concentration of Zanthoxytoxin and peak area in the range of 2.005～80.217 μg/mL（R=0.999 8）. The method precision RSD was 0.23%， the repeatability RSD was 0.87%， the stability RSD was 0.91%， and the sample addition recovery was between 97.0%～105.5%（RSD=2.6%）. The method is rapid， accurate and convenient， and thereby can be applied to determine the content of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography; Glehniae Radix; Zanthoxytoxin; content determination; current research

北沙參（Glehniae Radix）為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。夏、秋二季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后，除去外皮，干燥，或洗凈直接干燥[1]。2002年，衛(wèi)生部發(fā)布《可用于保健食品的物品名單》，正式將北沙參歸類為藥食同源物品。作為一種滋補(bǔ)養(yǎng)陰的名貴藥材資源，北沙參在我國藥用、食用歷史悠久，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]已有對于沙參功效的記載。北沙參中醫(yī)療效良多，有止痛、祛風(fēng)、養(yǎng)肝[3]、養(yǎng)陰清肺和益胃生津的功效[4]，對肺熱燥咳、虛癆久咳、咽干口渴[5]等癥狀有一定療效。在膳食應(yīng)用方面，民間通常將北沙參用于煲湯、燉煮菜肴、甜湯和涼茶等，是餐桌上深受歡迎的滋補(bǔ)食材。北沙參主要活性成分有香豆素類、有機(jī)酸類、木脂素類[6]等。

花椒毒素屬于呋喃香豆素類化合物，常見于蛇床子、北沙參等藥材中，是一種植物毒素。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，北沙參中花椒毒素等成分具有抗菌[7-8]、抗炎[9]的作用。與此同時，由于呋喃結(jié)構(gòu)的致癌性[10]，2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，花椒毒素（8-甲氧基補(bǔ)骨脂素）伴紫外線A輻射在一類致癌物清單中[11]。

由此可知，北沙參中花椒毒素含量應(yīng)在一定限度內(nèi)才對人體安全，然而，《中華人民共和國藥典》目前對北沙參中花椒毒素的含量檢定并無要求，并未規(guī)范北沙參中花椒毒素的含量限度。為保障臨床藥用、日常膳食可安全應(yīng)用北沙參藥材，建立可準(zhǔn)確、高效、便捷地測定北沙參中花椒毒素含量的測試方法迫在眉睫。現(xiàn)有研究多使用普通高效液相色譜儀，洗脫梯度普遍時間較長，本文采用超高效液相色譜儀，縮短洗脫梯度時長，達(dá)到快速高效的檢測效果。應(yīng)用該檢測方法，本文初步研究了目前市面流通的北沙參中花椒毒素質(zhì)量的市場現(xiàn)狀。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜（沃特世），電子天平（XBR36/XSR204，瑞士梅特勒），超純水機(jī)Comfort I（賽多利斯），數(shù)控超聲波清洗器（安譜），花椒毒素對照品（批號：112077-202101，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（AR，天津大茂），實(shí)驗用水為一級水。

樣品：北沙參藥材及飲片購自市場，其中藥材20份，飲片20份，共40份。經(jīng)鑒定均為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。

1.2" 方法學(xué)驗證

1.2.1" 測定法

1）對照品溶液。花椒毒素對照品儲備溶液：取花椒毒素對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為花椒毒素對照品儲備溶液（1.002 71 mg/mL）。

花椒毒素對照品溶液：精密量取花椒毒素對照品儲備溶液0.20 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為花椒毒素對照品溶液（20.054 μg/mL）。

2）供試品溶液。取本品粗粉（過四號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3）色譜條件。液相色譜柱為ACQUITY UPLC■HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm）。柱溫為30℃。進(jìn)樣體積為1μL。流速為0.3 mL/min。檢測波長為323 nm。流動相A為甲醇-乙腈（1∶1）；B為0.1%磷酸溶液。按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

