CXC型趨化因子配體10與12在膽囊癌組織中的表達水平及在腫瘤侵襲中的作用機制

摘要：目的探討CXC型趨化因子配體10（CXCL10）和12在膽囊癌組織中的表達水平及其參與腫瘤侵襲的機制。方法選擇2020年4月—2023年4月在中國人民解放軍中部戰區總醫院手術切除的56例膽囊癌患者腫瘤組織及癌旁組織標本，使用RT-PCR法檢測癌組織及癌旁組織CXCL10 mRNA、CXCL12 mRNA表達，分析患者癌組織中CXCL10 mRNA、CXCL12 mRNA表達與患者臨床病理參數的關系。使用人膽囊癌細胞株GBC-SD，構建CXCL10、CXCL12低表達膽囊癌細胞，CCK-8法檢測CXCL10、CXCL12低表達對膽囊癌細胞株增殖的影響，Transwell檢測CXCL10、CXCL12低表達對膽囊癌細胞株侵襲能力的影響，并采用Western Blot法檢測膽囊癌細胞PI3K/Akt通路表達情況。計量資料兩組間比較采用配對t檢驗或成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果在膽囊癌患者中，癌組織CXCL10、CXCL12 mRNA相對表達量均顯著高于癌旁組織（1.857±0.315 vs 1.024±0.203、2.038±0.374 vs 1.064±0.221，t值分別為16.342、16.778，P值均lt;0.05）。不同TNM分期、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移以及不同腫瘤直徑患者的CXCL10、CXCL12 mRNA比較差異均有統計學意義（P值均lt;0.05）。CXCL10：si-CXCL10組細胞CXCL10 mRNA相對表達量、CXCL10蛋白表達、CCK-8吸光值、細胞遷移數量、p-PI3K及p-Akt蛋白表達均顯著低于對照組和si-RNA組（P值均lt;0.05）；CXCL12：si-CXCL12組細胞CXCL12 mRNA相對表達量、CXCL12蛋白表達、CCK-8吸光值、細胞遷移數量、p-PI3K及p-Akt蛋白表達均顯著低于對照組和si-RNA組（P值均lt;0.05）。結論膽囊癌組織中的CXCL10及CXCL12表達升高，抑制CXCL10、CXCL12表達后，膽囊癌細胞增殖、侵襲受到明顯抑制，其機制可能與抑制PI3K/Akt通路磷酸化有關。

關鍵詞：膽囊腫瘤；趨化因子CXCL10；趨化因子CXCL12；腫瘤浸潤

基金項目：湖北省自然科學基金（2021CFB001）

Expression of CXCL10 and CXCL12 in gallbladder carcinoma and their mechanism of action in tumor invasion

ZHANG Bohuaa，XU Yana，ZHANG Songb，HU Huaa.（a.Department of Pharmacy，b.Department of Gastroenterology，General Hospital of Central Theater Command，Wuhan 430012，China）

Corresponding author：HU Hua，ydiyaya@163.com（ORCID：0009-0000-0904-2694）

Abstract：Objective To investigate the expression levels of CXCL10 and CXCL12 in gallbladder carcinoma and their mechanism of action in tumor invasion.Methods Tumor tissue samples and adjacent tissue samples were collected from 56 patients with gallbladder carcinoma who underwent surgical resection in General Hospital of Central Theater Command from April 2020 to April 2023.RT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of CXCL10 and CXCL12 in cancerous tissue and adjacent tissue，and the correlation of the mRNA expression levels of CXCL10 and CXCL12 in cancerous tissue with clinicopathological parameters was analyzed.The human gallbladder carcinoma cell line GBC-SD was used to construct gallbladder carcinoma cells with low expression of CXCL10 and CXCL12.CCK8 assay was used to observe the effect of low expression of CXCL10 and CXCL12 on the proliferation of gallbladder carcinoma cells，Transwell assay was used to observe the effect of low expression of CXCL10 and CXCL12 on the invasion ability of gallbladder carcinoma cells，and Western blot was used to measure the expression of the PI3K/Akt pathway in gallbladder carcinoma cells.The paired t-test or independent-samples t-test was used for comparison of measurement data between two groups；an analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.Results In the patients with gallbladder carcinoma，the relative mRNA expression levels of CXCL10 and CXCL12 in cancerous tissue were significantly higher than those in adjacent tissue（CXCL10：1.857±0.315 vs 1.024±0.203，t=16.342，Plt;0.05；CXCL12：2.038±0.374 vs 1.064±0.221，t=16.778，Plt;0.05）.There were significant differences in the relative mRNA expression levels of CXCL10 and CXCL12 between the patients with different TNM stages，presence or absence of lymph node metastasis or distant metastasis，and tumor diameters（all Plt;0.05）.Compared with the control group and the si-RNA group，the si-CXCL10 group had significantly lower relative mRNA and protein expression levels of CXCL10 and CXCL12，CCK-8 absorbance values，number of cell migration，and protein expression levels of p-PI3K and p-Akt（all Plt;0.05）.Conclusion There are increases in the expression of CXCL10 and CXCL12 in gallbladder carcinoma tissue，and the proliferation and invasion of gallbladder carcinoma cells are significantly inhibited after inhibition of the expression of CXCL10 and CXCL12，which might be associated with the inhibition of the phosphorylation of the PI3K/Akt pathway.

