萊氏綠僵菌與常見化學(xué)農(nóng)藥的相容性研究

摘要：為明確萊氏綠僵菌Nr5772菌株與常見化學(xué)農(nóng)藥的相容性，本研究采用平板法測定了5種殺菌劑（苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈、戊唑醇、嘧菌酯、吡唑醚菌酯）和5種殺蟲劑（吡蟲啉、聯(lián)苯菊酯、啶蟲脒、阿維菌素、毒死蜱）對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響。結(jié)果表明，5種殺菌劑幾乎完全抑制萊氏綠僵菌的生長，相容性極差。殺蟲劑聯(lián)苯菊酯EC50為12 926.61 mg/L，與萊氏綠僵菌的相容性最好；吡蟲啉、阿維菌素、啶蟲脒ECso分別為724.21、264.60、158.49 mg/L，遠(yuǎn)高于田間常規(guī)使用劑量，與萊氏綠僵菌也具有良好的相容性；毒死蜱的EC50為283.38 mg/L，接近其田間常規(guī)使用劑量，對萊氏綠僵菌具有較強(qiáng)的抑制作用。綜上，在本試驗條件下，苯醚甲環(huán)唑等5種殺菌劑完全不能與萊氏綠僵菌混用，聯(lián)苯菊酯、啶蟲脒、阿維菌素和吡蟲啉4種殺蟲劑可與萊氏綠僵菌混用。

關(guān)鍵詞：萊氏綠僵菌；殺蟲劑；殺菌劑；相容性；抑制率

中圖分類號：S476.12 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）10-0148-05

昆蟲病原真菌寄主范圍較廣，對害蟲具有持續(xù)的控制能力，被認(rèn)為是最有潛力的新型生物農(nóng)藥，利用昆蟲病原真菌防治害蟲是生物防治措施的重要組成部分。萊氏綠僵菌（Metarhiziumrileyi）是一種常見的昆蟲病原真菌，寄主范圍廣泛，可以寄生在30多種鱗翅目害蟲上，對草地貪夜蛾等多種常見的農(nóng)林害蟲都具有良好的防治效果，是最具生防潛能的蟲生真菌之一。自20世紀(jì)60年代以來，已有50多種綠僵菌制劑產(chǎn)品獲得注冊登記，然而，同其他生防真菌一樣，受環(huán)境條件多變性和土壤系統(tǒng)復(fù)雜性的影響，綠僵菌防效穩(wěn)定性差，顯效慢，效果不理想，未得到大面積應(yīng)用。

與昆蟲病原真菌相比，化學(xué)農(nóng)藥殺蟲速度快，應(yīng)用廣泛，是防治害蟲最有效的手段，但長期大量使用會造成嚴(yán)重的抗性、殘留、污染等問題，化學(xué)防治越來越不符合生態(tài)化發(fā)展的要求。研究表明，微生物農(nóng)藥與部分化學(xué)藥劑具有很好的相容性，兩者聯(lián)合使用可彌補(bǔ)各自的不足，是一種切實可行且環(huán)境友好的防治策略。

萊氏綠僵菌作為一種優(yōu)良的蟲生真菌，如果能與化學(xué)藥劑混合使用，不但可以大幅度降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，還可以在保證有較高殺蟲速率的前提下，延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生，提高萊氏綠僵菌自身的殺蟲效果，同時擴(kuò)大防治譜，在防治蟲害的同時兼治病害。為明確萊氏綠僵菌是否可以與化學(xué)農(nóng)藥混用，本研究選擇常見的5種殺菌劑和5種殺蟲劑進(jìn)行相容性測定，為下一步與萊氏綠僵菌的復(fù)配增效研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：萊氏綠僵菌Nr5772菌株，由美國佛羅里達(dá)大學(xué)昆蟲病理實驗室提供，并在聊城大學(xué)昆蟲病理實驗室內(nèi)用薩氏麥芽糖酵母瓊脂固體培養(yǎng)基（SMAY）純化培養(yǎng)，-20 ℃冷藏保存。為保證其毒力，實驗前先接種到昆蟲體內(nèi)，然后從僵蟲上分離孢子，純化、復(fù)壯后備用。