4）測定法。精密量取供試品溶液與花椒毒素對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算濃度。

1.2.2" 專屬性

分別取空白溶液（75%甲醇）、對照品溶液、供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，比較儀器圖譜的出峰情況。結(jié)果表明，空白溶液圖譜中沒有出現(xiàn)目標(biāo)峰；對照品溶液圖譜中有明顯的目標(biāo)峰，且沒有其他干擾峰；供試品溶液圖譜有明顯目標(biāo)峰，分離度良好，如圖1所示。

1.2.3" 線性和范圍

精密量取花椒毒素對照品儲備溶液0.02、0.10、0.20、0.30、0.40和0.80 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

精密吸取上述溶液注入超高效液相色譜儀中，測定峰面積。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程為y=11 606x+4 772.9，R=0.999 8，線性范圍為2.005～80.217 μg/mL。

1.2.4" 檢測限和定量限

取對照品溶液不斷稀釋，直到S/N=3，信噪比S/N=3時的相應(yīng)質(zhì)量濃度為檢測限，得到檢測限為0.26 μg/mL。取對照品溶液不斷稀釋，直到S/N=10，信噪比S/N=10時的相應(yīng)質(zhì)量濃度為定量限，得到定量限為0.85 μg/mL。

1.2.5" 精密度

取對照品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計算保留時間和峰面積6次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），保留時間RSD為0.06%，峰面積RSD為0.23%，精密度良好。

1.2.6" 重復(fù)性

取同一批北沙參樣品，制備6份供試品溶液，按色譜條件依次進(jìn)樣，得出上述6份供試品溶液的實(shí)測值，計算其結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD為0.87%，重復(fù)性良好。

1.2.7" 加樣回收率

取同一批北沙參樣品粗粉（過四號篩）約2 g，精密稱定9份，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，各精密加入花椒毒素對照品儲備溶液0.20、0.40、0.60 mL，按1.2.1的2）的供試品溶液步驟制備供試品溶液共9份。按色譜條件依次進(jìn)樣，得出上述9份供試品溶液的實(shí)測值，計算其加樣回收率及回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。得到加樣回收率在97.0%～105.5%，平均回收率為101.1%，RSD為2.6%（n=9），加樣回收率良好，準(zhǔn)確度較高。

1.2.8" 穩(wěn)定性

分別制備對照品溶液、供試品溶液于進(jìn)樣小瓶中，在0、6、12、24、36和48 h分別取樣，按色譜條件進(jìn)行分析，分別計算對照品溶液、供試品溶液6次峰面積測量值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），得到RSD為0.91%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

上述方法學(xué)驗證結(jié)果表明，本文的測定方法準(zhǔn)確、簡單、快捷，可以應(yīng)用于北沙參中花椒毒素的含量測定。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 樣品測定

隨機(jī)從市面上現(xiàn)有售賣的北沙參藥材、飲片中各取樣購得20份作為待測樣品，共40份。經(jīng)鑒定全部確認(rèn)為是傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。經(jīng)檢測，所有樣品水分均低于13%，符合《中華人民共和國藥典》2020年版對于藥材及飲片檢定通則要求。

按1.2.1對待測樣品中花椒毒素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

2.2" 結(jié)果分析

從表2結(jié)果可以得出，從市面購得的40批北沙參中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.012 19%，平均含量為0.005 260%，不同批次間北沙參中花椒毒素含量差異較大。其中20批北沙參藥材中花椒毒素含量在0.001 705%～0.012 19%，平均含量為0.006 511 %；20批北沙參飲片中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.009 807%，平均含量為0.004 010%。北沙參藥材中花椒毒素含量總體比飲片高。

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)一步比較北沙參藥材與飲片中的花椒毒素含量。結(jié)果見表3、表4。

從表3可以看出，方差齊性檢驗的顯著性P=0.561，大于顯著水平0.05，可以認(rèn)為樣本數(shù)據(jù)間的方差是齊的，單因素方差分析適用于該批樣本數(shù)據(jù)。