Key words：Gallbladder Neoplasms；Chemokine CXCL10；Chemokine CXCL12；Neoplasm Invasiveness

Research funding：Hubei Provincial Natural Science Foundation（2021CFB001）

膽囊癌是發生于膽囊系統的一種惡性腫瘤，相關調查研究［1］顯示，其發病率為膽道疾病的0.4%～3.8%。由于膽囊癌患者早期缺乏特異性臨床癥狀，且中晚期患者對各種治療方案的敏感度較低，臨床預后差，術后生存率較低［2］。因此，尋找膽囊癌發生發展的分子機制，發現潛在的新的治療靶點成為膽囊癌規范化診斷以及臨床治療的重點［3］。趨化因子是一類小分子分泌蛋白，具有趨化細胞定向移動的作用，在多種惡性腫瘤中已被證實趨化因子具有調控腫瘤增殖、侵襲以及血管形成等多種作用，在惡性腫瘤發生發展過程中發揮著重要調控作用［4-5］。為了進一步了解CXC型趨化因子配體10（CXCL10）及CXCL12對膽囊癌的調控作用，本研究探討分析CXCL10及CXCL12在膽囊癌組織中的表達水平及腫瘤侵襲的相關機制，現報道如下。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2020年4月—2023年4月在本院手術切除的56例膽囊癌患者腫瘤組織及其癌旁組織標本?；颊呔浥R床病理確診，符合《膽囊癌診斷和治療指南（2015版）》［6］中膽囊癌相關診斷標準。納入標準：（1）患者術前均未行放療或化療；（2）年齡40～80歲；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他原發性惡性腫瘤患者；（2）合并手術禁忌證患者；（3）合并嚴重心、肝、腎、肺等機體重要器官功能障礙患者；（4）合并感染性疾病患者。

1.2細胞及主要材料人膽囊癌細胞株GBC-SD購于中國科學院上海生科院細胞資源中心；TRIzol試劑購于英國Invitrogen公司；引物購于上海生工生物工程股份有限公司；反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；胎牛血清購于英國Invitrogen公司；LipofectamineTM 3000購于美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司。

1.3 RT-PCR法檢測癌組織及癌旁組織CXCL10與CXCL12 mRNA表達采用TRIzol試劑盒提取膽囊癌組織、癌旁組織以及各組膽囊癌細胞中總RNA，測定其濃度及純度，然后使用反轉錄試劑盒合成cDNA。引物序列：CXCL10上游引物，5′-GTGGCATTCAAGGAGTA CCTC-3′；下游引物，5′-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3′。CXCL12上游引物，5′-ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC-3′，下游引物5′-ACTTAGCTTCGGGTCAATGC-3′。GAPDH上游引物，5′-GCAGCCAAAAGGGTCATCACTC，下游引物5′-GAGGGGCCATCCACAGTCT TCT-3′。反應體系：2.0μL cDNA、10.0μL SYBR Premix ExTaqⅡ、上下游引物各4μL，反應條件：95℃預變性30 s，95℃10 s、60℃30 s，共完成40個循環，75℃延伸5 min。以GAPDH作為內參基因，采用2?△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.4細胞培養采用10%胎牛血清的DMEM培養基培養GBC-SD細胞，培養條件為37℃、5%CO2。待細胞融合度達到80%～90%時使用胰酶消化，進行傳代或用于后續實驗。