殺蟲劑：97. 2%啶蟲脒、97%聯(lián)苯菊酯、98.3%阿維菌素、96.2%吡蟲啉、96%毒死蜱。殺菌劑：97.5%戊唑醇、97%甲基硫菌靈、95.8%苯醚甲環(huán)唑、97%嘧菌酯、98.6%吡唑醚菌酯。供試藥劑均為原藥，由青島瀚生生物科技股份有限公司提供。

SMAY培養(yǎng)基：蛋白胨5g、麥芽糖5g、酵母粉5g、瓊脂6g，蒸餾水定容至500 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試藥劑濃度設(shè)置

在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)查詢試驗農(nóng)藥的田間使用劑量，先進(jìn)行預(yù)實驗，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置合理的濃度梯度，見表1。

1.2.2 孢子懸液和帶藥平板的配制及接種

孢子懸液的配制：取新鮮的萊氏綠僵菌分生孢子，用0.1%吐溫80的無菌水溶液配制濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液待用。

帶藥平板的配制：以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑配制藥劑母液，母液濃度為各藥劑最高濃度的100倍（1%濃度以上對萊氏綠僵菌有抑制作用），取0.3 mL母液，加入到29.7 mL的SMAY培養(yǎng)基中，即為最高試驗濃度，搖勻后倒平板，凝固后待用。將母液梯度稀釋后，用同樣的步驟配制其他濃度的藥劑平板。

接種：用移液器向帶藥平板中加入3滴5 μL的孢懸液，液滴呈三角形排列，以不含藥SMAY培養(yǎng)基平板為對照，每個藥劑濃度重復(fù)3次，將平板置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（25℃，光周期L：D=12 h：12 h）。

1.2.3 萊氏綠僵茵茵落直徑測量及抑制率計算

培養(yǎng)5d后，采用十字交叉法測量各菌落直徑，取每板3個菌落直徑的平均值。分別以第5天和第12天平均菌落直徑作為初始值和最終值，計算抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）／對照組菌落直徑×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel計算抑制率。利用DPS7.05軟件進(jìn)行差異顯著性分析；以藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，對藥劑的抑菌效果進(jìn)行毒力回歸分析：根據(jù)線性毒力回歸方程計算藥劑的半數(shù)效應(yīng)劑量（median effective dose，ECso）及相關(guān)系數(shù)r。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種殺菌劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響

在試驗劑量范圍內(nèi)，萊氏綠僵菌在5種殺菌劑平板中均不能正常生長，與對照組相比差異非常明顯（圖1）。培養(yǎng)第7天時苯醚甲環(huán)唑50mg/L和100 mg/L平板僅出現(xiàn)些許菌膿，更高劑量的帶藥平板只有細(xì)微的菌落痕跡（圖1B），說明該藥劑對萊氏綠僵菌雖然有很強(qiáng)的抑制能力，但依然有少量孢子可以萌發(fā)；甲基硫菌靈、戊唑醇、嘧菌酯和吡唑醚菌酯即使在最低試驗濃度下，平板上也未出現(xiàn)孢子萌發(fā)的痕跡，孢子幾乎不能萌發(fā)。

2.2 5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌的抑制曲線

5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的抑制率隨試驗濃度的提高而提高，不同藥劑的抑制強(qiáng)度不同（圖2）。從抑制曲線來看，在供試劑量范圍內(nèi)，毒死蜱在低劑量時曲線上升增長很快，但隨著濃度的升高，曲線逐漸平緩，毒死蜱50 mg/L（為田間濃度的1/8）時的抑制率為36.27%，在田間濃度（400 mg/L）時的抑制率為55.35%，說明毒死蜱在田間使用時對萊氏綠僵菌具有較強(qiáng)的抑制作用。吡蟲啉、聯(lián)苯菊酯、啶蟲脒和阿維菌素對萊氏綠僵菌的抑制曲線上升趨勢均較平緩，線性關(guān)系不明顯。其中，吡蟲啉在20 mg/L（接近田間濃度25 mg/L）的抑制率為26. 63%，50mg/L（田間濃度的2倍）的抑制率為32.77%，對萊氏綠僵菌的抑制作用較弱；聯(lián)苯菊酯在30 mg/L的抑制率為4.17%，120 mg/L（田間濃度的6倍）的抑制率也僅為26.97%，說明聯(lián)苯菊酯在田間使用時對萊氏綠僵菌幾乎無影響：啶蟲脒在田間濃度（10mg/L）的抑制率為14.16%，80 mg/L的抑制率為35 .27%，說明對萊氏綠僵菌的抑制作用也較弱：阿維菌素在4 mg/L（稍低于田間濃度5 mg/L）的抑制率為16.77%，在32 mg/L（約田間濃度的6倍）的抑制率為31.88%，說明田間使用時對萊氏綠僵菌抑制作用較弱。