從表4可以看出，組間顯著性P=0.013lt;0.05，說明藥材與飲片中的花椒毒素含量存在顯著差異性。

3" 討論與結(jié)論

從上述結(jié)果可分析得出：市面在售整體北沙參中花椒毒素含量差異較大；藥材與飲片比較，藥材中的花椒毒素含量與飲片存在顯著差異性，這顯示炮制工藝可能會對北沙參中花椒毒素含量有較大影響，推測是由于不同廠家炮制工藝間的差異，導(dǎo)致炮制后的北沙參飲片，與原藥材中的花椒毒素含量存在比較明顯的差異；藥材中花椒毒素平均含量高于飲片，推測是炮制工藝會減少北沙參中花椒毒素的含量。已有資料表明，經(jīng)硫磺熏蒸后北沙參中花椒毒素含量低于未經(jīng)硫磺熏蒸的[12]，不同干燥法對北沙參中花椒毒素含量有不同程度的影響[13]，據(jù)此可以推測北沙參藥材經(jīng)過炮制，其花椒毒素的含量有所減少，且不同炮制工藝對其影響程度不同，造成飲片與藥材的花椒毒素含量差異較大，且飲片總體含量比藥材低。

追溯源頭可知，正是由于北沙參原藥材種植及飲片炮制加工環(huán)節(jié)缺乏相關(guān)法律法規(guī)監(jiān)管，其質(zhì)量控制手段長期缺失，導(dǎo)致市面上流通售賣的北沙參藥材及飲片魚龍混雜，質(zhì)量良莠不齊。

2020年，國家衛(wèi)生健康委等4部門印發(fā)《關(guān)于印發(fā)新冠肺炎出院患者主要功能障礙康復(fù)治療方案的通知》（國衛(wèi)醫(yī)函〔2020〕207號），內(nèi)附推薦處方中北沙參就是其中一味中藥。這表明，作為傳統(tǒng)的滋補(bǔ)藥材，北沙參潤肺止咳等功效得到了傳統(tǒng)中醫(yī)及現(xiàn)代藥理學(xué)的認(rèn)可，應(yīng)用廣泛，在多種情景下均為人們習(xí)慣所用。另一方面，由于花椒毒素天然含有呋喃結(jié)構(gòu)，具有致癌的潛在風(fēng)險。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將呋喃歸為“可能對人類致癌的物質(zhì)”（2B組）[14]。因此，北沙參的使用安全性必須得到重視，建立快捷高效的測試方法測定北沙參中花椒毒素含量作為其質(zhì)量控制手段之一，是急需且有意義的。

本文研究結(jié)果表明，應(yīng)用本文的超高效液相色譜法測定北沙參藥材及飲片中花椒毒素含量的測試方法，加樣回收率、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，整體方法準(zhǔn)確、快速、簡單。采用超高效液相色譜儀搭配超高效液相色譜柱，利用其出峰快速的特性，縮短色譜洗脫梯度，從而減少檢測所需時長，經(jīng)濟(jì)高效，適用于檢驗檢測行業(yè)或機(jī)構(gòu)日常檢驗檢測，為北沙參的廣泛應(yīng)用提供高效便捷而準(zhǔn)確的安全保障。同時，本文的樣本結(jié)果也對北沙參中花椒毒素含量的限度標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考作用，幫助建立北沙參質(zhì)量控制手段及評價標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范中藥產(chǎn)業(yè)北沙參藥材從種植到炮制的一系列環(huán)節(jié)，幫助整頓市面流通的北沙參質(zhì)量參差不一的市場現(xiàn)狀，促進(jìn)北沙參藥材在醫(yī)藥臨床及日常膳食應(yīng)用的發(fā)展。

本文僅初步研究了北沙參花椒毒素含量的市場現(xiàn)狀，下一步可對藥材與飲片炮制工藝具體步驟開展影響花椒毒素含量的研究。

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基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2023YFC3504200）；廣州市科技局-廣州市科技計劃項目（SL2022B03J01258）

第一作者簡介：盧敏茹（1994-），女，助理工程師。研究方向為中藥材、食品質(zhì)量安全分析。

*通信作者：周勁松（1975-），男，博士，高級工程師。研究方向為中藥及制劑分析、中藥炮制。