1.5構建CXCL10、CXCL12低表達膽囊癌細胞參照LipofectamineTM 3000說明書，將CXCL10干擾RNA（si-CXCL10）、CXCL12干擾RNA（si-CXCL12）以及干擾陰性對照（si-RNA）分別轉染至GBC-SD細胞中，將未轉染細胞作為對照。將各組細胞置于37℃、5%CO2孵箱內繼續培養。

1.6 CCK-8法檢測CXCL10、CXCL12低表達對膽囊癌細胞株增殖的影響將上述各組處理后的細胞接種于96孔板內，接種密度為2×103個/孔，每組設置5個復孔。培養48 h后，每孔內加入10μL CCK-8試劑，然后繼續培養2 h后，酶標儀下測定各組細胞450 nm處吸光度值。

1.7 Transwell檢測CXCL10、CXCL12低表達對膽囊癌細胞株遷移能力的影響將上述各組處理后的細胞消化后，采用無血清培養基將細胞密度調整至1×105/mL，將細胞接種于含基質膠的Transwell上室，每孔100μL，然后在下室加入500μL含10%小牛血清的DMEM培養基，繼續在孵箱內培養。培養24 h后取出Transwell小室，使用棉簽將上室未穿膜的細胞擦去，然后使用4%多聚甲醛固定，并進行結晶紫染色，在顯微鏡下觀察侵襲細胞的數量，隨機選取10個視野進行遷移細胞計數。每組重復5次。

1.8 Western Blot檢測各組細胞中PI3K/Akt通路表達將上述各組處理后的細胞消化后收集細胞，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每孔取40μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，電壓120 V，電泳完成后，120 V轉移150 min至PVDF膜，然后使用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗孵育過夜。將孵育后的PVDF膜使用TBST清洗后，加入二抗37℃孵育1.5 h。滴加化學發光劑發光液顯影，在Image J軟件下分析各蛋白灰度值，使用β-actin作為內參蛋白，利用凝膠圖像處理系統分析目標蛋白相對表達量。

1.9統計學方法采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗或成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1一般資料56例膽囊癌患者中男27例，女29例，年齡43～79歲，平均年齡（58.49±10.54）歲。根據TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期患者21例、Ⅲ～Ⅳ期患者35例。

2.2癌組織及癌旁組織CXCL10、CXCL12 mRNA及蛋白的表達在膽囊癌患者中，癌組織CXCL10、CXCL12 mRNA相對表達量均顯著高于癌旁組織（P值均lt;0.05），且癌組織中CXCL10、CXCL12蛋白表達陽性率高于癌旁組織（P值均lt;0.05）（表1，圖1）。

2.3癌組織CXCL10 mRNA、CXCL12 mRNA表達與患者臨床病理參數的關系不同TNM分期、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移及不同腫瘤直徑患者的CXCL10、CXCL12 mRNA比較差異均有統計學意義（P值均lt;0.05）（表2）。

2.4各組細胞mRNA及蛋白的比較CXCL10：si-CXCL10組細胞CXCL10 mRNA相對表達量、CXCL10蛋白表達均顯著低于對照組及si-RNA組（P值均lt;0.05）；CXCL12：si-CXCL12組細胞CXCL12 mRNA相對表達量、CXCL12蛋白表達均顯著低于對照組及si-RNA組（P值均lt;0.05）（表3）。

2.5各組細胞增殖和遷移能力的比較CXCL10：si-CXCL10組細胞CCK-8吸光值與細胞遷移數量均顯著低于對照組和si-RNA組（P值均lt;0.05）；CXCL12：si-CXCL12組細胞CCK-8吸光值與細胞遷移數量均顯著低于對照組和si-RNA組（P值均lt;0.05）（表4，圖2）。

2.6各組細胞PI3K/Akt通路蛋白的比較CXCL10：si-CXCL10組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著低于si-RNA組及對照組（Plt;0.05）；CXCL12：si-CXCL12組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著低于si-RNA組及對照組（Plt;0.05）（表5，圖3）