2.3 5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌的EC50值

5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌的ECso值影響差異較大（表2），ECso值越大說明抑制作用越弱。聯(lián)苯菊酯的ECso值最高，為12 926.61 mg/L，遠(yuǎn)高于其田間濃度20 mg/L，表明其對萊氏綠僵菌菌絲的抑制作用很弱，兩者表現(xiàn)出良好的相容性：其次為吡蟲啉、阿維菌素、啶蟲脒，ECso分別為724.21、264.60、158.48 mg/L，均遠(yuǎn)高于其田間濃度25、5、10 mg/L。對萊氏綠僵菌的抑制作用很弱，也表現(xiàn)出良好的相容性。表明上述4種藥劑在田間正常使用時均不會對萊氏綠僵菌有明顯的抑制作用，因而可與其混用。毒死蜱的ECso為283.38 mg/L，超過其田間濃度400 mg/L的一半，說明該藥劑在田間劑量下對綠僵菌的生長有較強(qiáng)的抑制效果，因此兩者不能混用。

單純從EC50值來看，5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌的抑制作用由強(qiáng)到弱為啶蟲脒、阿維菌素、毒死蜱、吡蟲啉、聯(lián)苯菊酯；從實際應(yīng)用的角度分析，5種殺蟲劑對萊氏綠僵菌的抑制作用由強(qiáng)到弱為毒死蜱、啶蟲脒、阿維菌素、吡蟲啉、聯(lián)苯菊酯。

3 討論與結(jié)論

近幾年來，昆蟲病原真菌與化學(xué)農(nóng)藥的相容性及其增效作用一直是昆蟲病原真菌開發(fā)研究的重要內(nèi)容，隨著農(nóng)藥減量化觀點(diǎn)的提出，具有安全、低毒、對病原菌高度特異等優(yōu)點(diǎn)的生物化學(xué)協(xié)同防治越來越受大家關(guān)注。以微生物農(nóng)藥、生物化學(xué)農(nóng)藥和植物源農(nóng)藥為主的生物農(nóng)藥，在減少化學(xué)農(nóng)藥使用、保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著積極作用。

真菌制劑在田間應(yīng)用時，會不可避免地與化學(xué)農(nóng)藥接觸。化學(xué)農(nóng)藥也成為影響昆蟲病原真菌在害蟲種群內(nèi)自然流行的重要因素之一。研究表明，化學(xué)藥劑能幫助生防菌克服包括病原菌在內(nèi)的習(xí)居微生物的排斥作用，利于其在土壤中順利定殖生存進(jìn)而成為優(yōu)勢種群，發(fā)揮生物防治作用。

本研究結(jié)果顯示，殺菌劑對萊氏綠僵菌抑制作用非常強(qiáng)，相容性極差：殺蟲劑對萊氏綠僵菌的抑制作用較弱，具有較好的相容性。國內(nèi)外有關(guān)殺蟲劑和殺菌劑對昆蟲病原真菌影響的研究也取得類似結(jié)果，雖藥劑種類不同，但總體上殺蟲劑與昆蟲病原真菌的相容性要好于殺菌劑。分析其原因，殺菌劑作為真菌等病害的防治藥劑，具有特殊的作用機(jī)制，而萊氏綠僵菌也是真菌，同一般真菌有相同或類似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此相容性較差。實際上，田間作物病、蟲、草害通常多樣化，綠僵菌施用到田間可能會遭遇各種殺菌劑、殺蟲劑、除草劑，因此，在田間應(yīng)用時要盡量避免與相容性差的藥劑混用，尤其是殺菌劑。在一定條件下，萊氏綠僵菌可以與聯(lián)苯菊酯等相容性好的殺蟲劑混用，起到一定的增效作用。

本研究僅為室內(nèi)測定結(jié)果，不能代表田間實際應(yīng)用情況，且只測定了化學(xué)藥劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的抑制作用，對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)狀況的作用尚不明確，后期需要進(jìn)一步試驗完善。

基金項目：山東省自然科學(xué)基金項目“萊氏綠僵菌致病過程中的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)機(jī)制”（ZR2020MC127）；聊城大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)