3討論

膽囊癌患者早期無明顯的特異性癥狀，或患者臨床癥狀與慢性膽囊炎相似，因此臨床有著較高的漏診率和誤診率［7-8］，且膽囊癌患者淋巴結轉移的發生率較高，對周圍正常組織造成侵襲，臨床預后極差，嚴重影響患者生命健康［9-10］。目前研究［11-12］顯示，腫瘤的侵襲轉移不僅取決于腫瘤細胞的生物學特性，同時也依賴于宿主細胞以及細胞外基質之間復雜的相互影響作用。研究［13］表明，在腫瘤的侵襲轉移過程中，趨化因子生物軸發揮著重要作用。CXCL10也被稱為γ干擾素誘導蛋白10，屬于CXC趨化因子家族，具有多種生物學功能，如促進T淋巴細胞黏附到內皮細胞，抑制骨髓集落形成并抑制血管生成，同時與炎癥性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤等多種疾病有關［14］。國外學者研究［15］發現，CXCL12及其受體CXC型趨化因子受體4（CXCR4）所構成的生物軸在乳腺癌細胞轉移中發揮著重要的調控作用，在乳腺癌的原發病灶以及轉移灶組織中，CXCR4表達明顯升高，而在乳腺癌常見轉移灶靶器官，如肝臟、肺、淋巴結、骨髓等組織中配體CXCL12表達較高，腫瘤細胞可沿著趨化因子濃度增加的靶器官進行遷移，從而引發腫瘤細胞的轉移。近年來，越來越多的研究［16-18］發現，趨化因子生物軸在腫瘤細胞及其周圍的間質細胞交互作用中同樣發揮著重要作用。腫瘤相關成纖維細胞與腫瘤相關巨噬細胞均可釋放出多種趨化因子，并特異性結合腫瘤細胞膜上對應的受體，導致細胞內信號通路的激活，從而導致腫瘤細胞的侵襲轉移能力增強［19］。此外，趨化因子可通過與細胞表面的相應受體結合來發揮作用，而這種受體通常位于免疫細胞如淋巴細胞、白細胞、單核細胞以及巨噬細胞的細胞膜上，當趨化因子釋放后，周圍的免疫細胞可被吸引至該區域，從而達到招募免疫細胞的目的［20］。這對于腫瘤發展初期的免疫殺傷作用具有一定的積極意義。

本研究結果顯示，在膽囊癌患者中，癌組織CXCL10、CXCL12 mRNA相對表達量均顯著高于癌旁組織；且膽囊癌患者癌組織CXCL10、CXCL12 mRNA相對表達量與患者TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移以及腫瘤直徑有關。與相關研究［21］報道結果相似，提示在膽囊癌的發生發展過程中，CXCL10及CXCL12均發揮著重要的調控作用。

此外，本研究結果顯示，轉染CXCL10干擾RNA以及CXCL12干擾RNA后，膽囊癌細胞CXCL10、CXCL12 RNA表達被明顯抑制。同時，抑制膽囊癌細胞CXCL10、CXCL12 RNA表達，顯著抑制了細胞增殖、侵襲，進一步驗證了趨化因子對腫瘤細胞增殖、侵襲的調控作用。PI3K/Akt信號通路是G蛋白耦聯受體重要的下游通路，多項研究［22-23］顯示，PI3K/Akt通路是膽囊癌發生發展的關鍵信號通路，對膽囊癌細胞增殖、侵襲以及轉移均具有重要調控作用。本研究結果顯示，抑制CXCL10、CXCL12 RNA表達后，PI3K/Akt通路中關鍵蛋白PI3K、Akt磷酸化被抑制，提示抑制CXCL10和CXCL12對膽囊癌細胞增殖、侵襲的抑制作用可能與抑制PI3K/Akt通路磷酸化過程有關。

綜上所述，膽囊癌組織中CXCL10及CXCL12表達升高，且與膽囊癌發生發展密切相關；抑制CXCL10、CXCL12表達后，膽囊癌細胞增殖、侵襲受到明顯抑制，其機制可能與抑制PI3K/Akt通路磷酸化有關，CXCL10、CXCL12有望成為膽囊癌治療的潛在生物學靶點。

倫理學聲明：本研究方案于2020年3月10日經由中國人民解放軍中部戰區總醫院倫理委員會審批，批號：倫（審）-20200315，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張博華負責論文的選題和設計，參與資料分析、整理文獻和撰寫論文；胡華負責擬定寫作思路，提供指導性意見并最后定稿；徐艷負責論文核修，對學術問題進行解答；張松參與采數據集、分析與解釋。

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收稿日期：2024-02-28；錄用日期：2024-05-10

本文編輯：林姣

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